Download Análisis topográfico de proliferación celular y diferenciación

Universidad de Sevilla
Facultad de Medicina
Departamento de Citología e
Histología Normal y Patológica
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN
CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Tesis presentada por D. Juan José Fernández Gutiérrez para aspirar al
grado de Doctor, dirigida por los Doctores Dña. Ana María Moreno
Fernández y D. Francisco Rivera Hueto
Sevilla, 2014
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
ÍNDICE
I.
Introducción
3
I.I. Reseña anatomo-funcional del estómago
3
I.II. El cáncer y sus cambios
7
Fases del cáncer
11
Iniciación
11
Promoción
13
Progresión
16
I.III. Clasificación de los tumores gástricos
22
Pólipos gástricos
22
Carcinomas gástricos
23
I.IV. Marcadores biológicos del carcinoma gástrico
31
Factores biológicos
31
Vías de carcinogénesis
32
Factores de crecimiento y receptores de membrana
34
Regulación del ciclo celular. Gen P-53
36
Marcadores de proliferación
37
II.
Planteamiento del tema
40
III.
Material y métodos
43
III.I. Corte y control de las muestras seleccionadas para el estudio
histopatológico convencional
44
III.II. Valoración clínica
45
III.III. Valoración histológica convencional
46
Patrón de crecimiento predominante
46
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Mitosis
46
Ki-67/MIB-1
47
III.IV. Estudio Inmunohistoquímico
48
III.V. Caracterización de la mucosa gástrica no neoplásica
IV.
adyacente.
50
III.VI. Estudio estadístico
50
Resultados
51
IV.I. Mucosa gástrica no neoplásica
51
IV.II. Tejido tumoral
52
Clasificación de células tumorales
52
Clasificación e incidencia de diferenciación
V.
(fenotipo de mucinas)
53
Distribución de células Ki-67 positivas
63
IV.III. Parámetros clínicos
65
IV.IV. Parámetros proliferativos
66
Discusión
71
V.I. Fenotipo de mucinas
71
V. II. Diferenciación proliferativa por compartimentos
Topográficos
77
VI. Conclusiones
82
VII. Bibliografía
83
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I.
INTRODUCCIÓN
I.I. Reseña anatomo-funcional del estómago.
El aparato digestivo está formado por el tracto digestivo (cavidad bucal,
esófago, estómago, intestinos delgados y grueso, recto y conducto anal) y sus
glándulas asociadas (glándulas salivales, hígado y páncreas). Su función es
extraer, a partir de los alimentos ingeridos, las moléculas necesarias para el
mantenimiento, el crecimiento y las demás necesidades energéticas del
organismo. Además la capa más interna del tracto digestivo constituye una
barrera protectora entre el contenido de la luz (medio externo) y el medio
interno del organismo.
El estómago es un órgano que ejerce funciones exocrinas y endocrinas,
digiriendo el alimento y secretando hormonas. Se trata de un segmento
dilatado del tracto digestivo cuyas funciones más relevantes son proseguir con
la digestión de los carbohidratos iniciada en la boca, añadir un líquido ácido al
alimento ingerido, transformar ese bolo alimenticio en una masa viscosa
(quimo) gracias a la actividad muscular y promover la digestión inicial de las
proteínas por medio de la enzima peptidasa. También producen una lipasa
gástrica que digiere triglicéridos con la ayuda de la lipasa lingual. En el
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estómago se identifican cuatro regiones: cardías, fundus, cuerpo y píloro
(Fig.1).
Fig.1.
Anatomía
del
estómago
humano.
(Modificada
de
http://www.efn.uncor.edu/departamentos/divbioeco/anatocom/Biologia/Los%20Sistemas/digesti
vo/Estomago.htm)
Todos los componentes del tracto digestivo presentan determinadas
características estructurales en común. Se trata de un tubo hueco integrado por
una luz, o lumen, cuyo diámetro es variable. Está rodeado por una pared
formada por cuatro capas distintas: mucosa, submucosa, muscular y serosa. La
capa mucosa está compuesta por un revestimiento epitelial que descansa en
una lámina propia de tejido conjuntivo laxo rico en vasos sanguíneos y
linfáticos, terminando en una muscular de la mucosa que la separa de la
siguiente capa. La submucosa está compuesta por tejido conjuntivo con
numerosos vasos sanguíneos y linfáticos, un plexo nervioso submucoso (plexo
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de Meissner), glándulas y tejido linfoide. La capa muscular contiene células
musculares lisas orientadas en espiral y divididas en dos subcapas; la interna
con orientación circular respecto a la luz y la externa con orientación
longitudinal. La serosa es una delgada capa de tejido conjuntivo laxo, rica en
vasos sanguíneos, linfáticos y tejido adiposo, revestida por un epitelio
pavimentoso simple denominado mesotelio (Fig. 2).
Fig. 2
Capas que componen la pared del estómago. (Modificada de
http://www.efn.uncor.edu/departamentos/divbioeco/anatocom/Biologia/Los%20Sistemas/digesti
vo/Estomago.htm)
La mucosa gástrica está tapizada por un epitelio cilíndrico simple con
células mucosas
que experimenta invaginaciones en dirección a la lámina
propia, formando las fosetas gástricas. En ellas desemboca la secreción de las
glándulas tubulares ramificadas características de cada región del estómago.
La lámina propia contiene células musculares lisas y células linfoides y por
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último la muscular de la mucosa. La composición de la mucosa varía en función
de la región del estómago, así se observa:
a) Cardias: es una banda circular estrecha de 1,5-3,0 cm de longitud, en
la transición entre el esófago y el estómago. Su mucosa contiene
glándulas tubulares simples o ramificadas (glándulas del cardias).
Las células secretoras producen moco y lisozima y algunas producen
protones (H+) e iones cloruro (Cl-).
b) Fundus y cuerpo: la lámina propia está repleta de glándulas fúndicas,
de las cuales de tres a siete se abren al fondo de cada foseta
gástrica. Las glándulas poseen tres regiones distintas: istmo, cuello y
base. La distribución celular en las glándulas no es uniforme; el istmo
posee células mucosas en diferenciación que sustituirán a la células
de la foseta y a las superficiales, células madre indiferenciadas y
células oxínticas. El cuello contiene células madre, mucosas del
cuello y oxínticas; la base de las glándulas contiene células
parietales. Las células endocrinas están distribuidas por el cuello y la
base de las glándulas.
c) Píloro: posee fosetas gástricas profundas, a las cuales se abren las
glándulas pilóricas tubulosas simples o ramificadas. Las glándulas
son más cortas y secretan moco y cantidades considerables de
lisozima. Contiene muchas células enteroendocrinas secretoras de
gastrina, intercaladas con células mucosas.
La submucosa está compuesta por tejido conjuntivo denso que contiene
vasos sanguíneos y linfáticos; aparte de observarse las células habitualmente
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presentes en el tejido conjuntivo, la submucosa se encuentra infiltrada por
células linfoides y macrófagos.
La capa muscular está integrada por fibras musculares lisas orientadas
en tres direcciones principales respecto a la luz; la externa es longitudinal, la
media es circular y la interna es oblicua. En el píloro la capa media es mucho
más gruesa para formar el esfínter pilórico.
Por último, el estómago está revestido por una membrana serosa
delgada que se continúa con los órganos y tejidos adyacentes (Junqueira y
Carneiro, 2005).
I.II. El cáncer y sus cambios.
La palabra cáncer se utiliza para describir un complejo y heterogéneo
grupo
de
estados
patológicos
en
el
que
las
células
proliferan
desmesuradamente e invaden tejidos vecinos.
Es una enfermedad de carácter genético, que se produce al ser
eliminadas las restricciones que limitan la división celular en células de tejidos
ya diferenciados; en la mayoría de los casos es una enfermedad adquirida y,
con cierta frecuencia, de carácter irreversible.
El cáncer es una de las enfermedades más extendidas y la más versátil
de cuantas causan una mortalidad elevada en la población mundial. Hay
numerosos estudios que correlacionan la incidencia de determinados
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cáncerescon el estilo de vida, los hábitos, dietas, profesiones, lugar geográfico,
etc.
Esta incidencia aumenta con la edad, indicando que existe un factor
acumulativo de causas que hacen que un único evento no sea suficiente para
desencadenarse la enfermedad.
A nivel celular, como consecuencia de uno o varios cambios en el DNA,
se produce una alteración de carácter permanente que afecta de modo
irreversible las restricciones que normalmente impiden la división celular. El
cáncer constituye el crecimiento descontrolado de un grupo de células dentro
de un tejido, iniciándose así la producción de una masa celular diferenciable del
resto y denominada tumor. Este tumor, en el mejor de los casos, estará
constituido por un conjunto de células “no invasoras” que permanecerán
“encapsuladas” en el lugar anatómico donde se han originado, sin producir
mayor daño en tejidos adyacentes. Cuando el tumor, en este caso, adquiere la
facultad de invasión y dispersión a otros tejidos con la producción de
“metástasis”, será catalogado como maligno. Una metástasis es un tumor
secundario originado por la diseminación de células cancerosas procedentes
de un tumor primario. Las metástasis pueden encontrarse físicamente muy
alejadas del tumor primario, debido al transporte de células tumorales a través
del torrente circulatorio y linfático.
La neoplasia, otra forma de denominar el cáncer, significa literalmente
“nuevas proliferaciones” y éstas pueden iniciarse a partir de células normales
en cualquier tejido sano. Hay, por tanto, una gran variedad de tumores respecto
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al origen y malignidad. La denominación de cáncer se asocia preferentemente
con la presencia de un tumor de carácter maligno (Fig. 3).
A nivel biológico y clínico, la clasificación más importante de los tumores
se encuentra entre tumores benignos y malignos, de los cuales, sólo estos
últimos son considerados como propiamente cánceres. Las diferencias entre
unos y otros (Fig. 3) se resumen a continuación:
•
Los tumores benignos; no necesariamente avanzan hacia la malignidad,
mantienen el parecido con el tejido de origen, no todos los tipos
celulares del tejido han de estar implicados y muchas veces están
separados del tejido normal que los rodea, por una especie de “cápsula”
de tejido conjuntivo. Citológicamente, no se diferencian mucho de
células normales. Los problemas clínicos surgen en muchos casos de
modo indirecto por presión de la masa tumoral en nervios u otros tejidos
cercanos. Ejemplos de tumores benignos son las “verrugas” o los
papilomas. La terapia más extendida en estos casos es la extirpación
quirúrgica y el pronóstico muy bueno.
•
Los
tumores
malignos;
por
el
contrario,
presentan
numerosas
anormalidades citológicas, como variaciones en la forma y tamaño,
aumento de la densidad y tamaño del núcleo celular y mitosis
anormales. Además no se encapsulan sino que destruyen las
membranas basales invadiendo vasos sanguíneos y nódulos linfáticos.
Los tumores primarios son los que se forman en el tejido original y las
metástasis los que derivan de la invasión de células cancerígenas a
otros tejidos (Izquierdo, 1995).
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Fig. 3. Diferencia entre tumor maligno y benigno. (Modificación de
http://contenidos.educarex.es/mci/2006/21/ud3/cancer.htm y National Cancer Institute).
Estas observaciones clínicas se correlacionan perfectamente con los
datos obtenidos en sistemas animales de carcinogénesis experimental, en los
que se definieron las fases de iniciación, promoción y progresión. La figura 4
presenta un resumen de los diferentes estadios y los agentes participantes en
el desarrollo tumoral.
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Figura 4. Estadios y agentes que participan en el desarrollo tumoral.
Fases del cáncer.
Iniciación.
La exposición de las células al agente carcinogénico iniciador no origina
la aparición de células fenotípicamente neoplásicas, sino la adquisición por
parte de ciertas células de la capacidad de ser estimuladas a proliferar en
presencia de estímulos apropiados. Las células iniciadas no se distinguen del
resto de la población celular expuesta al carcinógeno. Solamente su
reexposición al mismo u otro carcinógeno, o a agentes no carcinogénicos
capaces de actuar como promotores tumorales permite su detección a
posteriori como foco de proliferación en expansión. La iniciación es un evento
irreversible que acontece como consecuencia de una única exposición a un
carcinógeno. Siguiendo a Farber y colaboradores (1980), la iniciación podría
definirse como “una alteración en el tejido u órgano diana provocada por la
exposición a un carcinógeno que puede ser inducida a desarrollar focos de
proliferación, uno y más de los cuales pueden actuar como sitio de origen del
proceso maligno ulterior”. El proceso de iniciación incluye dos escalones en sí
mismo, (a) la inducciónde una o más alteraciones bioquímicas o genéticas y,
(b) una fase posterior de proliferación celular.
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La interacción del carcinógeno con las células per se no es suficiente
para iniciar el proceso tumoral en ausencia de un ciclo de proliferación celular.
Sin embargo, no está establecido el mecanismo por el que la proliferación
participa en la iniciación tumoral. Datos obtenidos en el análisis de modelos
animales de cáncer de piel y de hígado parecen indicar que la población de
células iniciadas constituye una subpoblación grande dentro del tejido diana, y
que suelen aparecer como focos con alta capacidad proliferativa dentro de un
compartimento del tejido en que, en ausencia del tratamiento carcinogénico,
abundarían células en proceso de diferenciación terminal (Kawamura y cols.,
1985).
En otros sistemas el fenotipo de células iniciadas se caracteriza por una
mayor resistencia a agentes citotóxicos o una menor dependencia de factores
de crecimiento que las que presentan las células no iniciadas del mismo tejido.
El proceso de iniciación, por tanto, implica la alteración en el patrón de
respuesta celular a estímulos de diferenciación, a factores de crecimiento, o de
resistencia a agentes citotóxicos, proporcionando a la célula iniciada una
ventaja, en términos de proliferación, con respecto a las células normales que
las rodean. Esta propiedad de las células iniciadas ha sido utilizada como base
experimental para sugerir que el desarrollo tumoral no es sino el resultado de
mecanismos celulares de adaptación o protección frente a perturbaciones del
ambiente intra o extracelular (Farber y cols., 1991). Otra propiedad del estado
“iniciado” de las células es su persistencia o carácter irreversible. Por ejemplo,
en modelos de cáncer de piel en ratones es posible aislar focos de células
iniciadas hasta diez semanas después del tratamiento iniciador (Kawamura y
cols., 1985). Se calcula que la frecuencia del evento iniciador en este sistema
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es del orden de 10-5 a 10-6, un rasgo compatible con un mecanismo mutacional
que afecte o bien a un locus grande o, más probablemente, a múltiples loci.
Aunque el análisis de otros sistemas experimentales, como la conversión
maligna de células mamarias de rata in vivo por radiación, sugieren que en el
proceso de iniciación tumoral, también pueden estar implicados mecanismos
no mutagénicos, la elevada frecuencia de aparición del fenotipo “iniciado”
parece ser más consistente con la existencia de múltiples dianas, “hot-spots”
que acumulan mutaciones de manera preferente, o alteraciones genéticas a
nivel cromosómico (Boyd y cols., 1990). La naturaleza genética del proceso de
iniciación se acepta de forma general por especialistas en el campo de
carcinogénesis experimental (Harris, 1991).
Promoción.
Mecánicamente hablando, promoción es la fase en que las células en las
que se indujo el fenotipo iniciado por el tratamiento carcinogénico original
expresan su potencial de proliferación, estableciendo poblaciones celulares
masivas localizadas (nódulos, papilomas, pólipos, etc.) de carácter benigno. De
nuevo, utilizando la definición de Farber y colaboradores (1982), “promoción es
el proceso por el que en un tejido y órgano iniciado se desarrollan focos de
proliferación, uno o más de los cuales puede actuar como precursor de
escalones subsiguientes en el proceso carcinogénico”. Definido de esta manera
el proceso de promoción aparece como un fenómeno biológico cuantificable
mediante el empleo de parámetros como el número, el tamaño y la velocidad
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de aparición de los focos de proliferación celular. La presencia del agente
promotor
proporciona
un
ambiente
que
favorece
la
supervivencia
(inmortalización) y/o la estimulación selectiva de la proliferación de las células
iniciadas en el tejido y órgano dado, respecto a las células normales.
El análisis celular y molecular de varios sistemas experimentales
animales in vitro e in vivo ha indicado que, en general, los promotores
tumorales poseen frecuentemente actividad citostática o citocida sobre las
células normales, mientras que las células iniciadas son resistentes a tales
efectos. En otros casos se ha observado que los promotores tumorales poseen
actividad mitogénica sobre las células del tejido u órgano diana, y que las
células iniciadas son más sensibles a dicha acción que las células normales
dentro del mismo tejido. Estos datos están de acuerdo con los tres mecanismos
propuestos para explicar el carácter selectivo del proceso de promoción
(Farber, 1982). La proliferación de focos de células iniciadas puede ser debida
a que el promotor tumoral causa la inhibición diferencial del crecimiento de las
células normales o la estimulación diferencial de las células iniciadas. También
es posible que, aunque el efecto del promotor sobre células iniciadas y
normales sea el mismo, la proliferación de las primeras resulte de un proceso
de recuperación diferencial después del tratamiento en que las células iniciadas
no retornan al estadio de reposo, o lo hacen más lentamente que las normales.
De un modo u otro, la subpoblación celular seleccionada por la acción del
promotor tumoral presenta una mayor probabilidad de convertirse al estado
maligno durante exposiciones posteriores al mismo u otros agentes
carcinogénicos.
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Muchas de las propiedades del proceso de promoción se han
establecido mediante el estudio del mecanismo de acción de los ésteres de
forbol, y en particular del denominado éster de triforbol (TPA) (Blumberg, 1980,
Diamond y cols., 1980 y Slaga, 1983). En general, el proceso de promoción es
reversible cuando las células se exponen al promotor tumoral una sola vez; y
se requieren varios tratamientos sucesivos para que el proceso de proliferación
focal llegue a hacerse irreversible (Fig. 4). Es precisamente sobre la base de
estas características por lo que se acepta, de forma general, que el mecanismo
de promoción tumoral es de tipo epigenético.
La proteína quinasa C ocupa un papel central en el proceso de
promoción tumoral porque funciona como un receptor no sólo para los ésteres
de forbol, sino también para otros agentes de promoción que no pertenecen a
dicha familia (Castagna y cols., 1982 y Arcoleo y cols., 1985). El hecho de que
la proteína quinasa C es un conocido segundo mensajero que participa en el
modo de acción de varías hormonas, factores de crecimiento y otros estímulos
externos que se transmiten al interior celular a través de receptores de
membrana, sugiere la existencia de un mecanismo molecular común para
varias clases de promotores tumorales. Aparentemente, los dos tipos de
respuesta
celular
al
tratamiento
con
agentes
promotores
tumorales
(modificación de la diferenciación celular y estimulación celular) podrían estar
mediados por la alteración en la expresión de unas y otras de las diversas
formas moleculares de la proteína quinasa C presentes en las células diana.
Aunque es preponderante la evidencia a favor de un mecanismo
epigenético como responsable del proceso de promoción, es importante tener
en cuenta que los promotores tumorales también pueden provocar alteraciones
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genéticas, a pesar de carecer de actividad mutagénica. Los ésteres de forbol
provocan roturas bicatenarias en el DNA, intercambios de material genético
entre cromátidas homólogas, y otras aberraciones cromosómicas. Estas
alteraciones genéticas están mediadas aparentemente por la inducción de la
liberación de radicales de oxígeno en las células diana (Cerutti, 1985). La
inducción de radicales de oxígeno por los ésteres de forbol podría ser
responsable de la producción de alteraciones en expresión genética a nivel de
transcripción. Además, la actividad citotóxica de los radicales de oxígeno
podría colaborar indirectamente en el proceso de promoción tumoral. Las
diferencias a nivel estructural o funcional en los genes susceptibles a la acción
de los promotores tumorales podrían justificar la diversidad de respuesta a
dichos agentes observable en distintos tipos celulares, y en especies
diferentes, en particular por lo que se refiere a la inducción del fenotipo
neoplásico (Colburn, 1987).
Progresión.
La tercera y última fase del desarrollo tumoral comienza cuando, una vez
establecido de forma irreversible el modelo focal de proliferación celular típico
durante en la fase de promoción, uno o más de esos focos preneoplásicos
sufre alteraciones adicionales que resultan en la expresión del fenotipo
maligno. Las células malignas presentan una sucesión temporal de fenotipos
neoplásicos que aparecen paralelamente a la adquisición secuencial de
propiedades más agresivas. Las alteraciones de tipo genético son muy
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importantes en esta fase. Las células presentan una inestabilidad genómica
intrínseca que se manifiesta en alteraciones del número y/o estructura de sus
cromosomas, amplificación genética y cambios a nivel de expresión genética
(Harris, 1991; Nowell, 1976, 1986). Típicamente, las células tumorales en la
fase de progresión son aneuploides. La inestabilidad genética de las células
neoplásicas puede ser debida a las mutaciones adquiridas en las fases
anteriores (Poste y cols., 1981), a errores genéticos hereditarios (Yunis y cols.,
1984) o a factores extracelulares como la exposición a otros carcinógenos
químicos, radiación, factores de crecimiento, hormonas, etc. (Klein y cols.,
1985). Otros factores generales como la edad, sexo, hábitos nutricionales y
estado general de la salud del paciente, e incluso la naturaleza del protocolo de
tratamiento del tumor, pueden afectar la aparición de focos de proliferación más
malignos y el crecimiento tumoral (Poste y cols., 1981 y Nowell, 1986).
La adquisición por las células neoplásicas de la capacidad de invadir el
resto del tejido diana e incluso metastatizarse a otros tejidos u órganos, es la
característica del proceso de progresión tumoral con mayor impacto a nivel
clínico (Slaga, 1983). Por otra parte, durante la progresión tumoral hay un
incremento en la proporción de células en el tumor incipiente que se divide
activamente, aunque mantiene los parámetros típicos de su ciclo celular,
tiempo de generación, etc. En la mayoría de los casos el incremento
consecuente en la velocidad de crecimiento del tumor suele ir acompañado por
un proceso de desdiferenciación celular, una reducción de su capacidad
antigénica, la adquisición de resistencia a agentes quimioterapéuticos, la
expresión de antígenos tumorales y de otras proteínas inadecuadas cualitativa
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o temporalmente para el tipo celular o tejido en que se desarrolla el tumor
(Sager, 1985).
Las células poseen una serie de mecanismos para garantizar, durante la
división celular, la fidelidad en la duplicación de su DNA y su distribución
equitativa entre las células hijas. Los pasos metabólicos que participan en esos
mecanismos, junto a los que intervienen en el control de modificaciones
reguladoras del DNA, desempeñan las “funciones de estabilidad genómica”. Se
ha propuesto
que el incremento en la inestabilidad genómica que ocurre
durante la fase de progresión tumoral es causado por mutaciones en genes
implicados en dichas funciones, o por interferencias exteriores en su
funcionamiento normal (Cheng y cols., 1993). Cada mutación en los genes con
funciones de estabilidad genética actuaría en cascada favoreciendo la
acumulación de nuevas mutaciones y errores metabólicos. Este concepto de
progresión tumoral como la acumulación secuencial de mutaciones en los
genes de estabilidad genómica es consistente con los datos epidemiológicos y
moleculares sobre el desarrollo del cáncer en humanos. Por una parte, la
incidencia de tumores aumenta con la edad y es mayor en personas que sufren
síndromes caracterizados como de inestabilidad cromosómica, y por otra, se ha
demostrado que los tumores humanos contienen múltiples alteraciones
genéticas (Fearon y cols., 1992). Considerando estos datos y teniendo en
cuenta la frecuencia de mutaciones espontáneas en células humanas
(alrededor de 1.5 X 10-10 mutaciones por par de bases del DNA, por división
celular), Loeb (1991) propuso la necesidad de un “fenotipo mutador” como un
requerimiento para el desarrollo multiescalonado de los tumores. De hecho, tal
hipótesis ha sido confirmada recientemente al describirse la existencia de
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genes “mutadores” en tumores humanos (Ionov y cols., 1993, Peltomäki y cols.,
1993 y Thibodeau, 1993).
Entre los procesos celulares implicados en funciones de mantenimiento
de la estabilidad genómica cuya alteración puede favorecer el desarrollo
tumoral habría que incluir mecanismos que garantizan (a) el mantenimiento de
la secuencia del DNA durante su replicación, reparación y recombinación, o el
control del ciclo celular, etc., (b) el mantenimiento de la dotación cromosómica
normal y su apropiada segregación en la división celular, y (c) la programación
epigenética adecuada en lo referente a diferenciación celular y a la respuesta a
cambios ambientales. La alteración de la función de los genes implicados en
misiones de estabilidad genómica puede ser causada y/o resultar en procesos
de (a) amplificación genética, (b) inserción, deleción, sustitución, inversión,
recombinación y translocación cromosómica, (c) pérdida o ganancia en el
número de cromosomas, y (d) alteraciones epigenéticas en el nivel de la
expresión y/o la pérdida de función de determinados genes (Cheng y cols.,
1993).
La probabilidad y el impacto de las alteraciones genéticas que favorecen
la inestabilidad genómica pueden estar condicionados por diversos factores
intrínsecos de las células que constituyen el tumor en desarrollo. Entre estos
factores cabe considerar (a) el tamaño celular, (b) la frecuencia de muerte
celular, (c) la fase de desarrollo tumoral, (d) el estado mitótico del tumor, y (e)
la naturaleza de la alteración genómica misma.
En primer lugar, es obvio que, cuanto menor sea el tamaño de las
células de un tumor, mayor será el número de células necesario para alcanzar
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una determinada masa tumoral; en consecuencia, la probabilidad estadística de
aparición de nuevos errores genéticos es siempre mayor en tumores de células
pequeñas; de hecho, los tumores de células pequeñas tales como los
carcinomas de células pequeñas de pulmón suelen tener peor pronóstico que
los que afectan a células de mayor tamaño. Del mismo modo, los tumores con
alta frecuencia de mutaciones letales o con vascularización limitada tardarán
más tiempo en alcanzar una determinada masa tumoral, y al aumentar la
escala temporal de crecimiento tumoral aumenta también la probabilidad de
acumulación de errores genéticos. Por otra parte, si las alteraciones en los
genes de estabilidad genómica tienen lugar al principio del desarrollo tumoral,
cuando las células poseen su máxima capacidad proliferativa, parece obvio que
tengan mayor impacto que si ocurren en fases tardías del crecimiento
neoplásico, cuando el tumor ha alcanzado, o está próximo a alcanzar, su
tamaño límite; este aspecto se corresponde perfectamente con la dependencia,
mencionada anteriormente, entre la frecuencia de alteraciones en genes de
estabilidad genómica y el estado mitótico del tumor, es decir, la proporción de
células tumorales que se encuentran en fase de división activa en el momento
que ocurren dichas alteraciones genéticas. Por último, la influencia de la
naturaleza de la alteración genética en sí misma se explica en función de la
diferencia significativa que existe entre la frecuencia de mutaciones
espontáneas,
considerada
globalmente
como
resultado
de
diversos
mecanismos moleculares, es del orden de 10-7 por gen (Monnat, 1989 y Oller y
cols., 1989), mientras que la frecuencia de pérdida de información genética
(considerando la pérdida de los dos alelos del mismo gen) es varios órdenes de
magnitud superior (Hakoda y cols., 1990).
20
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
En este sentido es importante considerar que la pérdida de un solo alelo
de los genes de mantenimiento de la estabilidad genómica no tiene efectos
fenotípicos directos, ya que las células mantienen el funcionamiento normal del
otro alelo; sin embargo, cuando la pérdida de información genética es debida a
alteraciones estructurales a nivel cromosómico, pueden predisponer a la
pérdida del segundo alelo del gen afectado. Todos estos factores afectan la
inducción de alteraciones en los genes de estabilidad genómica en un contexto
celular, sub-tumoral y organísmico que, dadas sus características peculiares,
pueden participar en la modulación del proceso de carcinogénesis; propiedades
relacionadas con la capacidad de producción de radicales de oxígeno,
susceptibilidad
constitucional
a
mutágenos
ambientales,
mecanismos
inflamatorios, etc., afectan el desarrollo tumoral. De hecho, se ha demostrado
que las condiciones microambientales (nutrientes, oxígeno, pH, etc.) son
distintas en regiones sub-tumorales diferentes (Sutherland, 1988).
La fase de progresión tumoral, en conjunto, aparece como un proceso
en el que tanto los factores intrínsecos de las células preneoplásicas como los
agentes extrínsecos derivados de los ambientes endógeno y exógeno del
individuo en que el tumor se desarrolla, contribuyen a la acumulación
secuencial de alteraciones en los genes de mantenimiento de la estabilidad
genómica. La aparición del “fenotipo mutador” en las células, contribuye a
iniciar la cascada de alteraciones genómicas que resulta en la expresión por
parte del tumor de propiedades progresivamente más malignas. Es importante
resaltar que la existencia de genes “mutadores” y su contribución a la alteración
de mecanismos de control y mantenimiento de la fidelidad del ciclo celular ha
sido claramente establecida en levaduras (Hartwell y cols., 1991). La
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
identificación y el aislamiento de genes mutadores humanos, y su
caracterización estructural y funcional aparecen como una de las áreas de
investigación que debe proporcionar en un futuro próximo abundante
información sobre los mecanismos de progresión tumoral y, tal vez, sobre las
alternativas moleculares para prevenir o detener el desarrollo carcinogénico
(Izquierdo, 1995).
I.III. Clasificación de los tumores gástricos.
Al igual que en el resto del tracto gastrointestinal, los tumores derivados
de la mucosa predominan sobre los tumores mesenquimales. Los de la mucosa
se clasifican en pólipos y carcinoma.
Pólipos gástricos.
El término pólipo se aplica a cualquier nódulo o masa que se proyecta
por encima del nivel de la mucosa adyacente. Los pólipos gástricos son poco
frecuentes y se encuentran en, aproximadamente, el 0,4% de las autopsias de
adultos, en comparación con los pólipos del colon, que se hallan en el 25 al
50% de las personas de edad avanzada. En el estómago, estas lesiones más
frecuentes son: 1) pólipos hiperplásicos (del 80 al 85%); 2) pólipos de las
glándulas del fundus (~10%) y, 3) pólipos adenomatosos (~5%). Los pólipos
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GÁSTRICO
hiperplásicos y de las glándulas fúngicas son esencialmente inocuos. Sin
embargo, hay un riesgo definitivo de que un pólipo adenomatoso albergue un
adenocarcinoma, y aumenta con el tamaño del pólipo.
Carcinoma gástrico.
Se estimaron casi un millón de nuevos casos de cáncer de estómago en
el año 2012 (952.000 casos, el 6,8% del total), por lo que es el quinto cáncer
más común en el mundo, después del cáncer de pulmón, de mama, colorrectal
y de próstata. Esto representa un cambio sustancial desde las primeras
estimaciones en 1975, cuando el cáncer de estómago fue la neoplasia más
común. Más del 70 % de los casos (677.000 casos) ocurren en países en vías
de desarrollo (456.000 en hombres, 221.000 en las mujeres) y la mitad del total
mundial se produce en Asia oriental (principalmente en China). Las tasas de
incidencia estandarizadas por edad son dos veces más altos en los hombres
como en las mujeres (Fig. 5), que van desde el 3,3 en África Occidental al 35,4
en Asia oriental para los hombres, y de 2,6 en el África occidental hasta el 13,8
en Asia oriental para las mujeres.
El cáncer de estómago es la tercera causa principal de muerte por
cáncer en ambos sexos en todo el mundo (723 000 muertes, 8,8 % del total).
Las tasas de mortalidad más alta estima que están en Asia del Este (24 por
100.000 en hombres, 9,8 por 100.000 en las mujeres), la más baja de América
del Norte (2,8 y 1,5, respectivamente). Las altas tasas de mortalidad también
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GÁSTRICO
están presentes en ambos sexos en Europa Central y Oriental, y en Centro y
Sur América (http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx).
Tasas mundiales estimadas por edad estandarizadas por 100.000
Fig. 5. Incidencia estimada, prevalencia y mortalidad mundial en el año 2012 para el carcinoma
gástrico (http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx).
Desde décadas pasadas se han propuesto varias clasificaciones de
cáncer gástrico como la clasificación de WHO (Jass y col., 1990), Ming (1977),
Mulligan (1972), Laurén (1965) y la última por Goseki y col. en 1992. Algunas
de estas clasificaciones se refieren sólo a características clínicas y
endoscópicas de estos tumores, otras sólo a patrones histológicos.
Actualmente la clasificación más útil es la presentada por Laurén en 1965,
revisada por Borchard (1990) y Songun y col. en 1999. Esta clasificación tiene
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GÁSTRICO
como ventaja que sólo con la revisión de la morfología microscópica, se
pueden distinguir las dos principales patogenias cancerígenas que parecen
claramente diferentes en su clínica y epidemiología que son el adenocarcinoma
gástrico de tipo difuso (ACGD) y el intestinal (ICGD) (Siurala y col., 1981).
La clasificación de adenocarcinoma gástrico en los subtipos difuso e
intestinal se compara rutinariamente con otras clasificaciones usualmente
comunes. Las similitudes entre la clasificación de Laurén (1965) y la de WHO
(Jass y col., 1990) se muestran en la tabla 1. Los tipos diferenciados de la
clasificación de la Asociación del Cáncer Gástrico Japonesa (1995)
normalmente corresponden al tipo intestinal en la clasificación de Laurén
(1965) y los de tipo difuso corresponden a los tipos pobremente diferenciados y
los de “células en anillo de sello” en la clasificación japonesa (1995).
WHO
Laurén
Papilar
Intestinal
Tubular
Mucinoso
Pobremente diferenciado
Sin clasificar
Células en “anillo de sello”
Difuso
Tabla 1. Esquema con las relaciones entre las clasificaciones de WHO (Jass y col., 1990) y
Laurén (1965) (Vauhkonen, 2006).
El cáncer gástrico es esencialmente una enfermedad heterogénea. Se
compone de al menos dos enfermedades diferentes (Tabla 2) con distinta
epidemiología, etiología, patogénesis, parámetros biológicos e incluso a veces,
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
clínicos (Yao y col. 2006). Estas enfermedades presentan dos tipos
morfológicos e histológicos, denominados intestinal y difuso (Lauren, 1965). Se
piensa que el tipo intestinal deriva de las células de la mucosa gástrica que han
sufrido una metaplasia intestinal en el contexto de gastritis crónica. Este patrón
de cáncer tiende a estar mejor diferenciado y es el tipo más frecuente en
poblaciones de alto riesgo. Parece que la variante difusa surge de novo a partir
de las células nativas de la mucosa gástrica, no se asocia con gastritis crónica
y tiende a ser poco diferenciado. En tanto que el carcinoma de tipo intestinal
ocurre primariamente a partir de los 50 años, con predominio de varones (2:1),
el carcinoma difuso ocurre a edades más tempranas y con predominio en las
mujeres. La incidencia del carcinoma de tipo intestinal ha disminuido
progresivamente en Estados Unidos (Robbins, 2010), sobre todo por su alta
relación con la infección por Helicobacter pylori o por factores nutricionales
(Cervantes y col., 2007). Sin embargo, la incidencia de carcinoma gástrico
difuso está aumentando, particularmente en países desarrollados, dónde junto
con el melanoma tienen una alta incidencia (Cervantes y col., 2007). Las
formas intestinal y difusa de los carcinomas gástricos pueden considerarse
como entidades distintas, aunque su resultado clínico es similar (Robbins,
2010).
Dentro del Adenocarcinoma de tipo intestinal, se cree que diversas
variantes principales afectan la génesis de esta forma de cáncer (fig. 8). Las
influencias predisponentes son muchas, pero su importancia relativa está
cambiando. Por ejemplo, la influencia de la dieta ha cambiado drásticamente
en
años
recientes
con
el
uso
de
refrigeración,
y
ha
disminuido
considerablemente la necesidad de conservar los alimentos con nitritos,
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
ahumados y sal. Por otra parte, la gastritis crónica asociada con la infección por
H. pylori constituye un factor importante de riesgo en relación con el carcinoma
gástrico limitada al píloro y antro gástrico. La gastritis se acompaña, en general,
de atrofia gástrica intensa y metaplasia intestinal, que finalmente se siguen de
displasia y cáncer. No están del todo claros los mecanismos de transformación
neoplásica. La inflamación crónica inducida por H. pylori puede liberar especies
de oxígeno reactivo que acabarán produciendo daño del ADN, provocando un
desequilibrio entre proliferación celular y apoptosis, sobre todo en zonas de
reparación tisular. Debe destacarse que los individuos con úlceras duodenales
asociadas a H. pylori están protegidos en gran medida respecto al desarrollo de
cáncer gástrico. La amplificación del gen HER-2/NEU y el aumento de la
expresión de β-catenina están presentes en el 20 al 30% de los casos, y
ausentes en el carcinoma difuso (Robbins, 2010).
Los factores de riesgo del adenoma difuso siguen sin ser definidos y no
se han identificado lesiones precursoras (Robbins, 2010) aunque está
relacionado en hombres jóvenes que han sufrido reflujo gastroesofágico y la
aparición del síndrome de Barret es común como estado precanceroso
(Cervantes y col., 2007). Las mutaciones en el gen de la E-cadherina, que no
se detectan en los cánceres de tipo intestinal, están presentes en el 50% de los
cánceres difusos. Un subgrupo de pacientes puede tener una forma hereditaria
de cáncer gástrico difuso, causada por la mutación germinal de la E-cadherina.
Las mutaciones del gen FGFR2, miembro de la familia de receptores del factor
de crecimiento fibroblástico, y la expresión aumentada de metaloproteasas
están presentes en cerca de un tercio de los casos, pero ausentes en los
carcinomas de tipo intestinal (Robins, 2008).
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GÁSTRICO
Características
Tipo Intestinal
Tipo Difuso
Incidencia
Decreciente
Incrementando
Relación con H. pylori
+++ Falsos resultados negativos con
+ Todos los test son seguros
el test del aliento, test del antígeno
fetal, test basado de la ureasa o por
microscopía
Etiología
Fact. Nutricionales, nitratos en la
Sobrepeso, reflujo gastroesofágico y
dieta
síndrome de Barret
Principal condición para la
Gastritis atrófica, metaplasia
Gastritis no atrófica
coexistencia de precáncer
intestinal
Lesión precancerosa
Adenoma, displasia; “Secuencia de
¿Hiperplasia foveolar?
Correa”
Histología
Tipo intestinal
Tipo difuso
Exofítico
Ulcerante
Glandular
Céls. aisladas y “en anillo de sello”
Biología
¿Protección por estrógenos?
¿Diferenciación neuroendocrina?
Grado de diferenciación
Bueno o moderadamente
Pobremente diferenciado
diferenciado
Edad del diagnóstico
Edad avanzada, media de edad es
Jóvenes, media de edad es 55 años
68 años
Igual
Sexo
Hombres>mujeres
Tercio superior del estómago, unión
Localización
Cuerpo y antro del Estómago
gastroesofágica, tercio inferior del
esófago
Metástasis
Nódulos linfáticos, hígado
Nódulos linfáticos, vísceras
Ciclo celular
Diploide, baja actividad proliferativa
Aneuploide, alto índice proliferativo
Tabla 2. Diferencias entre cáncer gástrico tipo intestinal y difuso (Cervantes, 2007; Vauhkonen
y col., 2006).
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
La localización de los carcinomas gástricos dentro del estómago es la
siguiente: píloro y antro, del 50 al 60%; cardías, 25%; y el resto, en el cuerpo y
el fundus. La curvatura menor está implicada en, aproximadamente, el 40% y la
curvatura mayor, en el 12%. Así, la localización preferente es la curvatura
menor de la región antropilórica. Aunque es menos frecuente, una lesión
ulcerosa de la curvatura mayor es más probable que sea maligna que benigna.
El carcinoma gástrico se clasifica basándose en la profundidad de
invasión, patrón de crecimiento macroscópico y subtipo histológico. La
característica clínica más influyente en el resultado clínico es la profundidad de
la invasión. El carcinoma gástrico precoz se define como una lesión confinada
a la mucosa y submucosa, independientemente de la presencia o ausencia de
metástasis en los ganglios linfáticos perigástricos. El carcinoma gástrico
avanzado es una neoplasia que se ha extendido más allá de la submucosa,
hasta la pared muscular, y quizás se ha diseminado más ampliamente. La
displasia de la mucosa gástrica es la presunta lesión precursora de un cáncer
gástrico precoz, que después progresa a lesiones avanzadas.
Los tres patrones macroscópicos de crecimiento del carcinoma gástrico,
que pueden ser evidentes tanto en el estadio precoz como en el avanzado,
son: 1) exofítico, con protrusión de la masa tumoral en la luz; 2) plano o
deprimido en el cual no hay una masa tumoral obvia dentro de la mucosa, y 3)
excavado, en el cual está presente una depresión o un cráter erosivo profundo
en la pared del estómago. Los tumores exofiticos pueden contener porciones
de un adenoma. La neoplasia plana o deprimida se presenta solamente como
un borramiento regional del patrón normal de la superficie mucosa. Los
cánceres excavados pueden simular, en tamaño y apariencia, úlceras pépticas
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
crónicas, aunque los casos avanzados muestran bordes sobreelevados. De
forma infrecuente, una región amplia de la pared gástrica, o todo el estómago,
está extensamente infiltrada por la neoplasia. El estómago rígido y engrosado
se denomina estómago en bota de cuero o linitis plástica; el carcinoma
metastásico de la mama y pulmón puede producir un cuadro similar (Robins,
2008).
La variante intestinal está constituida por células malignas que forman
glándulas intestinales neoplásicas similares a las del adenocarcinoma del
colon. La variante difusa está compuesta por células mucosas de tipo gástrico
que, generalmente, no forman glándulas, sino que penetran en la mucosa y la
pared como células individuales con morfología en anillo de sello o forman
pequeños grupos con un patrón de crecimiento infiltrativo.
Sea cual sea la variante histológica, todos los carcinomas gástricos
penetran eventualmente la pared hasta la serosa, se diseminan a los glanglios
linfáticos regionales y más distantes, y metastatizan ampliamente. Por razones
desconocidas, la metástasis más precoz en los ganglios linfáticos puede
implicar, a veces, un ganglio supraclavicular (nódulo de Virchow). Otra manera
algo infrecuente de diseminación intraperitoneal en mujeres es hacia ambos
ovarios, dando lugar al denominado tumor de Krukenberg.
Dentro de las características clínicas, tanto los tipos intestinal como el
difuso son, en general, asintomáticos y pueden descubrirse solamente con
examen endoscópico repetido en personas de alto riesgo. El carcinoma
avanzado también puede ser asintomático, pero con frecuencia se revela por
primera vez como malestar abdominal o pérdida de peso. No es habitual que
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Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
estas neoplasias produzcan disfagia cuando se localizan en el cardias o
síntomas obstructivos cuando surgen en el canal pilórico. La única esperanza
de curación es la detección precoz y resercción quirúrgica, ya que el indicador
pronóstico más importante es el estadio del tumor en el momento de la cirugía
(Robbins, 2010).
I.IV MARCADORES BILÓGICOS DEL CARCINOMA GÁSTRICO.
Factores biológicos.
La transformación de epitelio normal a neoplasia es un proceso
complejo, que está asociado a la acumulación de anormalidades genéticas,
adquiridas y/o heredadas. El resultado final es la proliferación final
descontrolada, invasión y metástasis. Se ha visto la participación de genes
encargados de la codificación de factores de crecimiento, citoquinas, moléculas
reguladoras del ciclo celular, factores supresores, moléculas de adhesión
celular y factores de inestabilidad genética (Haugstvedt
TK y col., 1993;
Tahara E, 1995). En conjunto, los marcadores y genes involucrados en los
adenocarcinomas
gástricos
son
similares
a
los
que
se
mencionan
habitualmente al hablar de la oncogénesis en el cáncer colorrectal, aunque
varía la frecuencia con la que se detecta alteración de cada uno de los
marcadores.
31
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Vías de carcinogénesis.
En los adenocarcinomas gástricos se reconocen dos vías de
carcinogénesis principales (Fig. 8). La primera y la más común (modelo
supresor), que afecta al 80% de los casos, se caracteriza por la acumulación
progresiva de alteraciones genéticas, que tiene lugar paralelamente a la
evolución de la alteración histológica (gastritis-metaplasia-displasia-cáncer)
(Haugstvedt TK y col.,1993; Tahara E, 1995 y Uchino S y col., 1993).
ACG difuso
ACG intestinal
Hereditario, 1020% errores
genéticos
Adquirida, 80-90%
errores genéticos
CIMP/Inestabilidad microsatélite
Metilación: hMLH1, p16, THBS1, COX-2,
GSTP1, MGMT, RASSF1A, RUNX3, TFF1
Amplificación: ERBB2
Mutación: K-RAS, TP53
LOH: APC, MCC, TP53
Metilación: CDH1, DAP-K,
HRASLs, LOX, MGMT, p14,
RAR−β
Amplificación: c-MET, k“Susceptibilidad génica”
SAM
Mutaciones CHD1 heredada Mutación: CHD1, TP53
Expresión: hTERT
Adenoma
displasia
Normal
Gastritis
H. pylori
Superficie no atrófica
Mutación: APC, TP53
Metilación: APC, CDH1,
DAP-K, hMLH1, p14,
THBS1, TIMP-3
Expresión: EGFR, TGF-α
Expresión:
CDX1/2, COX-2,
hTERT
Gastritis atrófica,
metaplasia
Figura 8. Secuencia propuesta en la patogénesis de los dos subtipos de cáncer gástrico; difuso
e intestinal. Nótese que en ambos aunque la causa inicial es la infección por H. pylori, las
secuencias patogénicas de la carcinogénesis gástrica son marcadamente diferentes entre los
dos subtipos de cáncer (Vauhkonen y col., 2006).
Incluye de forma característica, la anulación funcional de genes
supresores, como APC, p53 y la activación de oncogenes como ras. Los
tumores originados a través de esta vía muestran una marcada inestabilidad
cromosómica, son frecuentes las anormalidades citogenéticas, aneuploidia y
pérdida de alelos. La vía alternativa (modelo mutador o RER) se caracteriza por
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Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
la aparición de mutaciones diseminadas por todo el genoma. La señal distintiva
de esta vía es la alteración de la longitud y composición de pequeñas
secuencias de bases del ADN (microsatelites). La presencia de una elevada
incidencia de alteraciones de los microsatelites (inestabilidad de los
microsatelites ) se debe a un defecto en el sistema de genes reparadores del
ADN (hMLH1,hMSH2, hPMS1, hPMS2, hMSH6). La mutación de alguno de
ellos origina una desestabilización que finalmente conduce a mutaciones
generalizadas en todo el genoma.
Sabemos que clínica y epidemiológicamente, los adenocarcinomas
gástricos no son un grupo uniforme. Existen marcadas diferencias de
comportamiento entre los dos grandes tipos histológicos tumorales: el intestinal
y el difuso. (Uchino S y col., 1993; Manzoni G y col., 2001; Fenoglio-Preiser CM
y col., 1996). Parece que existe un soporte genético o biológico que sustenta
esas diferencias. La frecuencia de alteraciones de la mayoría de los
marcadores biológicos es diferente en ambos tumores (fig. 8).En una elevada
proporción de los tumores de tipo difuso y pobremente diferenciados se detecta
inestabilidad de los microsatélites , además la frecuencia de amplificación de
crecimiento como c-met o k-sames mayor, la frecuencia con la que se
encuentran mutaciones en el p53 es muy inferior, no se suele observar pérdida
de función de los genes AOC y p53 que actúan como moléculas de adhesión y
frecuentemente hay disminución de la expresión de cadherina y cateninas de la
matriz extracelular, también la actividad de enzimas proteolíticas de la matriz
extracelular está significativamente elevada (Nakatsuru S y col., 1992;
Kuniyasu H y col., 1993; Washington K y col., 1995; Jan HJ y col., 1993;
Artunedo P y col., 2000). Por lo contrario, en los tumores de tipo intestinal la
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
frecuencia de alteración de microsatélites, es muy inferior, no se suelen
detectar alteraciones en la expresión de factores de crecimiento, sin embargo
son muy frecuentes mutaciones en los genes p53,DDC y APC, a menudo hay
sobreexpresión de cadherina y cateninas.
Los tumores de tipo intestinal bien diferenciados parecen seguir un
patrón genético diferente que los tumores de tipo difuso y pobremente
diferenciados (Haugstvedt TK y col., 1993; Tahara E. 1995 y Allgayer H y col.,
1997). Se ha propuesto que la inestabilidad genética juega un papel crítico en
el desarrollo de los tumores poco diferenciados, que frecuentemente se
desarrollan sobre mucosa no metaplásica en poblaciones más jóvenes. Por el
contrario en los tumores de tipo intestinal parece tener un mayor peso el
modelo genético supresor y la acumulación progresiva de mutaciones en
protooncogenes y pérdida de función de genes supresores.
Factores de crecimiento y receptores de membrana.
Los factores de crecimiento son proteínas que participan en la regulación
de las relaciones intercelulares y en las relaciones entre células y estroma.
Funcionan como reguladores de la proliferación de forma autocrina o paracrina
(Tahara E, 1990). Actúan sobre receptores de membrana específicos con
actividad tirosin quinasa.
El proto-oncogenC-met se ha visto frecuentemente amplificado en
carcinomas gástricos, en carcinomas poco diferenciados y en los tipos difusos
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Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
(Kiniyasu H y col., 1993). Se ha indicado que existe una correlación significativa
entre amplificación de c-met con estadio tumoral, invasión linfática y
profundidad de la invasión tumoral en la pared gástrica. La sobreexpresión se
asocia a estados avanzados de la enfermedad, metástasis y menor
supervivencia. Sin embargo no se ha comprobado que este factor proporcione
valor pronóstico.
El factor NEU, también conocido como c-erbB-2, se ha observado una
amplificación preferentemente en carcinomas gástricos poco diferenciados
(Jaehne J y col., 1994). En algunos estudios indican que este marcador se
relaciona con la supervivencia. En un estudio con 260 tumores gástricos se
encontró relación entre la expresión inmunohistoquímica de la proteína
codificada (p185) y el tipo histológico, afectación ganglionar e invasión de
serosa y se indicó que los tumores p185 positivos mostraron una menor
supervivencia (Yonemura Y y col., 1991). Otro estudio con 180 pacientes
confirmó estos hallazgos (Uchino s y col., 1993). Además, la expresión de p185
se comportó como un parámetro predictivo independiente.
Parece que la sobreexpresión de los factores EGF y TGF se
correlaciona con el grado de malignidad biológica. EGF estimula, de forma
autocrina, el crecimiento tumoral y la división celular (Tokunuga A y col., 1995).
Sin embargo, se necesitan más estudios para poder determinar el valor
predictivo independiente en análisis multivariante.
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Regulación del ciclo celular. Gen P-53
Se han detectado mutaciones del gen p-53 en casi todos los tumores.
Actúa como controlador del ciclo celular, iniciador de la apoptosis, preservador
de la estabilidad genética y promotor de la diferenciación celular. Codifica una
fosfoproteína de 53 kd (proteína p53) que actúa como factor de transcripción,
regulador positivo o negativo de la expresión de diversos genes secundarios.
En caso de mutación del gen p53, la célula es incapaz de detener el
ciclo celular. La ausencia del freno biológico permite mayor probabilidad de que
el ADN dañado sea replicado, perpetuando y multiplicando los defectos
genéticos (Gomyo Y y col., 1997; Noda H y col., 2001).
La proteína p53 codificada por el gen que ha sufrido una mutación posee
una vida media prolongada y se acumula en las células neoplásicas, por lo que
es fácilmente detectable por inmunohistoquímica.
Se sabe que el 40% de los adenocarcinomas gástricos presentan
sobreexpresión en el núcleo celular de la proteína p53b (Noda H y col., 2001;
Brito MJ y col., 1994; Fukunaga M y col., 1994). Estas alteraciones están
involucradas en la evolución de displasia severa a carcinoma, ya que la
sobreexpresión de p53 se detecta en 20% de los casos de adenocarcinomas
gástricos y en el 10% de los casos de metaplasia intestinal. También están
involucradas en la progresión tumoral, pues se ha observado que en tumores
gástricos, la presencia de mutación en el gen p53 o la sobreexpresión de la
proteína codificada, se asocian a un mayor grado de invasión local, estadio
más avanzado, presencia de afectación ganglionar y localización en tercio
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
proximal de estómago (Brito MJ y col., 1994; Fukunaga M y col., 1994; Gabbert
HE y col., 1995; Kajeti Y y col., 1993). Los carcinomas de tipo intestinal
presentan con mayor frecuencia sobreexpresión de proteína p53 que los
difusos. Así mismo, las neoplasias con elevado índice de proliferación y
aneuploidia presentan mayor frecuencia de positividad a p53.
Moléculas de adhesión celular.
Para que las células neoplásicas puedan invadir tejidos adyacentes,
deben desprenderse del tumor primario. En el adenocarcinoma gástrico se
observa frecuentemente alteración en la expresión de las moléculas de
adhesión celular (Peifer M. 1993). Se trata de glucoproteinas localizadas en la
superficie de las células, codificadas por genes supresores, participan en la
formación del citoesqueleto y en el anclaje de la célula a E-cadherina y Betacatenina de la matriz extracelular. La alteración afecta, entre otros, a los genes
APC y DDC.
Las proteínas codificadas por estos genes se detectan en la mucosa
gástrica normal, pero su expresión disminuye o está anulada en los
carcinomas. Parece probable que la alteración del reconocimiento de señales
extracelulares, tanto de la interacción célula-célula como célula-matriz
intercelular, que se produce por la difusión de estos genes puede llevar a la
pérdida del control de crecimiento normal y puede ser, en parte, responsable
de algunas de las características de las neoplasias (invasión, movilidad y
metástasis). Se observa pérdida de función de los genes APC y DDC en el
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Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
60% de los carcinomas bien diferenciados y excepcionalmente en los de tipo
difuso. Además, su funcionamiento también está alterado en 25% de los
adenomas gástricos y 10% de los pólipos gástricos hipertróficos. Por contra, en
los carcinomas indiferenciados y en los de tipo difuso se detecta disminución
de la expresión de cadherina y cateninas (Nakatsuru S y col., 1992; Grôtzinger
C y col., 2001; Russo A y col., 2001). Sin embargo, todavia no ha sido
suficientemente analizado si este hallazgo posee significación predictiva.
Marcadores de proliferación.
El índice de proliferación celular tumoral ha sido extensamente
empleado como marcador biológico. Se trata de cuantificar la proporción de
células tumorales que se encuentran en fase de división. Cuanto mayor sea la
proliferación de células que proliferan, mayor será la agresividad del tumor. Se
han utilizado métodos directos (cuantificación de células en mitosis) y
marcadores indirectos. Estos últimos utilizan anticuerpos que reconocen
proteínas nucleares involucradas o alteradas durante el ciclo celular. Uno de
los más estudiados es el PCNA (ProliferatingCell Nuclear Antigen). Esta
proteína se sintetiza en la fase G1 del ciclo celular y se acumula en la fase S.
Se trata de una proteína accesoria de la ADN polimerasa, que forma
complejo con la ciclina D y la kinasa de ciclina. Ki-67 es otro anticuerpo que
detecta un antígeno que aparece durante todo el antígeno celular excepto en la
fase G0. Ambos se determinan por inmunohistoquímica. Parece que los
carcinomas gástricos con elevada reactividad PCNA en el margen tumoral
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
invasivo muestran un comportamiento más agresivo. Existe una fuerte
correlación entre aumento de la expresión inmunohistoquímica y menor grado
de diferenciación, presencia de metástasis ganglionar, presencia de invasión
vascular y de metástasis hepáticas (Amadori D y col., 1997; Russo A y col.,
2001; Schwartz GK y col., 1994).
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
II. PLANTEAMIENTO DEL TEMA
Los CG han sido divididos en dos tipos histológicos principales:
diferenciado e indiferenciado (o intestinal y difuso), basados en la formación de
glándulas. Ambos tienen diferentes características epidemiológicas y están
relacionados con diferentes vías patogénicas. Las formas diferenciadas,
derivan de células epiteliales gástricas que han desarrollado metaplasia
intestinal (incompleta y/o completa), los indiferenciados se originan a partir de
un epitelio, generalmente del fondo de la foveola, nativo o aparentemente
normal. La mayoría de las formas diferenciadas muestra un fenotipo intestinal,
especialmente el tipo incompleto de metaplasia. Pero con el desarrollo de
métodos analíticos de histoquímica e inmunohistoquímica de mucinas, algunos
timos bien diferenciados, se corresponden con un fenotipo gástrico, y otros
muestran un fenotipo de metaplasia intestinal completa. En principio, los
carcinomas gástricos se desarrollan en el seno de la mucosa y luego invaden el
componente submucoso hasta la muscular propia/serosa. Durante este
trayecto las neoplasias, modifican su estructura e incluso su historia natural.
Estos cambios los marcan la heterogeneidad tumoral que se caracteriza por la
presencia de subpoblaciones celulares que difieren entre sí, en algunos
atributos fenotípicos: tasa de crecimiento, capacidad de invadir y metatizar, etc.
Los mecanismos responsables de la heterogeneidad tumoral son:
a) Las células neoplásicas son genéticamente inestables y parecen ser
responsables ciertos genes supresores.
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
b) Los tumores evolucionan potenciando los subclones más apropiados
para cada “medio ambiente”.
Al principio, predominarán las células con especial capacidad para entrar
en ciclo celular. Las características que definen la heterogeneidad tumoral
(expresión genética y proliferativa) han sido bien documentadas. Algunos
autores han estudiado las bases genéticas de los CG y han sugerido que un
importante factor en la oncogénesis es la inestabilidad genética, así personas
con inestabilidad microsatélite su genoma tienen mayor tendencia a acumular
alteraciones genéticas y mayor posibilidad para una célula normal se
transforme en neoplásica. No son tan claros los estudios topográficos del tumor
y la expresión del fenotipo de mucinas.
Solo algunos trabajos hablan de estas características en piel, vejiga y
colon. Los cambios progresivos del comportamiento proliferativo neoplásico
conforme el tumor crece y se desarrollan, son debidos directamente a la
heterogeneidad en la cinética tumoral. En los casos donde el crecimiento en el
tiempo puede establecerse por planos topográficos de infiltración pueden ser
estudiados desde una perspectiva espacial o topográfica.
Cabría esperar que la distribución de las células proliferativas marcaran
una potencial estructura y una diferenciación que podría ser observada en los
sectores
más
superficiales,
mientras
que
las
fases
ulteriores
se
corresponderían a los sectores profundos, donde no debería verse tal
diferenciación.
Los acontecimientos secuenciales histopatológicos y molecular no son
bien conocidos en la carcinogénesis colorrectal, no ocurre lo mismo en lo
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
referente al estómago, donde existen diferentes compartimentos topográficos
con diferentes estructuras, funciones y poblaciones celulares. Este hecho
dificulta el conocimiento de la carcinogénesis gástrica y su comportamiento en
la evolución pronostica y tratamiento. Sabiendo que la clasificación más usada
internacionalmente corresponde a aquella descrita por Lauren y dado que
resulta complicada una nueva clasificación, es por lo que seguimos utilizando la
misma, con apoyo para el estudio de otras características.
Los objetivos del presente estudio consisten en:
1. Definición y clasificación de subtipos con diferenciación organoide en el
carcinoma gástrico.
2. Caracterización de la proliferación celular ligada al Ki-67 por
compartimentos topográficos con la intención de verificar si el
componente o compartimento superficial representa la fase precoz de
progresión tumoral, con mayor índice de proliferación que el
componente o compartimento profundo.
3. Estudio de la correlación de las características topográficas de
proliferación y fenotipo de mucinas con la expresión de proteínas tipo
mlh1 y msh2, para conocer, y si es posible, sugerir, pautas citogenéticas
con impacto biológico.
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
III. MATERIAL Y MÉTODOS
Se han seleccionado, con carácter retrospectivo, durante el periodo
comprendido entre 1994 y 2001, 104 casos (52 varones y 52 mujeres), no
consecutivos de carcinoma gástrico, procedentes de los Servicios de
Gastroenterología, Cirugía Digestiva y Anatomía Patológica del Hospital
Universitario “Virgen Macarena” de Sevilla (España).
Para el estudio histopatológico se utilizó el tejido incluido en parafina.
Las muestras procedían de resecciones quirúrgicas. De los 104 casos, 68
correspondían a tumores músculo-invasivos y 36 estaban limitados a la
mucosa y submucosa. Todas las piezas quirúrgicas fueron incluidas en
parafina en su totalidad.
Los casos seleccionados cumplieron los siguientes criterios de inclusión:
a) Componentes topográficos identificables en carcinomas músculoinvasivos: superficial y profundo.
b) Un número suficiente de tumores diagnosticados en mujeres, con la
finalidad de poder realizar en el futuro, si se desea, estudios de
clonalidad.
c) Como controles de diferenciación además de las muestras de mucosa
gástrica aparentemente normal, el componente intramucoso tenía que
presentar una diferenciación similar a la observada en la mucosa
gástrica adyacente no neoplásica, al menos, con la inmunotinción para
Ki-67.
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GÁSTRICO
Para el estudio morfométrico se escogieron muestras tumorales en
superficie y en profundidad (fig 9).
III.I. Corte y control de las muestras seleccionadas para el estudio
histopatológico convencional.
De los bloques seleccionados, se realizaron un total de 20 cortes
seriados de 4 micras, cada uno se tiñó con las distintas técnicas, (Tabla 3)
según un orden preestablecido, de tal modo que para la evaluación de los
resultados, pudiésemos valorar los mismos campos microscópicos con las
distintas técnicas utilizadas.
TÉCNICA
UTILIZACIÓN
HE
Tinción convencional
AA(pH 2,5)-PAS
Mucinas ácidas y neutras.
HID-AA
Mucinas sulfatadas y dializadas
CEA (Dako, Dinamarca)
Glucoproteínas tipo antígeno carcinoembriónico
MUC5AD (M1, Novocastra UK)
Moco gástrico normal superficial
CD-10 (56C6)
“ribete en cepillo”
Mlh1 (G168-15, Phar-Mingen, S. Diego, USA)
Expresión proteínas Mlh1
Msh2 (FE-11, Phar-Mingen, S.Diego, USA)
Expresión proteínas Msh2
Oxidacción-Reducción-Concanavalina A (Ox-
Expresión de carbohidratos de membrana.
Red-Con A), Sigma (Katsuyama T y col., 1978)
Tabla 3: Panel de técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas utilizadas.
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Los cromógenos utilizados fueron indistintamente 3,3’ tetraclorohidrato
de diaminobencidina (DAB), 4-Cloro-1-Nartol, Fostatasa alcalina y 9-aminoetilcarbazol.
En cada caso, se utilizaron los cortes previo y posterior a los cortes
empleados para los distintos estudios, que se tiñeron con HE y sirvieron como
control y registro de las áreas tumorales evaluadas. Para una mayor
reproducibilidad
y
fiabilidad
de
los
resultados
y
para
potenciales
comparaciones, las mismas áreas pudieron ser evaluadas a nivel celular,
histoquímico, inmunohistoquímico e histológico convencional.
Como referencia de proliferación celular se valoró el índice mitótico,
siguiendo el método descrito en la valoración cuantitativa.
En los diferentes cortes se realizó, a nivel celular, una evaluación del
índice mitósico (HE) (media aritmética, desviación típica), tanto por campo
microscópico como por celularidad tumoral y, además, evaluación del antígeno
dependiente del ciclo celular (Ki-67/MIB-1).
III.II. Valoración clínica
Se disponía de la historia clínica dónde existían datos referentes a: edad,
sexo, tamaño (diámetro máximo) en superficie y localización tumoral.
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GÁSTRICO
III.III. Valoración histológica convencional
Patrón de crecimiento predominante
Si el tumor estaba constituido por glándulas en más de 50% se clasificó
como carcinoma gástrico tipo intestinal bien diferenciado. Cuando las células
neoplásicas eran más del 50% y proliferación difusa con evidente vacuola
mucosa intracitoplasmática, se clasificó como carcinoma difuso de células en
“anillo de sello”. Si además, más de un 50% de la población tumoral no
presentaba el fenotipo anterior, sino que exhibía un citoplasma eosinófilo con
un núcleo grande hipercromático, se clasificó como carcinomas difusos mal
diferenciados.
Sobre estos patrones se estudió el compartimiento intramucoso, con
objeto de identificar los distintos tipos de diferenciación (subtipo pilórico,
foveolar, de células mucosas glandulares e intestinal). Éste último subtipo se
incluyeron las características fenotípicas del intestino delgado y del grueso.
Mitosis
Únicamente se contabilizaron las estructuras donde se reconocía la
membrana citoplasmática, en ausencia de carioteca y con tinción basofílica
homogénea. No se consideraron las células de citoplasma densamente
eosinofílico y los núcleos irregulares con clarificaciones.
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
La cuantificación se inició en el área más celular y peor diferenciada,
seleccionándose 30 campos microscópicos consecutivos de gran aumento y
con núcleos no superpuestos. Área de 1 CGA =0,1428 mm2 .
En cada caso, se calculó el índice mitósico mayor por cada 30 campos y
la diferencia entre los índices mayor y menor (rango). El recuento del número
de mitosis, presenta la gran ventaja de que para su estudio no requiere medios
sofisticados.
Hay
factores
potencialmente
distorsionadores
del
grado
de
reproducibilidad y representatividad de esta técnica que amenazan la fiabilidad
y aplicabilidad.
Ki-67/MIB-1
En el estudio y cuantificación de la expresión inmuhohistoquímica de
marcadores ligados al ciclo celular, el más empleado es el antígeno Ki-67 que
se expresan en todas las fases del ciclo excepto en fase G0.
La demostración de Ki-67 es el ejemplo paradigmático de todas las
demás técnicas y las ha desplazado casi por completo en la aplicación básica y
asistencia sanitaria. El Ki-67 es un antígeno nuclear que está presente sólo en
las células que se encuentran en proliferación (Gerdes J y col., 1984).
El índice de proliferación ligado a Ki-67 se ha expresado por una relación
entre el número de células Ki-67 positivas y el número de células positivas y
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
negativas encontradas en los diferentes campos histológicos estudiados.
Recientemente se ha desarrollado un nuevo anticuerpo, denominado MIB-1 a
partir de un epitomo de Ki-67, resistente a la fijación que reconoce al mismo
antígeno que el anticuerpo original y que puede ser utilizado en tejidos fijados
en formol e incluidos en parafina (Taylor C y col., 1994).
III.IV. Estudio inmunohistoquímico
Los tumores se consideran con un fenotipo gástrico, si la expresión
fenotípica de mucinas era gástrica, e intestinal, si la expresión era la de una
metaplasia intestinal completa.
Para dilucidar la relación entre la expresión fenotípica de mucinas y la
distribución de células tumorales Ki-67 (+), se estudiaron 10 casos de tipo
intestinal con diferenciación subtipo mucosa pilórica, 10 casos de tipo difuso y 3
de tipo intestinal con expresión de diferenciación tipo metaplasia intestinal.
Todos fueron arbitrariamente seleccionados. Como controles, 5 casos de
mucosa corporal normal de mucosa antral normal y mucosa gástrica con
metaplasia intestinal completa.
En cada corte histológico se escogieron 3 porciones de mucosa normal,
mucosa gástrica con metaplasia intestinal completa o carcinoma intramucoso o
avanzado de unas 400 micras de ancho y que fueron seleccionadas al azar (la
expresión fenotípica de mucinas se observa sólo en el compartimiento
mucoso). Estos espacios fueron subdivididos en cinco zonas horizontales de
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
igual medida. El índice de prolifereación (IP) ligado a Ki-67 fue establecido de
forma semicuantitativa por la relación entre células gástricas Ki-67+ y las
células mucosas gástricas Ki-67+ y no positivas en cada compartimiento,
paralelamente se hizo una medida en un analizador de imagen tipo CAS-200
para el estudio estadístico.
En la mucosa normal, el número medio de células contadas en cada
compartimiento para calcular el IP ligado a Ki-67 fue de 94,3 (rango 65 a 114).
En referencia a la mucosa intestinal completa, el número de células contadas
en cada compartimiento para calcular el IP ligado a Ki-67 fue de 93,3 (rango 63
a 119). En el carcinoma intramucoso, el número medio de células contado en
cada compartimiento para calcular el IP fue de 90,1 (rango 56 a 132).
Este proceder fue realizado, sin conocer el diagnóstico ni otro parámetro
clínico, por dos patólogos y de forma simultánea, además fue repetido dos
veces para establecer su reproducibilidad. Se realizó el test de la t de Student
para corroborar que no existía ninguna diferencia significativa entre los valores
de los observadores. Los datos se presentaron como media ± desviación
estándar de la media.
El análisis estadístico de diferencias en el IP ligado a Ki-67 entre cada
uno de los compartimientos fue llevado a cabo usando análisis de varianza en
un sentido. Para el análisis cuantitativo de la inmunotinción se contaron 30
campos consecutivos de cada compartimiento, iniciando el recuento por la
zona en donde la tinción era más evidente.
Los resultados para mlh1 y msh2 se categorizaron según el número de
núcleos positivos: < 5% (categoría I), 5-15% (categoría II) y >15% (categoría
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GÁSTRICO
III). Toda la cuantificación inmunohistoquímica se realizó con un analizador de
imagen CAS-200.
III.V. Caracterización de la mucosa gástrica no neoplásica adyacente
Esta valoración se hizo para gradar la metaplasia intestinal existente en
tres tipos: ninguna (no existía), leve y severa a través del estudio convencional
con HE. Una metaplasia intestinal por encima del 50% de todos los cortes
histológicos observados, fue definida como severa; mientras que por debajo de
ese 50% era definida como leve.
III.VI. Estudio estadístico
Todos los datos fueron procesados mediante el paquete estadístico SPSS
(Chicago, IL) para Windows, versiones 7 y 9.
Se realizó un estudio univariante con la finalidad de encontrar diferencias
significativas entre:
1) Compartimentos tumorales (superficial y profundo), para variables de
proliferación celular.
2) La inmunoexpresión de mlh1 y msh2 en compartimentos tumorales y
3) La relación entre el fenotipo de mucinas y la expresión de las
oncoproteínas antes indicadas.
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GÁSTRICO
Las diferencias se consideraron significativamente estadísticas cuando
p<0.005.
IV. RESULTADOS
IV.I. Mucosa gástrica no neoplásica
Las propiedades histoquímicas de la mucosa gástrica no neoplásica
aparecen bien recogidas en la literatura (Lewin KJ y Appleman HD, 1996;
Lauwers GY, 2003; Dixon MF y col., 1994; Katsuyama T y col., 1982). Las
células mucosas de la superficie y foveolas aparecen intensamente teñidas por
MUC 5AC/Mucina gástrica humana (MGH); mientras que las células mucosas
de las criptas glandulares antrales se tiñeron de color marrón (si el cromógeno
era DAB) o de color azul negro (si era 4-Cloro-1-Naftol).
Las células Ki-67+ estaban localizadas en el istmo (entre el cuello y el
fondo de la foveola) tanto en antro como en cuerpo. El contaje (de 5 casos
aleatorios), de células Ki-67+ en la mucosa corporal, astral y con metaplasia
intestinal completa se muestra en la tabla 4. Estos índices fueron
significativamente más altos que en otros estratos (p< 0.05).
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GÁSTRICO
Nº casos/estratos
Primero
Segundo
Tercero
Cuarto
Quinto
Mucosa Fúndica
7,2±2,3
54,0±2,5
46,3±4,3
27,8±3,2
15,1±2,2
Mucosa antral
12,1±3,3
56,1±3,6
60,2±2,8
31,3±4,1
9±2,0
MetaplasiaIntestinal
20,0±4,1
48,4±3,0
52±3,2
61±4,3
67,8±1,3
completa
Tabla 4: Índice de proliferación celular con Ki-67 de la mucosa gástrica no neoplásica. Los
valores corresponden a las medias ± la desviación estándar en %.
IV.II. Tejido tumoral
Clasificación de células tumorales
En este estudio, las células del carcinoma encontradas tanto en el difuso
como en el intestinal fueron clasificadas en 7 tipos, basados en la similitud de
sus propiedades histoquímicas y/o inmunohistoquímicas frente a aquellas que
expresan las células epiteliales mucosas normales. Pueden existir diferentes
tipos de células tumorales en el mismo caso. Aunque el “tipo célula caliciforme”
de las células de un carcinoma podrían haberse clasificado como tipo intestino
delgado (Silverberg E y col., 1990; Kokkola A y col., 2002), nosotros las
clasificaremos dentro de la categoría del tipo “célula caliciforme” en un intento
de centrar la descripción de diferenciación fenotípica de mucinas. Las células
de Paneth, que se observaron en 3 de los 44 casos (7%) de tipo difuso y en 6
de 60 casos (10%) tipo intestinal, contenían gránulos eosinófilos y se teñían
con lisozima.
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GÁSTRICO
Las células del carcinoma tipo microquístico (o células en “anillo de
sello”), se observaron generalmente en el tipo difuso y muy raramente en el
intestinal.
Clasificación e incidencia de diferenciación (fenotipo de mucinas)
Independientemente de si eran intestinales o difusos, la diferenciación
fue observada solamente en el tejido tumoral intramucoso de casos de
carcinoma precoz o avanzado de estómago; nunca se observó en otras
localizaciones de la pared gástrica. Por ello esta diferenciación fue dividida en
dos tipos principales: tipo gástrico y tipo metaplásico intestinal (figuras 9 a
la 24).
Figura 9. Corte histológico representando los compartimentos superficial y profundo (HE, 4X).
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Figura 10. Carcinoma gástrico invasivo (HE, 140X)
Figura 11. Diferenciación subtipo pilórico. El epitelio superficial y foveolar aparece teñido con
MGH (en rosa), el fondo de las criptas glandulares aparece teñido de color marrón con ox-redConA y los núcleos en la zona intermedia marcados con Ki-67 (triple Tinción con dos
cromógenos diferentes: fostatasa alcalina y DAB) (140X).
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GÁSTRICO
Figura 12. Carcinoma gástrico invasivo con diferenciación subtipo foveolar. El epitelio
superficial y foveolar aparece teñido con MUC5AC (en marrón). Igualmente se tiñen algunas
células caliciformes presentes. Los núcleos aparecen marcados en color rosa con Ki-67.
Nótese que la mayor concentración de marcaje nuclear aparece en el fondo de las foveolas
(140X).
Figura 13. Carcinoma gástrico difuso invasivo. Recuadro mayor aproximación de la celularidad
tumoral (HE, 100X, recuadro: HE, 260X).
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Figura 14. Carcinoma gástrico difuso invasivo. Inmunotinción con CEA para la población celular
en superficie y negatividad en la población celular del fondo (100X).
Figura 15. Carcinoma gástrico difuso invasivo. Tinción histoquímica con ox-red-ConA para
marcar mucinas de glándulas antrales en la población celular tumoral inferior y negatividad en
la superior (100X).
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Figura 16. Carcinoma gástrico difuso invasivo. Doble tinción CEA-ox-red-ConA para señalar el
subtipo de diferenciación pilórica (100X, recuadro mayor detalle de lo anterior: 260X).
Figura 17. Carcinoma gástrico con diferenciación de metaplasia intestinal completa (HE, 140X).
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Figura 18. Carcinoma gástrico con diferenciación de metaplasia intestinal completa. Secuencia
histoquímica AA-PAS (160X).
Figura 19. Carcinoma gástrico con diferenciación de metaplasia intestinal completa. Izquierda:
Inmunotinción positiva intracitoplasmática y paranuclear con MUC2 para señalar la presencia
de mucinas sializadas (140X). Derecha: igual tinción en la zona músculo-invasiva (260X).
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Figura 20. Carcinoma gástrico con diferenciación de metaplasia intestinal completa. Patrón de
distribución de núcleos positivos para Ki-67 en el fondo de las criptas glandulares tumorales
(140X).
Figura 21. Carcinoma gástrico difuso (HE, 160X).
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Figura 22. Carcinoma gástrico difuso. Inmunotinción para expresión de proteínas tipo mlh1 en
compartimento superficial (160X).
Figura 23. Carcinoma gástrico difuso. Inmunotinción para mlh1 en compartimento profundo
(260X).
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GÁSTRICO
Figura 24. Carcinoma gástrico tipo intestinal. Inmunotinción positiva en superficie para
expresión de proteínas tipo mlh1 (260X).
El primero fue clasificado en tres subtipos: pilórico, foveolar y
glandular.
El subtipo mucosa pilórica mostraba 3 estratos: superior, medio e
inferior. Imitaba a la mucosa antral (o prepilórica) y el estrato más superior
mostraba características tintoriales similares a las que mostraba las células
mucosas superficiales. En el medio existían células tumorales más inmaduras,
con poco citoplasma y una alta relación núcleo/citoplasma. El más inferior,
constituido por células tumorales tipo mucosas glandulares.
El subtipo foveolar mostraba sólo dos de los estratos anteriormente
referidos, el superior y el medio.
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GÁSTRICO
El glandular mucoso también mostró dos estratos, el medio y el inferior
del tipo mucosa pilórica.
La estructura de diferenciación fenotípica de mucinas del tipo intestinal
metaplásico, simulaba a aquella mostrada por la metaplasia intestinal completa.
La mayoría de las células proliferantes del carcinoma recordaban un epitelio
intestinal incluyendo la presencia de células de Paneth. El tipo metaplásico
intestinal sólo fue observado en el carcinoma tipo intestinal. La estructura de la
diferenciación fenotípica que recordaba a la de una metaplasia intestinal
incompleta fue incluida en la categoría de diferenciación tipo gástrico.
Todos los casos con carcinoma que mostraron diferenciación fenotípica
de mucinas en el tejido tumoral intramucosa fueron clasificados en 4 grupos.
El primer grupo, casos con subtipo pilórico o antral de diferenciación al
menos una parte del tejido tumoral.
El segundo grupo, casos con subtipo foveolar de diferenciación en al
menos parte del tejido tumoral intrmucoso, pero faltaba el correspondiente a
mucosa pilórica.
El tercer grupo, casos con subtipo de diferenciación glandular en al
menos una parte del tumor, pero faltaban los patrones de diferenciación
foveolar y pilórica.
El cuarto grupo, casos de diferenciación tipo metaplásico-intestinal en
al menos una parte del tumor intramucoso.
Como se muestra en la tabla 5, de todos los carcinomas difusos
observados, el 50% estaban en el primer grupo, el 18% en el segundo y un 5%
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GÁSTRICO
en el tercer grupo. Doce casos (27%) estaban desprovistos de cualquier tipo de
diferenciación y la mayoría de ellos eran avanzados. Los casos de carcinoma
difuso precoz, el 63% pertenecía al primer grupo, mientras que los carcinomas
difusos avanzados, solo el 29% fueron incluidos en este grupo (p< 0.05).
De todos los carcinomas gástricos tipo intestinal examinados, el 25%
estaba en el primer grupo, el 10% en el segundo, el 13% en el tercero y solo el
5% (3 casos) en el cuarto. En 28 casos (47%), la diferenciación estaba ausente
y la mayor parte de los casos eran avanzados. Las frecuencias del primer
grupo de los carcinomas gástricos tipo intestinal (precoz y avanzado) fueron del
29% y 16% respectivamente (p< 0.05) (tabla 6).
Tipo de carcinoma
Carcinoma
Casos
Primer
Segundo
Tercer
Cuarto
Inclasificado
examinados
grupo
grupo
grupo
grupo
20/27*
13/9’’
4/4
2/6
0/1
1/7
7/14
4/3
2/1
0/1
0/1
1/8
17/19
5/3
2/1
0/1
0/1
10/13
44/60
22/15
8/6
2/8
0/3
12/28
Intramucoso
Carcinoma
Submucos
Carcinoma
Avanzado
Total
* Número de casos de carcinoma difuso (a la izquierda de la barra y número de casos de carcinoma
intestinal a la derecha).‘’ p< 0.05 (tipo difuso vs tipo intestinal). El análisis estadístico fue realizado usando
la tabla de contingencia.
Tabla 5: Frecuencias de carcinoma gástrico en cada grupo
Distribución de células Ki-67 positivas
Las células tumorales Ki-67 positivas se situaban más densamente en la
zona proliferativa de la mucosa no neoplásica en el tejido tumoral intramucoso
con diferenciación fenotípica de mucinas.
63
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
En el carcinoma difuso con diferenciación subtipo mucosa pilórica, el IP
ligado a Ki-67 de las células tumorales fue de 35,0%± 2,5% (rango 31,2-39,6%)
y el índice de proliferación del tercer estrato fue más alto que en cualquier otro
estrato (44,3%) (p< 0.05) (tabla 6).
En el primer y segundo estrato, las células tumorales mostraron un
subtipo epitelio superficial/foveolar casi exclusivamente, mientras que en el
cuarto y quinto había células tumorales subtipo célula mucosa glandular. Así el
IP ligado a Ki-67 de células tumorales de cada estrato representaba aquel que
expresaba cada fenotipo de célula tumoral.
La distribución de células Ki-67 positivas en los carcinomas gástricos
tipo intestinal con un subtipo de diferenciación de mucosa pilórica, recordaba al
que expresaba el carcinoma difuso con el subtipo de diferenciación de mucosa
pilórica. Así, la media del índice de proliferación ligado a Ki-67 de células
tumorales fue de 45,3% ± 3,9% (rango: 42,6% a 48,2%), y el valor más alto, fue
observado en el tercer estrato (68,5%) tabla 5. El IP del tercer estrato fue
significativamente más alto que en el resto de los estratos (p< 0.05).
El índice Ki-67 de los carcinomas gástricos tipo intestinal con el subtipo
metaplásico-intestinal difería de aquel con subtipo de mucosa pilórica y el IP
ligado a Ki-67 más alto, se obtuvo en el quinto estrato (66,6%) (tabla 5). El IP
ligado a Ki-67 del quinto estrato era más alto que en el resto de los estratos
(p<0.05), pero las diferencias entre el tercero, cuarto y quinto no fueron
estadísticamente significativas.
64
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Tipos de carcinoma
Primero
Segundo
Tercero
Cuarto
Quinto
Tipo difuso (con subtipo
Ki-67+
33,0 ±4,1
45,3 ±3,9
39,1 ±3,2
28,2 ±4,3
mucosa pilórica)
22,3 ±3,0*
Tipo Intestinal (con subtipo
32,8 ±2,0
44,8 ±3,2
68,5 ±3,0
64,9 ±4,4
54,0 ±3,8
36,6 ±2,4
53,4 ±2,9
63,9 ±3,5
65,8 ±3,0
66,6 ±3,2
de mucosa pilórica)
Tipo Intestinal (con subtipo
de metaplasma intestinal
completa)
* Los valores corresponden a las medias ± la desviación estándar en %.
Tabla 6: Índice de proliferación (Ki67) del tejido tumoral intramucoso mostrando una
diferenciación fenotípica subtipo mucosa pilórica o subtipo intestinal metaplásica.
IV.III. Parámetros clínicos
Para el tratamiento estadístico, se consideraron edad/sexo (52
hombres/52 mujeres), con un rango de edades entre 28 y 77 años (media 57,2
años), su localización y relación al estadio TNM (Sistema de estadificación
tumoral) (tabla 7).
TNM*
SubcardialC.MenorC.Mayor
Antro
Total
I
Nº
0
10
4
14
28
II
%
Nº
0
4
9,6
9
3,8
2
13,4
9
26,9
24
III
%
Nº
3,8
10
8,6
16
1,9
7
8,6
19
22,9
52
%
9,6
15,3
6,7
18,2
49,8
*TNM: Sistema de estadificación tumoral aceptado por la UICC y el AJCC. Basado en la extensión del
tumor (T), extensión de la diseminación a ganglios linfáticos (N) y presencia de metástasis (M). A mayor
número (I, II y III), mayor tumor y/o diseminación del cáncer a los ganglios linfáticos vecinos y/o a órganos
adyacentes al tumor primario.
Tabla 7: Distribución de los Carcinomas Gástricos por localización y relación al estadio TNM.
65
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
IV.IV. Parámetros proliferativos
Los valores medios de la cuantificación de mitosis y su relación con la
celularidad total o campo a campo en cada compartimento están resumidos en
la tabla 8.
Recuento
Variable
Media aritmética
Superficial
Profundo
N
90
63
MA±DT
107±74,9
47,6±36,1
N
90
63
MA±DT
0,0123±0,008
0,0096±0,0057
N
90
63
MA±DT
0,0198±0,0124
0,0194±0,0241
± Desviación típica
Mitosis en 30 CGA
Mitosis por celularidad total
Mitosis por celularidad campo a campo
Tabla 8: Medias aritméticas y desviaciones típicas correspondientes al recuento de mitosis
según componente tumoral.
Los resultados obtenidos de Ki-67 (MIB-1) (medias aritméticas) de los
casos cuantificados quedan expuestos en la tabla 9.
Variable
Recuento
Superficial
Profundo
N
84
59
MA±DT
590,9±151,1
239,9±113,4
N
84
59
MA±DT
19,9±9,0
12,3±8,0
N
84
59
MA±DT
20,0±10,2
11,9±9,0
MA ± DT*
Núcleos positivos en 30 CGA
Porcentaje de núcleos positivos
Porcentaje del área nuclear positiva
*MA= Media aritmética; DT= Desviación típica
Tabla 9: Cuantificación de la expresión Ki-67 (MIB-1) según componente tumoral.
66
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Cuando se correlacionaron variables continuas se observó claramente
que el componente superficial poseía mayor tasa de proliferación (recuento de
mitosis e inmunoexpresión de Ki-67) (Tabla 10).
Variables
Superficial
Profundo
p
Mitosis en 30 CGA
107± 74,9
47,6± 36,1
p< 0,001
MA* de mit en 30 CGA
1,8± 1,1
1,0± 0,6
p< 0,001
Mitosis por cel total
0,0123± 0,008
0,0096± 0,0057
p= 0,027
Mitosis c.a c.
0,0198± 0,0124
0,0194± 0,0241
N.S.
Núcleos + en 30 CGA
590,9± 151,1
239,9± 113,4
P=0,012
% núcleos +
19,9± 9,0
12,3± 8,0
p< 0,001
% área nuclear +
20,0± 10,2
11,9± 9,0
p<0,001
Mitosis
Cuantificación Ki-67
*MA de mit=Media aritmética de mitosis
Tabla 10: Prueba T student para variables de proliferación en cada componente.
La correlación de las variables proliferativas con el fenotipo de mucinas
puso de manifiesto un descenso evidente para el recuento de mitosis en el
subtipo gástrico con respecto al de célula intestinal. Pero la inmunoexpresión
de Ki-67 fue la inversa; posiblemente porque la mayor parte de la masa celular
en el subtipo gástrico esté en G0 y la del subtipo intestinal en G1-S-G2-M (Tabla
11).
67
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Variables de
Tipo G*
Tipo Cl*
Tipo O*
proliferación
N= 44
N= 32
N= 28
Ki-67% (MA±DT) **
44,1± 4,4
35,2± 3,5
45,9± 3,4
Mitosis %(MA±DT)
1,5± 0,4
4,1± 0,7
4,0± 0,7
* Tipo G: gástrico; Tipo CI: Célula intestinal; Tipo O: Tipo ordinario (o no clasificado), en donde no existe
expresión del fenotipo de mucinas definido.
** MA=Media aritmética. DT=Desviación típica.
Tabla 11: Relación entre el fenotipo de mucinas y las variables de proliferación (Ki-67 y
Mitosis).
La tinción se realizó en 77 de los 104 casos estudiados en la
diferenciación fenotípica (74%), (57 carcinomas avanzados y 20 precoces). En
25 casos (32%) de los cuantificados no se obtuvo inmunotinción. El análisis
cuantitativo de cada componente está reflejado en las tablas 12 y 13.
Variables
Casos positivos en 30 CGA
Porcentaje de núcleos positivos
Porcentaje de área nuclear positiva
Superficial
Profundo
N
77
51
MA±DT*
487,0± 151,1
261,6± 108,6
N
77
51
MA±DT*
18,0± 15,6
7,0± 8,1
N
77
51
MA±DT*
15,0± 15,3
4,9± 5,9
*MA= Media aritmética; DT= Desviación típica
Tabla 12: Cuantificación de la expresión MLH1 según componente tumoral.
68
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Variables
Casos positivos en 20 CGA
Porcentaje de núcleos positivos
Porcentaje de área nuclear positiva
Superficial
Profundo
N
77
51
MA±DT*
384,4± 115,1
240,6± 98,6
N
77
51
MA±DT*
12,0± 8,6
5,1± 7,1
N
77
51
MA±DT*
9,76± 13,7
3,7± 6,8
* MA= Media aritmética; DT= Desviación típica.
Tabla 13: Cuantificación de la expresión de MSH2 según componente tumoral
Los resultados del análisis estadístico de la inmunoexpresión de mlh1 y
msh2 en cada compartimento tumoral se correlacionaron con los parámetros
de proliferación. Estos resultados se expresan en la tabla 14 y ponen de
manifiesto una mayor expresión inmunohistoquímica en el compartimento
superficial que en el profundo, tanto para mlh1 como para msh2.
Variables
Superficial
Profundo
p
MA±DT*
MA±DT*
Núcleos + 30 CGA
484,0± 115,1
261,6± 108,6
<0,001
% núcleos +
18,0± 15,6
7,0± 6,1
<0,001
% área nuclear +
15,0± 14,3
6,0± 5,0
<0,001
Núcleos + 30 CGA
384,4± 115,1
260,0± 98,6
NS
% núcleos +
16,7± 13,5
8,6± 4,9
<0,004
% área nuclear +
13,7± 9,8
6,8± 3,7
<0,006
Cuantificación mlh1
Cuantificación nsh2
*MA= Media aritmética; DT= Desviación típica.
Tabla 14: Diferencias encontradas en la inmunoexpresión de MLH1 y MSH2 en cada
compartimento.
69
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
En el compartimento superficial existía correlación entre la cuantificación
inmunohistoquímica y la expresión de Ki-67, pero en el plano profundo la
relación es menos consistente.
Las diferencias entre las tres categorías de inmunoexpresión de mlh1 y
msh2 se expresan en la tabla 15.
Variable
Categoría
MA±DT**
TMN*
% de núcleos Ki-67+
% del área nuclear +
I
23,24± 9,83
II
29,87± 11,02
III
33,58± 9,85
I
16,55± 9,03
II
23,40± 11,29
III
27,45± 10,41
*TMN: Sistema de estadificación tumoral aceptado por la UICC y el AJCC. Basado en la extensión del
tumor (T), extensión de la diseminación a ganglios linfáticos (N) y presencia de metástasis (M). A mayor
número (I, II y III), mayor tumor y/o diseminación del cáncer a los ganglios linfáticos vecinos y/o a órganos
adyacentes al tumor primario.
**MA= Media aritmética; DT= Desviación típica
TABLA 15: Descriptiva de valores de las variables usadas para análisis de varianza.
La división inicial de la inmunoexpresión de mlh1 y msh2 en tres
categorías requirió, para su comparación, realizar análisis de varianza para
cada componente topográfico. Para el componente superficial las variables de
proliferación estadísticamente significativas que diferenciaban cada categoría
eran: porcentaje de núcleos positivos y área nuclear de Ki-67+.
Las diferencias más notables para la expresión de Ki-67 en el
componente superficial se encontraron entre las categorías I y III ( p= 0,003).
70
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Por último, cuando se realizó la correlación entre el fenotipo de mucinas
y la expresión de mlh1 y msh2, aunque no se encontraron diferencias
significativos, si fue llamativo encontrar mayor número de casos con expresión
de inestabilidad satélite con respecto al subtipo gástrico que al subtipo de
célula intestinal, lo cual podría sugerir que este tipo de inestabilidad genética
puede estar más en relación con el subtipo gástrico que con el intestinal
(Tabla16).
Tipo G*
Tipo Cl*
Tipo O*
p
N= 43
N= 33
IMS**
28 (65,1%)
19 (57,5%)
18 (66,6%)
NS***
Mlh1
13
13
10
Msh2
15
6
8
* Tipo G: gástrico; Tipo CL: célula intestinal; Tipo O: Tipo ordinario (o no clasificado), en donde no existía
expresión fenotípica de mucinas definida.
**IMS: expresión fenotípica de mucinas.
***NS: No definida.
Tabla 16 Relación entre fenotipo de mucinas y expresión de MLH1/MSH2.
V. DISCUSIÓN
V.I. Fenotipo de mucinas
La diferenciación fenotípica de mucinas se encuentra frecuentemente en
enfermedades inflamatorias (Hollingsworth y Swanson 2004; Moniaux y col.,
2004) y diferentes neoplasias epiteliales, incluyendo el CG (Katsuyama T y
col., 1985; Tatemarsu M y col., 1990; Akamatsu T y Karsuyama T, 1990),
carcinoma ductal pancreático (Matsuzawa k y col., 1992) y adenoma velloso del
71
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
colon (Ota H y col., 1993).
Excluyendo la última lesión, los carcinomas
expresan, por lo general, fenotipos de mucina de tipo gástrico.
Existen
estudios (Tsukashita y col., 2001; Tajima y col., 2001; Shiroshita y col., 2004 y
Lee y col., 2001) recientes que demuestran que los patrones de expresión de
mucinas en los tumores gástricos incluyen no solo fenotipos intestinal sino
también gástrico y mixto (gástrico e intestinal), sugiriendo que los análisis de la
expresión de mucinas pueden ayudar en la diferenciación de los adenomas de
los adenocarcinomas bien diferenciados.
Tsukashita y col., (2001) añaden que el estadio temprano de un
adenocarcinoma bien diferenciado puede expresar ambos fenotipos de mucina,
gástrico e intestinal, de acuerdo con la inferencia de que puede producirse un
cambio en el fenotipo de mucinas según la progresión de un tumor gástrico. De
acuerdo con esto, Minematsu y col. (2006) demostraron que la inmunotinción
para fenotipos de mucina puede ser útil para realizar un diagnóstico exacto en
pacientes con lesiones gástricas tipo III según la clasificación de la Sociedad
Japonesa de Investigación para el Cáncer Gástrico. Ésta clasificación
establece pautas para el diagnóstico de biopsias. Las lesiones incluidas en el
grupo III de ésta clasificación son lesiones tumorales en los bordes del tejido
con un difícil diagnóstico en base a desórdenes celulares e histológicos
(JRSGC, 1995 y Katsube y col., 2005). Además esta diferenciación fenotípica
de mucina es considerada por Lee y col. (2009) como un buen factor pronóstico
independiente y también unido al estadio tumoral y la edad del paciente.
Este tipo de diferenciación es particularmente importante para entender
el CG, porque normalmente, esto ocurre casi exclusivamente en el tejido
tumoral intramucoso de CG avanzados y precoces y, un disturbio en esta
72
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
estructura de diferenciación, puede propiciar la invasión de tejido tumoral por
debajo de la muscularis-mucosae y expandirse por la submucosa. El uso de
técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas junto con marcadores de
proliferación, puede hacer que este estudio aporte algunas claves para explotar
este proceso. La distribución del compartimento proliferativo tumoral se ha
estudiado mediante la cuantificación de la expresión inmunohistoquímica de un
marcador ligado al ciclo celular, el antígeno Ki-67.
El presente estudio empleó como marcador de mucinas del epitelio
superficial y foveolar la tinción con MUC5AC y con MGH (en los tumores,
además se incluyó el CEA por estar presente en el borde luminar del epitelio
superficial gástrico aparentemente normal). Descartamos la Galactosa oxidasa
con Tionina fría de Schiff por lo engorroso de su proceder. Generalmente
utilizamos una tinción dual o triple cuando a la tinción dual le siguió un marcaje
de células proliferativas con Ki-67. La utilidad de esta secuencia de tinciones
histoquímicas e inmunohistoquímicas parece evidente, ya que se han obtenido
resultados consistentes en un material fijado en formaldehído al 10% y sin
tamponar. Según Watanabe y col. (2003), para determinar el fenotipo de
mucinas en los CG es necesario la combinación de dianas antigénicas unidas a
lectinas como por ejemplo, inmunotinciones con MGH o MUC5AC y MUC6 con
Con A, esencial para determinar el fenotipo de mucina gástrico y la
combinación de MUC2 y CD10 para el fenotipo de mucina intestinal. La
expresión ectópica de MUC2 parece que ocurre en la metaplasia intestinal de
la mucosa gástrica (Correa, 1988) y se caracteriza con una mucina intestinal de
células caliciformes (Tytgat y col., 1994; Ajioka y col., 1997) y se detecta en
tejidos colónicos normales y malignos (Zhang y col., 2011). Los epitopos de
73
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
oligosacáridos son relativamente estables y persisten en su antigenicidad
incluso bajo condiciones adversas. La triple tinción MUC5AC/MGH-Ki67-OxRed-ConA, nos permitió confirmar fenotipos de células potencialmente
proliferativas.
Basándonos en actividades histoquímicas e inmunohistoquímicas
demostramos que las células del CG podrían ser clasificadas en siete grupos
independientemente del patrón de crecimiento del carcinoma, que son: células
mucosas de superficie, células mucosas glandulares, células caliciformes,
células absortivas, células de Paneth, células del carcinoma microquímico (en
“anillo de sello”) e inclasificados. Las células similares a las parietales o a las
principales no se encontraron ni en el carcinoma intestinal ni en el difuso. Estos
resultados son similares a los obtenidos por otros autores (Tatematsu m y col.,
1990). Nuestros resultados indican que los fenotipos gástricos en el CG son,
fundamentalmente, de tipo mucosa pilórica (o antral). Las células tumorales
tipo células de Paneth han sido descritas en el CG tipo intestinal (Tahara E y
col., 1982; Ohtani H y Sasano N, 1988). Estas células con citoplasma granular
y positivas a lisozimas también se encontraron en el tipo difuso. La incidencia
de células tumorales tipo células de Paneth no difiere significativamente entre
los dos tipos de carcinoma.
En este trabajo se clasifica la diferenciación fenotípica de mucinas en
dos tipos principales: tipo gástrico y tipo metaplásico-intestinal. Akamatsu y
Karsuyama (Akamatsu T y Katsuyama T, 1990) clasificaron los patrones de
diferenciación de fenotipo de mucinas en tres subtipos: completa, incompleta e
invertida. Estos subtipos se corresponden con nuestras denominaciones de
subtipo pilórico (o antral), foveolar y de células mucosas glandulares. Estos tres
74
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
subtipos de diferenciación se encontraron frecuentemente en el CG de tipo
difuso y están caracterizados por su expresión de mucinas de células mucosas
de glándulas gástricas.
De acuerdo con el estudio de Lee y col. (2009) basado en el análisis de
106 muestras de adenocarciomas gástricos primarios, el 60% de los cánceres
gástricos bien diferenciados expresaron el fenotipo de mucinas intestinal y el
42,4 % de los cánceres gástricos pobremente diferenciados el fenotipo
gástrico. Además, la mayoría (80%) de los cánceres con fenotipo de mucinas
gástrico eran pobremente diferenciados y el 64,4 % de los de fenotipos de
mucina tipo intestinal eran bien diferenciados. Todo esto concuerda con
análisis previos (Williams y col. 2001) dónde el fenotipo de mucinas gástrico
está relacionado con una alta tasa de indiferenciación comparada con el
fenotipo de mucinas tipo intestinal. Sin embargo, a pesar de la buena
correlación entre el fenotipo de mucinas y la clasificación histológica, no
coinciden completamente el uno con el otro, es decir, el 40% de los cánceres
bien diferenciados expresan fenotipo de mucinas no intestinal y el 57,6% de los
cánceres pobremente diferenciados expresaron fenotipo de mucinas no
gástrico. Al igual que el 45,5% de los tumores tipo intestinal en la clasificación
de Lauren, también expresaron fenotipo de mucinas no intestinal y el 59,7% de
los tumores tipo difusos según clasificación de Lauren, también expresaron
otros tipos que el fenotipo de mucinas gástrico. Esto sugiere que existen
diferentes mecanismos que pueden afectar a la histogénesis de mucinas del
adenocarcioma gástrico. Además podría ser necesario clarificar el significado
de cada una de las expresiones fenotípicas de mucinas y la histogénesis del
adenocarcinoma gástrico (Lee y col. 2009).
75
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
El tipo metaplásico intestinal de diferenciación solamente se encontró en
el CG tipo intestinal. En más del 50% de los CG tipo intestinal, nosotros
observamos fenotipos gástricos y 15 casos de CG tipo intestinal pertenecían al
primer grupo de diferenciación fenotípica. El término “tipo intestinal” debe ser
entendido como el nombre de un grupo y, por lo tanto, no indica que las células
del carcinoma expresen obligatoriamente un fenotipo intestinal. El significado
clínico patológico no está recogido en la literatura y está sin aclarar. Nosotros
aunque los relacionamos con la extensión de la metaplasia intestinal pensamos
que el fenotipo de metaplasia intestinal completa está en relación con una
superficie mayor de intestinalización de la mucosa gástrica y además de tipo
completo; mientras que el carcinoma gástrico tipo intestinal con subtipo gástrico
está en relación con una superficie menor de intestinalización de la mucosa
gástrica y el tipo completo e incompleto (Rivera F y Rubio C, 1993).
El patrón de distribución de células Ki-67 positivas mostró similitud con el
exhibido por las células en la mucosa gástrica no neoplásica. En el tejido
tumoral intramucoso con subtipo pilórico, las células Ki-67 positivas se
agruparán en la zona de unión entre la foveola y el inicio de la estructura
glandular. Esta estructura, contrapartida neoplásica de la mucosa pilórica con o
sin metaplasma intestinal. Pero en el tejido tumoral intramucoso con
diferenciación tipo metaplásico intestinal, las células Ki-67 positivas tienden a
agruparse en el tercio más inferior de la estructura tumoral intramucosa. Esto
refleja la distribución de células proliferativas en la metaplasma intestinal
completa (Hattori T. 1986).
Akamatsu y Katsuyama (Akamatsu T y Katsuyama T. 1990), observaron
que la laminación del componente intramucoso existía también, en menor
76
Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
medida, cuando el carcinoma se extendía bajo la musculares mucosae, cuando
afectaba a la submucosa. Pero desaparecía en la muscular propia, por lo que
sugirieron que posiblemente la desaparición estaba en relación con una mayor
agresividad tumoral. Nuestros resultados confirman que la pérdida física de la
diferenciación fenotípica se correlaciona con nuevas poblaciones de células
tumorales
que
no
tienen
esta
capacidad
de
organización,
aunque,
curiosamente, conservan la funcional, y por ese motivo el IP ligado al Ki-67 es
menor en profundidad que en superficie.
El carcinoma difuso, es considerado una forma poco diferenciada de CG,
pero si es capaz de expresar una diferenciación fenotípica en el compartimento
intramucoso, se debería considerar como estructural y funcionalmente bien
diferenciado, mientras sea posible observar esta estructura.
Sugerimos que debería ser reconocida por los patólogos porque puede
ser un marcador de diagnóstico precoz, sobre todo en las formas difusas en
donde no se reconocen lesiones histológicas precursoras de malignidad.
V.II. Diferencias proliferativas por compartimentos topográficos
Existen dos compartimentos de estructura tumoral en los CG; el área
superficial y el área profunda o músculo invasiva. La proliferación celular en el
compartimento topográfico superficial es mayor que en el profundo.
Cabría pensar que los compartimentos superficiales representan las
fases más precoces del desarrollo tumoral y los profundos, los más avanzados.
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Esto está apoyado por la pérdida de las correlaciones fisiológicas de
parámetros proliferativos en compartimentos profundos. Tradicionalmente se
ha admitido que los tumores más avanzados presentan mayores tasas de
proliferación, lo que contradice nuestros resultados. Sin embargo, si
consideramos que tanto la infiltración como la replicación celular utilizan
elementos del citoesqueleto celular, no sería lógico pensar que ambos
fenómenos sean eficientes simultáneamente en el mismo compartimento.
La carcinogénesis es un proceso que se establece a través de múltiples
etapas, con cambios fenotípicos y genéticos. Entre los fenotípicos destacan el
crecimiento excesivo, la infiltración local y la capacidad de metastatizar, las
células neoplásicas tienen un comportamiento anormal caracterizado por un
crecimiento desordenado que sobrepasa los mecanismos de control fisiológico,
con tendencia a invadir, localmente o a distancia, otros órganos. Esto es el
resultado de fallos en procesos de división/diferenciación y apoptosis como los
mecanismos que conservan la integridad genómica y defectos en la reparación
del ADN (Squire JA y col., 1998). En tejidos adultos, el tamaño de una
población celular depende de los índices de proliferación y diferenciación,
además de la muerte de células por apoptosis (McCarthy NJ y col., 1992).
La capacidad proliferativa tumoral y su relación con otras variables en el
CG, considerando áreas topográficas diferentes ha sido escasamente tratado
en la literatura (Ramires M y col., 1997; Nakamoto y col., 2007). Taniyama y
cols en 1993, en carcinomas de colon y recto, diferenciaron dos áreas dentro
de cada tumor, una superficial y otra profunda, encontrando menor grado de
diferenciación y distintos índices proliferativos en el borde invasivo de 28
carcinomas colorectales moderadamente diferenciados. Palmqvist y cols en
78
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
1998, también estudiaron en 109 carcinomas colorectales los índices de
proliferación celular mediante bromodeoxiuridina (BrdU), Ki-67 y citometría de
flujo. Separaron dentro de cada tumor dos compartimentos distintos: superficial
y profundo. Los resultados pusieron de manifiesto diferencias entre ambos
compartimentos tumorales.
Esta misma metodología se ha utilizado en otros tejidos orgánicos
distintos al colon y al recto. Ruiz-Cerdá y cols en 1999, encontraron
discrepancias en el análisis de la plordía mediante citometría de flujo en
distintas áreas dentro de los carcinomas de células renales. En la próstata,
Koch y cols., 2000, encontraron que los tumores no diploides se caracterizaban
por una mayor desdiferenciación y presentaban y presentaban un estadio de
enfermedad más avanzado, además de la heterogeneidad histológica en
distintas áreas del mismo espécimen.
En el carcinoma de células transicionales de vejiga urinaria y en el
melanoma cutáneo, se han demostrado diferencias tipográficas entre los
comparitimentos superficial y profundo, con predominio de proliferación en
superficie y de la capacidad cinética en profundidad (Blades A y col., 1999 y
2002). Se hizo patente la necesidad de definir la frontera entre cada
compartimento. En la vejiga fue la zona de la musculares mucosae y en el
melanoma se estableció una profundidad de 0,75 mm. El resto de trabajos
consultados tratan básicamente el tumor como un todo homogéneo sin áreas
con distintas actividades proliferativas.
Desde nuestro punto de vista, la muscular propia es la zona que ejerció
como frontera.
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Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Nuestros resultados sugieren que la expresión de mlh1 y msh2 y los
parámetros proliferativos encontrados en el compartimento superficial serían
compatibles con daño genético reparable, o así lo interpretaría el sistema de
reparación post-replicación, el incremento de mitosis y Ki-67 serían
dependientes de la expresión adecuada de mlh1 y msh2, a diferencia del daño
genético no reparable.
El compartimento profundo en nuestra serie de CG mostró un descenso
de mitosis, que podría explicarse por un bloqueo de las fases del ciclo G2 y M,
posiblemente por vías alternativas e independientes de mlh1/msh2 (disminuyen
su expresión a este nivel). Dicho bloqueo y la posible actuación de mecanismos
alternativos se desencadenarían como consecuencia de daños genéticos
mayores y el sistema MMR no podría reparar estos daños en el ADN.
El descenso de Ki-67 (fases G1+S+G2+M) y mitosis (fase M) en el
compartimento profundo y el mantenimiento del índice proliferativo (fases
G1+S+G2+M) (tabla 10) podría ser debido a un incremento de células en G0.
La elección de la muscular propia como límite no ha sido utilizada en los
CG hasta ahora. Los escasos trabajos sobre análisis topográfico (Ramires M y
col., 1997) de proliferación tumoral en CG y no utilizaron un límite definido entre
áreas.
Como han demostrado diferentes estudios (Osterheld M-Ch y col., 1998;
Compton C y col., 2000), el factor pronóstico más importante es la extensión
del tumor. En ella juega un papel muy importante la filtración tumoral de la
muscular propia (Osterheld M-Ch y col., 1998).
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Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
Nuestros hallazgos podrían ser de utilidad terapeútica en pacientes con
CG. Actualmente el tratamiento de elección sigue siendo quirúrgico. Una vez
definido el estadio patológico, replantea, en algunos casos, la conveniencia o
no de un tratamiento postoperatorio o adyuvante a fin de controlar la
enfermedad mocrometastásica. En pacientes con estadios I y II, la cirugía suele
ser suficiente, aunque el seguimiento de recidiva y metástasis es obligatorio en
la mayoría de los casos. El tratamiento adyuvante es beneficioso en la mayoría
de pacientes de estadio III, el uso de radioterapia preoperatoria es capaz de
disminuir más las tasas de recidivas locales, ganando aceptación como
tratamiento complementario en pacientes con tumores localmente avanzados y
estatificados con resonancia magnética (Cervantes A y col., 2003). Si como
hemos demostrado los CG poseen distinto comportamiento en proliferación y
de expresión de proteínas para la reparación de ADN, dependiendo de su
topografía, se podría ayudar a mejorar el diseño de tratamientos locales
(tumores superficiales responderían mejor a dosis menores).
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Juan José Fernández Gutiérrez
ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
GÁSTRICO
VI.
Conclusiones
1. En los CG se definen dos compartimentos (biológicos y topográficos):
a) Por encima de la muscular propia con proliferación celular elevada,
expresión no defectuosa de mlh1/msh2 y diferenciación organizativa
que sugieren una correlación fisiológica conservada y daño genético
reparable.
b) Por debajo, con proliferación celular disminuida, expresión defectuosa
de mlh1/msh2 y ausencia de diferenciación organizativa que sugieren
una fase avanzada del desarrollo tumoral y daño genético no reparable.
2. La pérdida física de la diferenciación fenotípica se correlaciona con la
presencia de nuevas poblaciones celulares que no tienen esta
capacidad de organización, si bien conservan la funcional.
3. El reconocimiento de la estructura organizativa puede ser un marcador
de diagnóstico precoz, sobre todo en las formas difusas de CG, donde
no se reconocen lesiones histológicas precursoras de malignidad.
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ANÁLISIS TOPOGRÁFICO DE PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN EN EL CARCINOMA
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