Download Conjugación - Bioquimexperimental

CONJUGACION
OCTUBRE 2013
Conjugación. Un poco de historia
• La evolución
biológica está
basada en: la
variación genotípica
de los individuos, y
la selección que
favorece a esos
individuos y que les
permite prosperar
como una nueva
especie, o competir
y desplazar al
organismo precursor.
Conjugación
• Cuando Darwin
bosquejó estos
principios básicos, los
conocimientos de
genética eran aun muy
escasos (Mendel
acababa de describir los
fundamentos de la
herencia apenas unos
años antes).
Conjugación
• Cuando empezamos a
entender las bases
moleculares de la
biología, las
mutaciones se
concibieron como la
única fuente de
variación para los
organismos que se
reproducen
asexualmente, como
las bacterias
• La definición del papel de
las mutaciones en la
variación biológica empezó
con el trabajo de de Vries
en plantas, alrededor de
1900, y se hizo extensiva a
las bacterias gracias a
Beijerinck, ese mismo año.
Conjugación
• Tomó casi 30 años más el
descubrimiento de una
nueva y extraña forma de
variación, la transformación
de neumococos avirulentos
en virulentos.
• Y otros 16 años para que
Avery, MacLeod y McCarty,
tomando el trabajo pionero
de Griffith, descubrieran, de
paso, la función del DNA.
• En 1953, Lederberg y
Cavalli, y Hayes por
su cuenta, hallaron
el primer plásmido
conjugativo, el
"Factor F".
Conjugación
• Lentamente,
empezamos a
identificar otras
fuentes de variación
en las bacterias,
especialmente
aquellas derivadas
de la transferencia
horizontal de genes.
Transmisión
Vertical
Progenitor al
hijo
Horizontal
Transformación
Transducción
CONJUGACIÓN
• Una célula bacteriana toma DNA del ambiente
y lo incorpora.
• De manera natural en Gram +.
• Involucra presencia de fagos, los cuáles
transfieren el DNA de la célula donadora a la
célula receptora, la cual puede incorporarlo a
su cromosoma.
• Ciclo Lítico.
• Una célula bacteriana transfiere DNA a otra
célula bacteriana, por contacto directo célula
a célula.
• DNA transferido: Parte del genoma ó un
plásmido.
Descubrimiento de la conjugación
Necesidad de contacto directo entre
células
• ESTRUCTURA DE LOS PLÁSMIDOS.- Son típicamente moléculas de DNA
circular de doble cadena de un tamaño que va de 2 a 100KB. Estos
plásmidos están superenrrollados dentro de la célula.
• REPLICACIÓN DE PLÁSMIDOS.- Son capaces de replicarse
independientemente del cromosoma del huésped. Tienen un origen de
replicación ( Ori R). Dos modos de replicación: Replicación teta y
replicación por círculo rodante.
La replicación es central para controlar un número importante de
propiedades de los plásmidos: Rango de huéspedes; número de copias;
incompatibilidad y movilidad.
PROPIEDADES DE PLASMIDOS
• RANGO DE HUÉSPEDES: Si están limitados a un número limitado de
bacterias, se les llama de RANGO ESTRECHO.
Si son capaces de replicarse en un amplio rango de especies bacterianas,
se llaman de AMPLIO RANGO.
CONTROL DEL NÚMERO DE COPIAS DE PLÁSMIDO: Puede variar de 1 (
plásmido F) a algunos cientos (pUC18). El número es una propiedad de
cada plásmido y depende del mecanismo por el cual se regula su propia
replicación.
PROPIEDADES DE PLÁSMIDOS
• GRUPOS DE INCOMPATIBILIDAD: Si una célula contiene dos plásmidos
diferentes y cada uno tiene el mismo mecanismo de control de la
replicación, cada uno sería capaz de controlar la replicación del otro.
Como consecuencia uno de los dos plásmidos eventualmente se pierde de
la célula como resultado de la división celular.
• En este caso los dos plásmidos serían incompatibles.
• Cuando los plásmidos tienen diferentes mecanismos de control, se
replican independientemente uno de otro y durante la división celular
cada célula hija recibe una copia.
PROPIEDADES DE PLÁSMIDOS
• TRANSFERENCIA DE PLÁSMIDOS: Algunos plásmidos se pueden transferir
entre bacterias a través de la conjugación bacteriana. Estos plásmidos
codifican para todas las proteínas y funciones que se requieren para
movilizar y transferir de una célula huésped a una célula recipiente.
• Muchos plásmidos son incapaces de hacer esto.
• Ejemplo de plásmido
• FACTOR F ( FERTILIDAD)
Conjugación
• El pelo sexual F es un
cilindro hueco de
aproximadamente 20 µm de
largo, 8 nm de diámetro
externo y 2 nm de diámetro
interno, que es lo
suficientemente grande
para el pasaje de una
molécula de DNA simple
cadena. Este pelo está
formado por un única
subunidad proteica
denominada pilina que se
encuentra codificada por el
gen traA.
Conjugación
• El apareamiento efectivo entre
dos células donantes es impedido
por la exclusión de las superficies,
la que requiere de los productos
de los genes traS y traT
localizados en la membrana
citoplasmática y en la membrana
externa, respectivamente.
• la transferencia de DNA ocurre
después del apareamiento célulacélula que es estabilizado por los
productos de los genes traG y
traN.
Conjugación
•
•
•
•
El Factor F es transferido de la célula
donante hacia la célula receptora en
forma de simple cadena lineal con el
extremo 5' .
El nickeado (rotura) de una de las cadenas
del Factor F. Este Factor es nickeado en el
oriT por el producto del gen traI, y que se
mantiene unido al extremo 5' de la cadena
cortada.
La proteína TraI, que junto al producto del
gen traY tiene actividad de endonucleasa,
posee actividad actividad de helicasa y
ATPasa, y separa la cadena de DNA
conjugante durante la translocación
utilizando ATP.
el DNA simple cadena es protegido
durante la transferencia por las proteínas
SSB (Single Strand-Binding Proteins) tanto
en la célula donante como en la célula
receptora.
Conjugación
• La transferencia del
extremo 5' es acompañada
por la síntesis continua de la
cadena de DNA
complementaria en la célula
donante. Mientras que en la
célula receptora, el DNA
simple cadena transferido
sirve como templado para la
síntesis discontinua de la
cadena complementaria.
Conjugación
Las células pueden denominarse de diversas maneras en
relación al estado en que se encuentra el Factor F dentro
de ellas:
•
Células F-: Estas células no contienen al Factor F y no
transfieren ni genes F ni genes bacterianos. Son
eficientes células receptoras durante la conjugación.
•
Células F+: Estas células contienen al Factor F en el
citoplasma. Conjugación. La transferencia de genes
cromosomales ocurre con una muy baja frecuencia
cuando el Factor F se encuentra en este estado.
•
Células Hfr: Son células que contienen al Factor F
integrado al cromosoma. Pueden transferir marcadores
cromosomales con alta eficiencia desde un punto fijo del
cromosoma, generando un gradiente de transferencia
de marcadores.
•
Células F': Son células que tienen en el citoplasma al
Factor F asociado con ciertos segmentos del cromosoma
bacteriano. Pueden transferir al Factor F y a los
segmentos asociados del cromosoma con alta eficiencia,
y pueden mediar la transferencia de genes
cromosomales por su integración en regiones
homólogas del cromosoma.
• F+ y F-: Ambas células se vuelven F+
CONJUGACIÓN
• F+ y F+: Se inhiben por contacto
CONJUGACIÓN
• Hfr (alta frecuencia de recombinación): el plásmido
se integra al cromosoma bacteriano. Sigue siendo
donadora.
• Hfr y F-: no se transfiere el cromosoma completo, la
parte del plásmido F se escinde.
• F’: Se escinde el plásmido F y se lleva consigo
una parte del cromosoma. plásmido F’,
donador.
• F’ y F-: Se generan células diploides parciales , la
receptora se llama merocigoto y sigue siendo F-.
CONJUGACIÓN
• Similar a lo que ocurre con Gram -.
• Sistema Mpf, es más simple.
• E. faecalis secretan péptidos parecidos a feromonas
que estimulan la expresión de genes tra en las
bacterias vecinas.
¿Para qué?
• Resistencia: antibióticos,
metales pesados
• Colicinas y Bacteriocinas:
proteínas con actividad
antimicriobiana.
• Factores de virulencia:
Toxinas.
• Actividades metabólicas:
Síntesis ó degradación de
compuestos carbonados
¿Cómo seleccionamos?
• Genes marcadores, dentro
del plásmido y permite
seleccionar colonias
conjugantes por fenotipos:
auxotrofías, fuente de
energía,
resistencia/susceptibilidad
a antibióticos
E. coli JM1452StrR
Resistente a Estreptomicina. No codifica para el
pili (genes tra), por lo tanto es...
RECEPTORA
E. coli W3110/F´KmTn3
Resistente a la Kanamicina. Cepa F’, por lo tanto
es…
DONADORA
600 µL
300 µL
Resistente a
Estreptomicina
120 µL
Resistente a
Kanamicina
#CT: Número de Colonias Transconjugantes
#CP: Número de Colonias Parchadas