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Caracterización de la enzima recombinante glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de
Pseudomonas aeruginosa PAO1.
Jiménez-Ramírez Mariella, Vargas-Martínez Rocío y Velasco-García Roberto*.
Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM. Av. de los Barrios No. 1, Los Reyes
Iztacala, Tlalnepantla, Edo. de México. C. P. 54090. [email protected].
La enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) de P. aeruginosa participa en la
vía de Entner-Doudoroff, transformando la glucosa-6-P (G6P) hasta 6-P-glucono- lactona y reduciendo simultáneamente las coenzimas NAD(P)+ a NAD(P)H. Diversos
estudios destacan la importancia de esta enzima en la adaptación de la bacteria al
estrés oxidativo, que suele en encontrar en los lugares que invade. Considerando esto,
y la dificultad para combatir las infecciones que P. aeruginosa provoca, tenemos interés
en estudiar su G6PDH para saber si puede considerarse un potencial blanco de
compuestos antipseudomónicos. Es por esto que en un estudio reciente clonamos el
gen que la codifica, la sobreexpresamos y la purificamos a homogeneidad y en
cantidades significativas (25 mg/L de cultivo de la bacteria transformante).
Comprobamos también que la enzima presenta cooperatividad para la unión del
sustrato G6P, tanto en la reacción con NADP+ como con NAD+. En la presente
investigación se continúa con la caracterización cinética de la enzima recombinante, y
salvo los ensayos para determinar la energía de activación, todos los resultados se
obtuvieron utilizando una temperatura de 30 oC y un amortiguador Tris-HCl 100 mM, pH
8.0, en el medio de reacción.
Las energías de activación para las reacciones de oxidación con NADP+ o NAD+ como
coenzimas, se adquirieron midiendo la actividad de la enzima en un intervalo de 4 a 44
o
C, y metiendo los datos en una gráfica de Arrhenius. Los valores obtenidos para las
reacciones con NADP+ y NAD+ fueron de 36.3 y 33.8 kJ mol-1, respectivamente; que
son bajos al compararlos con el de otras G6PDHs, pero concuerdan con las altas
actividades específicas obtenidas con estas coenzimas; también, de manera respectiva
(145 y 270 u/mg).
La enzima se inactivó total e irreversiblemente a 55 oC, pero la presencia de G6P la
protegió a lo largo de 100 min que duró el ensayo, sugiriendo que el sustrato posee un
efecto estabilizante sobre la estructura de la enzima. Dos moléculas que parecen inhibir
alostéricamente a la enzima, tanto en la reacción con NADP+ como con NAD+, son el
ATP y el PO43-. En concentraciones de 1 y 20 mM, respectivamente, disminuyeron la
unión aparente de la G6P a la enzima (que se reflejó en un incremento, en ambos
casos, de cerca de diez veces en sus valores de K´). La inhibición del nucleótido (ATP)
se supera totalmente cuando se agrega simultáneamente MgCl2, en una concentración
4 mM. Este último efecto “protector” parece darse por una interacción de cargas del
Mg++ y los grupos fosfato del ATP.
Los efectos encontrados en esta investigación –de la G6P como estabilizante de la
estructura enzimática, del ATP y del PO43- como moduladores negativos de la enzima, y
del Mg++ como probable protector ante la inhibición por ATP- podrían tener, in vivo, un
papel regulador en la actividad de la G6PDH. Los futuros trabajos relacionados con esta
investigación podrían abocarse a la determinar probables cambios en las
concentraciones intracelulares de estos elementos en P. aeruginosa. También resultará
interesante buscar en la estructura de la enzima, sitios factibles para la unión de estos
compuestos, y con la ayuda de la mutagénesis sitio-específica corroborar su función.