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V. EFECTO DE BIOCONSERVACIÓN DE CARNE MOLIDA DE
CERDO, TIPO HAMBURGUESA CON Lactobacillus acidophilus
cepa ATCC 4356 y Staphylococcus carnosus NRRLO2
Henry Jurado Gámez1, Constanza Montalvo Rodríguez2, Cristina Ramírez Toro3 y Germán
Bolívar4
1,2,3
Escuela de Ingeniería de Alimentos. Universidad del Valle.
4
Departamento de Biología. Universidad del Valle
[email protected], [email protected],
[email protected], [email protected]
RESUMEN
Se evaluó el efecto de bioconservación de hamburguesa de cerdo (HC) con L.
acidophilus ATCC 4356 y S. carnosus NRRLO2. El análisis microbiológico mostró que el
conteo de coliformes totales y fecales alcanzó valores de <3 UFC/g durante un período de
30 días, a temperatura ambiente por la acción inhibitoria de las bacterias lácticas (BAL),
debido a su producción de ácido láctico y otros compuestos inhibidores secretados por los
microorganismos. Se observó que ambas cepas fueron resistentes a pH ácido y que no
hay efecto antagónico entre ellas. Los resultados obtenidos muestran el uso potencial de
este método de conservación como alternativa a la cadena de frío.
Palabras claves: bioconservación, carne molida de cerdo, bacterias lácticas, coliformes
totales, inhibición de bacterias patógenas.
ABSTRACT
The bioconservation effect of pork hamburger with L. acidophilus and S. carnosus was
tested. Microbiological analysis shown that total and fecal coliforms were <3 UFC/g during
a period of time of 30 days at room temperature, by inhibitory action of acid lactic bacteria
because of its acid lactic production and another inhibitory compounds secreted by the
microorganisms. It was found that both bacteria were resistant to acid pH and there isn’t
antagonistic effect between them. The results had shown the potential use of this
conservation method as refrigeration alternative.
Key words: bioconservation, pork hamburger, lactic acid bacteria, total coliforms,
pathogenic bacteria inhibition.
I-
INTRODUCCIÓN
La carne de cerdo por sus
características biológicas y composición
química, es un excelente medio para la
proliferación de gran variedad de
microorganismos que provocan su
descomposición (Haynes, 1993). Este
problema es severo cuando la falta de
refrigeración
o
las
condiciones
inadecuadas de almacenamiento y
transporte
provocan
la
exposición
frecuente del alimento a temperaturas
superiores a los 5 ºC y humedades altas
(Minor Pérez y Guerrero Legarrete,
2003).
La congelación es el método de
conservación por excelencia, ya que
inhibe el desarrollo de microorganismos
deteriorativos y patógenos al retardar las
reacciones bioquímicas y enzimáticas
que se producen en los alimentos a
través del descenso de la temperatura del
alimento y principalmente por la remoción
del agua en forma de hielo (Zaritzky,
2002).
Para incrementar la vida útil de carnes,
en los últimos años han surgido diversas
alternativas a los métodos tradicionales
de conservación. Se han empleado cepas
de bacterias lácticas (BAL) seleccionadas
para conservar carne debido a la
producción de agentes antimicrobianos,
como ácidos orgánicos o a compuestos
como peróxido de hidrógeno, diacetilo,
acetaldehído y bacteriocinas entre otros
(Caplice y Fitzgerald, 1999; Minor-Pérez
H., et al. 2002; Magnusson, 2003), los
cuales inhiben el crecimiento de la flora
patógena y evitan efectos negativos
sobre las propiedades funcionales como
el color, la textura y el sabor.
En el sector alimentario ha habido un
rápido incremento de la demanda de
productos 100% naturales, desde el
punto de vista del consumidor y de las
autoridades. El uso de preservantes
químicos en alimentos es cada vez
menos recomendado debido a los
posibles efectos secundarios producidos
a largo plazo. Por ello surge la necesidad
de utilizar nuevas alternativas que
permitan la elaboración de alimentos
protegidos
naturalmente,
que
den
solución a problemas de este tipo
aportando un mayor beneficio a los
productos y al consumidor. Los alimentos
funcionales han ganado importancia en el
mercado y las BAL juegan un papel
importante en esta tendencia. Los
probióticos
y
prebióticos
pueden
considerarse
como
las
fuerzas
conductoras del mercado de los
alimentos funcionales. El crecimiento
potencial de estos mercados es enorme,
especialmente cuando se consideran las
aplicaciones
al
alimento
como
terapéuticas o alimentos funcionales (De
Vuyst, 2000).
Cultivos de BAL han sido aplicados
directamente con éxito en diferentes
alimentos especialmente en productos
cárnicos, las bacteriocinas combinadas
con lactobacilos han demostrado efecto
antilisteria, que puede ser aprovechado
en cárnicos según Minor et al. (2002) y
Erkkilä (2001), quienes describen la
conservación de la carne fresca de cerdo
mediante fermentación láctica. El uso de
estas BAL constituye una herramienta
importante, ya que ayuda a reducir costos
de producción y procesamiento como los
debidos a la refrigeración y congelación
de la carne y sus diferentes derivados,
mientras
se
mejora
su
calidad
organoléptica y microbiológica al tiempo
que reduce el uso de conservantes y
aditivos artificiales (Erkkilä, 2001). Geisen
et al. (1991) confirman que el crecimiento
de bacterias patógenas puede ser
reducido cuando se aplican cultivos de
BAL en la superficie de los productos
cárnicos
no
fermentados
como
salchichas, carnes cortadas y molidas. El
objetivo de este trabajo fue evaluar el
efecto de bioconservación de HC con
BAL seleccionadas y reconocidas como
aptas para el consumo humano como una
alternativa al uso de la cadena de frío.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizó carne de cerdo molida
condimentada en forma natural sin
aditivos
ni
conservantes
y
BAL
Lactobacillus acidophilus cepa ATCC
4356 y Staphylococcus carnosus cepa
NRRL
O2
reconocidas
como
microorganismos generalmente seguros
(GRAS), facilitadas por el laboratorio de
Biología Marina de la Universidad del
Valle.
2.1 Condiciones experimentales
Caracterización de las BAL. Esta
caracterización fue efectuada con el
propósito de verificar si las cepas
probadas en el estudio, cumplen con las
características deseadas en el proceso
de producción de inóculos y preservación
del producto, siguiendo lo recomendado
por Ramírez et al 2006 y Yimin et al,
1999. Se realizaron pruebas de
resistencia a diferentes valores de pH
(6.0, 4.0, 3.5 y 2.0) de las cepas de BAL
para comprobar su crecimiento al
descender el pH en el medio de cultivo.
Para ello se inocularon en 10 mL de MRS
caldo ajustados a cada valor de pH 1 mL
de cada suspensión de microorganismo,
se tomaron muestras al momento de
inoculación y cada hora hasta 3 h
después de inoculados. Luego se
prepararon diluciones hasta 10-10 según
la metodología de Ramírez (2005) y se
sembraron en caja de Petri desde la
dilución 10-6 hasta la 10-10 en Agar-MRS.
Pruebas de antagonismo. Se realizó
una prueba de antagonismo entre los dos
microorganismos con el fin de evaluar la
posibilidad de utilizarlos en mezcla y
pruebas de inhibición de bacterias
patógenas contra las cepas de BAL
estudiadas, para comprobar que la
bioconservación se produce por inhibición
de microorganismos patógenos. Se
realizaron cuatro repeticiones de cada
prueba de acuerdo a los métodos
descritos por Ramírez (2005) en cada
caso.
Elaboración del inóculo. Se preparó un
preinóculo de cada cepa en caldo MRS
(De Man Rogosa and Sharp, 1960) a
partir de cepas crioconservadas. A partir
del preinóculo se preparó 100 mL de
inóculo según la formulación sugerida por
Ramírez (2005). Tanto para el preinóculo
como para el inóculo se permitió un
crecimiento de 24 h con agitación
constante de 125 rpm, al cabo de las
cuales se verificó la pureza del cultivo
mediante coloración de Gram. Para
obtener HC bioconservadas con BAL se
adicionó 10% v/p de inóculo de cada
bacteria con viabilidad de 109 UFC/mL
permitiéndose la impregnación de las
BAL a la carne durante 24 h a 30 oC, al
cabo de las cuales se retiró el excedente
de líquido, posteriormente se moldeó en
muestras de 120 g y se empacaron al
vacío. Se realizaron cuatro réplicas del
experimento y paralelamente fueron
moldeadas y empacadas muestras sin
inóculo como control. Las hamburguesas
empacadas al vacío se almacenaron a
temperatura de refrigeración y ambiente
evaluándose
sus
características
microbiológicas y fisicoquímicas a la
primera
y
cuarta
semana
de
almacenamiento. La tabla 1, resume los
tratamientos empleados.
Tabla 1. Tratamientos evaluados para la bioconservación de hamburguesa de cerdo.
Temperatura de
Almacenamiento
Control
Sin
inóculo
Staphylococcus
carnosus cepa
NRRLO2
Lactobacillus
acidophilus cepa
ATCC 4356
Ambiente (25 ºC)
M1
M2
M3
Refrigeración (5 ºC)
M4
M5
M6
Cepa
Evaluación
microbiológica.
Se
determinó el Número Más Probable
(NMP) de coliformes totales y fecales, el
recuento de mesófilos aerobios totales
(UFC/g) y recuento de BAL para verificar
el grado de contaminación de la carne
molida y la disminución de ésta luego del
tratamiento con BAL y su evolución
durante el almacenamiento a las
temperaturas en estudio según la
metodología descrita por Ramírez (2005).
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Elaboración y caracterización del
inóculo. Se verificó que los inóculos de S.
carnosus y L. acidophilus tenían una
viabilidad de 1016 y 1013 UFC/mL y
alcanzaron
pH
de
3.6
y
3.7
respectivamente al ser inoculados en la
carne molida de cerdo. Estos valores de
viabilidad son reportados por Raibaud y
Raynaud (1989) como adecuados para el
empleo de estos microorganismos en la
obtención de preparaciones probióticas,
al realizar estudios para la selección de
cepas de Lactobacillus como potenciales
probióticos. Estudios realizados por
Brizuela (2003) y Bolívar (2008) indican
que el análisis de estabilidad del
probiótico a base de bacterias lácticas
arrojaron buenos resultados para el
producto, tanto a temperatura ambiente
como en refrigeración hasta los 30 días
de almacenamiento, manteniendo la
concentración en el orden de 1010
UFC/mL.
Análisis microbiológico. La tabla 2
muestra los promedios de las cuatro
repeticiones efectuadas para el análisis
del NMP. Se observa que el tratamiento
con ambas BAL fue efectivo para la
inhibición de microorganismos patógenos,
mostrando marcadas diferencias con la
muestra control. Esto puede corroborarse
con los resultados de los estudios in vitro
de antagonismo (Tabla 3), en las que se
aprecia inhibición del crecimiento de
bacterias patógenas.
El recuento de mesófilos totales
reportó valores superiores a 107 ufc/mL
en todas las muestras, correspondiendo
con los análisis efectuados para el conteo
de BAL en MRS, lo que sugiere que los
mesófilos presentes corresponden a las
BAL presentes en el inóculo aplicado a
las HC. Esto se comprobó a través de
coloración de Gram. Lo anterior coincide
también con los resultados obtenidos por
Ashenafi, (1991) y Hudault et al., (1997)
quienes encontraron que las bacterias
lácticas presentaron inhibición frente a E.
coli, Salmonella y Listeria. Esta inhibición
según algunos autores se atribuye a la
producción de ácidos orgánicos, entre
ellos el láctico; peróxido de hidrógeno, y
bacteriocinas (Juven et. al, 1992) y
Bolívar (2008).
L. acidophilus ha sido utilizado en la
elaboración de productos cárnicos tipo
salami, con poblaciones de 108 UFC/ g
(Minor-Pérez, et al. 2002). Los mismos
autores reportaron estudios de la
aplicación de Staphylococcus carnosus y
Lactobacillus
alimentarius
en
la
conservación de la carne fresca de cerdo
vía fermentación láctica.
Se presume que el ácido láctico es el
principal responsable de la reducción del
pH en HC y de la acción inhibitoria. Sobel
(1999) plantea que las cepas de
Lactobacillus,
poseen
mayor
potencialidad y son los más utilizados
hasta el momento, ya sea de forma
individual o en combinación con otros
microorganismos para la obtención de
preparaciones
con
propiedades
probióticas, útiles para la conservación de
carnes.
Los resultados mostraron que las BAL
reducen a <3 el NMP de coliformes en el
tiempo cuando son almacenadas a
temperatura ambiente, indicando la
posibilidad de sustituir el uso de la
cadena de frío por éste método de
conservación (Betancourt y Quintero,
2002).
Tabla 2*. Número Más Probable reportado para los análisis de las muestras de
coliformes totales y fecales (NMP/g) a la semana 1 y 4 de aplicación de los
probióticos.
T. Ambiente
Tiempo
1 semana
4 semanas
Cepa
T. Refrigeración
Coliformes
totales
Coliformes
fecales
Coliformes
totales
Coliformes
fecales
Lb. acidophilus
23
4
44
13
S. carnosus
23
4
37
13
Control
210
120
150
89
Lb. acidophilus
<3
0
23
13
S. carnosus
<3
0
21
11
Control
350
210
64
44
*Reporte del promedio de cuatro repeticiones.
Tabla 3. Antagonismo de BAL vs Bacterias Patógenas y entre ellas mismas.
Diámetro Halo de Inhibición (mm)
Bacteria
NRRL O2
ATCC 43576
Escherichia coli
4
4
Klebsiella pneumoneae
4
5
Staphylococcus aureus
6
6
Serratia marcescens
6
5
Proteus vulgaris
7
7
Salmonella thyphimurium
4
5
Shigella spp.
5
5
Pseudomonas aureuginosa
7
6
Vibrio cholerae
4
4
Yersinia enterocolítica
7
8
NRRLO2
-
0
ATCC 4356
0
-
*Los valores reportados corresponden al diámetro del halo de inhibición en mm observado en la
prueba de antagonismo. Se reportó el promedio aritmético de cuatro repeticiones.
Resistencia de las BAL a pH ácidos.
Las tablas 4 y 5 muestran los resultados
de la prueba de resistencia a diferentes
valores de pH. Los resultados indican que
el medio de cultivo se acidifica luego de la
inoculación
del
microorganismo
y
continúa su acidificación en el tiempo y su
viabilidad se mantiene entre 106 y 1011
UFC/mL hasta pH 2,0 para en el caso de
Lb. acidophilus y pH 3,5 para S.
carnosus. De acuerdo con Ramírez
(2005) algunas BAL son capaces de
sobrevivir hasta pH 2,0 y según De
Roissart
(1994)
las
BAL
tienen
crecimiento óptimo a pH 6,5 a 7,0. Los
resultados encontrados indican que los
microorganismos
utilizados
pueden
crecer en medios ácidos, siendo una
característica favorable ya que el proceso
no requeriría control de pH, resultando
económico a nivel industrial.
Pruebas de antagonismo. La prueba
de antagonismo entre las dos BAL mostró
que L. acidophilus no inhibe el
crecimiento de S. carnosus. (Tabla 3).
Esto concuerda con lo reportado por
Betancourt y Quintero (2002), quienes
encontraron que Lb. alimentarius y Lb.
animalis no compiten entre sí y por tanto
los utilizaron en mezcla para bioconservar
cárnicos marinos obteniendo excelentes
resultados. Este resultado habilita la
posibilidad de usar inóculos con mezcla
de ambas cepas para así proporcionar un
mayor radio de acción de los probióticos
en cuanto a inhibición de patógenos y
propiedades organolépticas del producto.
Tabla 4. Resistencia al pH de S. carnosus NRRL 02
pH 6.0
Tiempo
(h)
Cambio
de pH
1
5.46
5 x 10
2
5.39
3
5.285
pH 4.0
Viabilidad
(UFC/g)
pH 3.5
pH 2.0
Cambio
de pH
Viabilidad
(UFC/g)
Cambio
de pH
Viabilidad
(UFC/g)
Cambio
de pH
Viabilidad
(UFC/g)
6
4.215
2 x 10 6
3.75
5 x 10 7
2.785
0
7 x 10
6
4.14
7 x 10 6
3.685
8 x 10 9
2.86
0
2 x 10
8
4.17
9 x 1011
3.79
6 x 1010
2.835
0
Tabla 5. Resistencia al pH de Lb. acidophilus ATCC 4356
pH 6.0
Tiempo
(h)
Cambio
de pH
1
5.595
4 x 10
2
5.5
3
5.425
pH 4.0
Viabilidad
(UFC/g)
pH 3.5
pH 2.0
Cambio
de pH
Viabilidad
(UFC/g)
Cambio
de pH
Viabilidad
(UFC/g)
Cambio
de pH
Viabilidad
(UFC/g)
9
4.365
2 x 10 8
3.905
3 x 10 8
2.545
1 x 10 9
4 x 10
8
4.325
4 x 10 12
3.87
5 x 10 11
2.795
3 x 10 11
3 x 10
10
4.35
2 x 1010
3.89
14 x 1010
2.675
2 x 1010
FIGURA I. ENSAYO DE ANTAGONISMO DE BAL vs. BACTERIAS PATÓGENAS
IV. CONCLUSIONES
Se comprobó que las cepas de BAL
estudiadas
ejercen
efecto
de
bioconservación en HC al disminuir el
conteo inicial de coliformes tras 4
semanas de almacenamiento, mostrando
mayor
efectividad
a
temperatura
ambiente ofreciendo la posibilidad de
sustituir la cadena de frío por este método
de conservación. Este resultado se
corroboró
con
las
pruebas
de
antagonismo realizadas entre BAL y
bacterias patógenas. El ensayo de
antagonismo entre las dos cepas de BAL
estudiadas indica que se pueden usar
ambos microorganismos en mezcla para
lograr
un
mejor
efecto
de
bioconservación.
Como recomendación final, se sugiere
realizar pruebas de aceptación y análisis
sensorial con el fin de evaluar las
propiedades organolépticas del producto.
Así mismo, se propone evaluar el efecto
de inhibición de las BAL contra otras
bacterias patógenas como Listeria
monocytogenes y Clostridium perfringens,
altamente contaminantes de alimentos.
Por último, se recomienda realizar
ensayos de inhibición y bioconservación
con sobrenadantes de BAL neutralizados
para verificar si la inhibición se debe a la
acción de los ácidos orgánicos y otros
componentes o a la acción de biocinas
producidas por las BAL.
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Politécnico
Nacional. Alfaomega Grupo Editor.
México. 131–186.
AGRADECIMIENTOS
Los
autores
manifiestan
sus
agradecimientos a la empresa Cerdos
del Valle S.A. (Cervalle S.A.) por el
soporte económico ofrecido a esta
investigación y a la Escuela de
Ingeniería de Alimentos de la
Universidad del Valle.