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Tema IV.
Genética
BacterialBacteriana
Genetics
La Genética Bacteriana ha contribuido al desarrollo de
conceptos en Genética y Biología Molecular:
- El DNA contiene la información genética.
- Desciframiento del código genético
- La naturaleza de las mutaciones como cambios en
secuencias de nucleótidos en el DNA
- Estudio de los procesos de replicación del DNA, de
transcripción y traducción
- Regulación de la expresión genética (represores,
activadores)
Tema IV.
Genética Bacteriana
¿Por qué podemos hablar de Genética Bacteriana?
• Las bacterias son haploides (Un cromosoma)
– No hay alelos dominantes y recesivos.
• Se reproducen de manera asexual
Sin embargo, hay una alta diversidad genética:
Se encuentra en una población resistencia a antibióticos,
resistencia a bacteriófagos, diversidad metabólica (síntesis
de aminoácidos, vitaminas etc.)
La principal fuente de variabilidad genética en bacterias es la
mutación.
¾ Mutación “espontánea”: cambios que ocurren durante la duplicación
del DNA
¾ Mutación inducida: cambios que ocurren por daño al DNA
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Mutación “espontánea”: cambios que ocurren durante duplicación del DNA
Cadena de
Sin corrección
del error
DNA “nueva”
Siguiente ronda
de replicación
Cadena de
DNA molde
Corrección
del error
Mutación inducida: cambios que ocurren por daño al DNA
Desaminación oxidativa del DNA
Una hipoxantina se aparea con una citosina
Tasa de mutación en E. coli
Escherichia coli
Genoma: 4.4 x 106 pares de bases. La replicación del genoma
implica la polimerización de 8.8 x 106 nts
La DNA polimerasa que replica el genoma de E. coli, en
cooperación con otros mecanismos, comete un error cada 1010
nucleótidos incorporados.
Si cada genoma implica la incorporación de 8.8 x 106 nts, habría
un error aprox. cada 1136 divisiones (1010 / 8.8 x 106)
Un mL de un cultivo de bacterias en fase exponencial tiene:
1 x 109 células. Como habría un error cada 1136 replicaciones,
si se dividen todas las células, 1 x 109 / 1136 = 8.8 x 105
mutaciones en una generación.
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Experimento de Luria y Delbrück. Prueba de fluctuación
Escherichia coli sensible a
bacteriófagos
Diluir el cultivo
Inocular el
cultivo con el
fago
Determinar el número
de colonias resistentes
al fago:
Muchos subcultivos
Inocular y determinar el # de
colonias resistentes al fago:
67/ 159/ 117/ 291/75/ 135/ 220/ 0
142/ 146/ 155/ 140/
132/ 123/138/149
Experimento de Luria y Delbrück. Prueba de fluctuación
La resistencia al bacteriófago se debe a mutaciones en algún(os)
gen(es) de la bacteria.
Se observa mayor variabilidad en el número de colonias
resistentes al fago en los cultivos independientes: las mutaciones
ocurren espontáneamente, en ausencia del bacteriófago.
La alta variabilidad se
explica porque en cada
cultivo, la mutante
resistente se dio en
distintas generaciones.
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Genética Bacteriana. Análisis fenotípico en bacterias.
AUXOTROFÍA
Las cepas silvestres son protótrofas (crecimiento en medio
mínimo), se pueden identificar mutantes incapaces de sintetizar
algún metabolito esencial, por lo que este debe ser añadido al
medio (bio-, arg-, met-, ad-)
FUENTE DE ENERGÍA
Capacidad de las bacterias para utilizar determinados
sustratos como fuentes de energía, generalmente carbohidratos
(galactosa; gal-/gal+, lactosa; lac-/lac+, melobiosa,
RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS
Capacidad de crecen en presencia de inhibidores, como
antibióticos (estreptomicina, ampicilina, kanamicina, etc.
strR/strS; ampR/ampS
Otras características como morfología colonial y pruebas
bioquímicas también se emplean.
Experimento de Lederberg y Tatum
E. coli
E. coli
Medio
mínimo
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Experimento de Lederberg y Tatum
Medio mínimo
Se requiere contacto físico entre las bacterias para que ocurra
este intercambio
Mecanismos mediante los cuales las bacterias
adquieren nueva información genética
• Transformación
• Conjugación
• Transducción
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1. TRANSFORMACIÓN
En la transformación,
DNA exógeno es
introducido a la célula e
incorporado al DNA
cromosomal por
recombinación.
.
El DNA se une a un
receptor en la superficie de
la célula
Una nucleasa extracelular
corta el DNA en
fragmentos más pequeños.
Una de las cadenas es
degradada y la otra cadena
es transportada al interior
de la célula
La cadena de DNA se
alinea con una región
homóloga en el cromosoma
bacteriano.
La cadena de DNA se
incorpora al cromosoma
bacteriano por
recombinación homóloga.
Reparación de DNA.
Célula transformada
El transporte del DNA del medio extracelular al citoplasma es un
proceso muy complejo que todavía no está bien entendido.
Se requieren proteínas que están involucradas en los sistemas de
secreción, así como de una translocasa de DNA en la membrana.
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CONJUGACIÓN
Escherichia coli tiene dos tipos de células: donadores/machos y
receptoras/hembras. La diferencia radica en la presencia del plásmido F
(plásmido sexual/ factor de Fertilidad) F+/FEl plásmido F contiene unos 100 genes, algunos de ellos codifican
proteínas involucradas en la replicación del DNA. Otros genes codifican
proteínas tubulares que forman el pilus.
Conjugación es el proceso de apareamiento de bacterias mediante
el cual se transfiere información genética. Involucra el contacto
físico entre bacterias (F+ y F-)
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La célula F+
sintetiza el pilus
Conjugación
El pilus entra en
contacto con la
célula FEl plásmido es activado para
transferencia cuando una
endonucleasa corta una
cadena en el origen de
transferencia
El pilus se retrae
causando que las céls.
donadora y receptora se
unan. El plasmido F se
transfiere como DNA de
cadena sencilla
La cadena
complementaria de
ambos plásmidos se
sintetiza
Conjugación. Apareamiento entre bacterias (F+ y F-)
La célula F+ inicia la conjugación al
sintetizar y extender el pilus que se
adhiere a la superficie de la célula FEl pilus se retrae y acerca a las dos
células.
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Una de las cadenas del DNA F es
cortada y se separa de la otra cadena.
Se transfiere esa cadena a la otra
célula, mientras que se comienza a
replicar el DNA de la cadena que se
quedó en la célula F+
La cadena de DNA recién
transferida también se replica.
Las dos células contienen un
plásmido F integro, por lo que
ambas son F+
Células Hfr (high frequency recombination).
Cepas de Escherichia coli que son muy eficientes en transferir genes
cromosomales.
• Las cepas Hfr resultan de la integración del factor F al cromosoma.
Episoma. Fragmento de DNA que
puede existir como plásmido y que se
puede integrar al cromosoma.
Integración del Factor
F al cromosoma
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Células Hfr (high frequency recombination). Otra propiedad
que tiene el plásmido F es su capacidad de integrarse al
cromosoma bacteriano, incrementando el tamaño de éste.
La célula Hfr mantiene su
capacidad de conjugación,
por lo que se puede aparear
con una célula F-
Ocurre transferencia de material
genético, sin embargo, no se
transfiere el cromosoma completo
pues las células se separan. La
secuencia correspondiente al plásmido
F no se transfiere.
Como se transfirió un fragmento del
DNA cromosomal, hay homología
con el cromosoma de la célula
receptora y ocurre recombinación
con alta frecuencia (Hfr)
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F– now lac+ pro–
Hfr Conjugation
order of transfer is lac+ –
pro+
F– now lac+ pro+
Figure 6.5b
CONJUGACIÓN F’
En células Hfr ocurre con baja frecuencia que F se escinda del
cromosoma y forme un plásmido circular nuevamente. Cuando
esto ocurre, F acarrea consigo genes adyacentes del cromosoma
que ahora se encuentran formando parte del plásmido F.
Entonces, a éste se le llama plásmido F’.
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CONJUGACIÓN F’
Los plásmidos F’ también pueden
ser transferidos por conjugación
Con esta transferencia se pueden
crear células diploides parciales
(merocigotos).
Una característica importante del apareamiento Hfr / F- es que la
transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a
partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está
insertado el episoma F.
Esta propiedad permite controlar la cantidad de información
genética transferida y mapear la posición de los genes
transferidos con respecto a la secuencia F de acuerdo al tiempo
de conjugación.
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Mapeo de genes en E. coli por conjugación
• El tiempo que se requiere para que los genes entren en la
célula receptora está asociado con el ordenamiento en el
cromosoma bacteriano.
• El cromosoma Hfr es transferido linealmente a la célula F
receptora.
-
• Si se interrumpe la conjugación a distintos tiempos ocurrirán
transferencias parciales de los genes.
• El orden de los genes a lo largo del cromosoma se puede
deducir al determinar los genes transferidos durante
apareamientos cortos y comparados con apareamientos largos.
Experimento de Conjugación a tiempos
controlados.
Cepa Donadora Hfr: thr+; leu+; azis; tons;
lac+; gal+; strs
Cepa receptora (F-): thr-; leu-; azir; tonr;
lac-; gal-; strr
1. Poner en contacto a las dos cepas
2. Interrumpir por agitación la
conjugación a distintos tiempos
3. Sembrar en medio con streptomicina
(elimina a la cepa donadora)
4. Evaluar el fenotipo de las bacterias
conjugantes
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Resultados del Experimento
Tiempo de
conjugación
(min)
% de colonias que sobreviven con los
genotipos indicados
thr+leu+
azis
tons
lac+
gal+
Mapa genético del cromosoma de Escherichia coli
Punto de inicio
Las unidades son
minutos. Se refiere al
tiempo que tardan los
genes en entrar a una
bacteria F- receptora
durante el experimento
de conjugación
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TRANSDUCCIÓN. Transferencia de material genético entre
bacterias a través de un bacteriofago.
Se adsorbe a la superficie de una bacteria susceptible, penetra el
ácido nucleico del fago, se replica su DNA, se expresan los genes
del fago, se sintetizan las proteínas y se ensamblan nuevas
partículas virales.
Clasificación de fagos por su estructura.
Icosahédricos sin cola (φX174)
Icosahédricos con cola (λ)
Filamentosos (M13)
Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside
de proteína
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Ciclo lítico de un bacteriófago.
1. El bacteriófago se adhiere a la superficie
de la bacteria.
2. El DNA del bacteriófago penetra a la
célula.
3. Se sintetiza el DNA
y proteínas del
bacteriófago.
4. Se ensamblan los
componentes del
bacteriófago formando
nuevas partículas.
Ciclo lítico de un bacteriófago.
5. La célula se lisa y
se liberan las
partículas virales
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Integración del DNA del fago al
cromosoma bacteriano
El cromosoma del bacteriófago
lambda (λ) en estado libre es circular.
El sitio de integración λ es una región
del cromosoma que se alinea en un
sitio del cromosoma bacteriano (entre
los genes gal y bio).
Ocurre un entrecruzamiento recíproco
entre el fago circular y el cromosoma
bacteriano resultando en la
integración. Esta integración es
mediada por los genes del
bacteriofago y no por el sistema de
recombinación de la bacteria.
Al DNA del fago integrado al
cromosoma se le llama profago.
Ciclo lisogénicode un bacteriófago.
Inducción
del ciclo
lítico
La escición del DNA
del fago acarrea
DNA cromosomal
TRANSDUCCIÓN
Replicación
del fago
Lísis celular y
liberación del fago
La célula receptora
adquiere nuevos
genes.
El fago infecta a la
Integración del DNA del
fago al cromosoma
célula receptora
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Cromosoma
bacteriano
Los fagos se
adhieren a la
superficie
celular
El fago
inyecta DNA
al citosol
CICLO
LÍTICO
Lisis celular y
liberación de
nuevos fagos
Síntesis de
muchos
fagos nuevos
Los fagos virulentos solamente
siguen el ciclo lítico
El DNA del fago
se escinde del
cromosoma
CICLO
LISOGÉNICO
El DNA del
fago se
integra al
cromosoma
El profago
puede
permanecer en
estado
dormante por
mucho tiempo
(generaciones)
Los fagos atemperados pueden
alternar el ciclo lítico y el
lisogénico
Plásmidos.
Son moléculas de DNA circulares extracromosomales que se
encuentran en la mayoría de las bacterias y en algunas células de
eucariontes.
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Muchos plásmidos usan la misma maquinaria de replicación del
DNA cromosomal y contienen un origen de replicación que es
reconocido.
En general, los plásmidos se clasifican en aquellos que se
encuentran en un bajo número de copias por célula (1-10) y los
que están presentes en un alto número de copias (10-100).
Los plásmidos autoregulan su número de copias a través de un
represor (proteína o RNA) que impide que se repliquen muchas
copias del plásmido.
Estos represores también pueden actuar sobre otros plásmidos
relacionados, excluyéndolos así de la célula.
Los plásmidos codifican una diversidad importante de funciones
que le permiten a la bacteria que los contiene sobrevivir en
tipos de habitats muy variables.
1. Propiedades de Resistencia.
•
Antibióticos (aminoglicósidos, cloramfenicol, β-lactamas)
•
Metáles pesados (Hg, Ni, Co, Pb, Cd, Bi)
•
Aniones tóxicos (arsenato, arsenito, boratos, cromatos)
2. Propiedades metabólicas.
•
Producción de bacteriocinas
•
Metabolismo de carbohidratos
•
Metabolismo de compuestos carbonados
3. Factores que intervienen en la interacción con hospedero.
•
Enterotoxina y hemolisinas (Escherichia coli)
•
δ- endotoxina (Bacillus thuringiensis)
•
Neurotoxina (Clostridium tetani)
•
Infección y nodulación de leguminosas (Bradirhizobium sp.)
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Mecansimos de resistencia a antibióticos y su
transmisión
Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram- (capa de
LPS). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en
plásmido o en cromosoma.
Modificación e inactivación del antibiótico. β-lactamasa, enzimas
modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa.
Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con menor afinidad
por las β-lactamas.
Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a
sulfonamidas.
Transposones
• La transposición es otro tipo de recombinación de
DNA en el cual un elemento transponible o
transposón se mueve de una molécula de DNA a
otra.
Fueron descubiertos originalmente en maíz por
Barbara Mc Clintock, y su presencia se ha
documentado también en otras especies, desde
bacterias a humanos.
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Transposones
El tamaño de los transposones varía entre 103 a 104 pb
dependiendo del tipo de transposón.
La secuencia integra del transposón se puede insertar en un sitio
particular del cromosoma.
La transposición involucra recombinación entre secuencias no
relacionadas que son los extremos flanqueantes del transposón y
el sitio del cromosoma donde se insertó.
Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y
une los extremos del transposón.
Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de
reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son
invertidas, son idénticas.
Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una
ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún
antibiótico. KanS Æ KanR
Transposón Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb.
Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp.
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Mecanismo de Transposición (Tn5)
Unión de la transposasa a la región flanqueante
Formación del asa (complejo sináptico). Los
extremos del transposón se acercan.
Corte del DNA y escición del transposón
Unión del transposón al DNA blanco
La transposasa cataliza la inserción del
transposón al DNA blanco.
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