Download Clonación, sobreexpresión y purificación de la enzima glucosa

Clonación, sobreexpresión y purificación de la enzima glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa de Pseudomonas aeruginosa PAO1.
Acero-Navarro Kevin y Velasco-García Roberto*.
Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM. Av. de los Barrios No. 1, Los Reyes
Iztacala, Tlalnepantla, Edo. de México. C. P. 54090. [email protected].
P. aeruginosa es un patógeno de relevancia clínica por ser el agente causal de
numerosas
infecciones
intrahospitalarias,
especialmente
en
pacientes
inmunocomprometidos por quemaduras o enfermedades como la fibrosis quística.
Además, esta bacteria posee una habilidad intrínseca para resistir una gran variedad de
agentes antimicrobianos, lo que dificulta el combatirla. Debido a esto, la búsqueda de
nuevos blancos terapéuticos en el microorganismo es de vital importancia. Una
molécula esencial para P. aeruginosa, y por ende diana potencial para agentes
antipseudomónicos, es la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), que
participa en la ruta alterna a la glucólisis, la vía de Entner-Doudoroff, encargada de
catabolizar la glucosa hasta piruvato. De manera específica, la G6PDH oxida la
glucosa-6-P (G6P) hasta 6-P-glucono- -lactona, con la concomitante producción de
NADPH; esta coenzima es utilizada para la síntesis de diversas biomoléculas y en la
adaptación de la bacteria hacia el estrés oxidativo. Un primer paso en el estudio de una
enzima consiste en obtenerla pura y en cantidades que permitan su caracterización. De
acuerdo a la literatura, la G6PDH de P. aeruginosa ha sido purificada en dos trabajos;
en uno de ellos se clonó el gen que la codifica (zwf) y se sobreexpresó la proteína
recombinante. A pesar de esto, la cantidad obtenida fue relativamente baja (0.125 mg/L
de cultivo bacteriano), y su caracterización incipiente. En el presente estudio se clonó el
gen zwf en el vector pCALn, se sobreexpresó la enzima en la bacteria E. coli
BL21(DE3)pLysS y se le purificó a homogeneidad, obteniendo 25 mg/L del cultivo de la
bacteria transformante, con una actividad específica a 30 oC y pH 8.0 de 145 y 270
u/mg, utilizando como coenzima NADP+ y NAD+, respectivamente. El método de
purificación empleado aprovecha que la proteína recombinante, que se sobreexpresa
fusionada a un péptido de unión a calmodulina (CBP), forma agregados insolubles. El
incremento en fuerza iónica (KCl 500 mM) y su digestión con trombina, que la libera del
CBP, la solubilizan y permiten pasarla por la resina aniónica Q-Sefarosa Fast Flow,
como el último paso en la purificación a homogeneidad.
La secuenciación del gen zwf clonado demuestra que éste se encuentra íntegro,
aunque la masa molecular determinada por SDS-PAGE para la subunidad proteica (51
kDa), difiere de la teórica calculada desde la secuencia de aminoácidos codificada por
dicho gen (55.6 kDa). Los ensayos de actividad de la enzima indican que puede utilizar
NADP+ y NAD+ como coenzimas, teniendo una preferencia por la primera (kcat/Km= 6.4
X106 y 1.93 X106 M-1s-1, respectivamente). Con relación al sustrato G6P, destaca que la
enzima tenga cooperatividad para la unión de esta molécula, enfatizando su posible
papel regulador en el metabolismo de la bacteria. Los logros obtenidos hasta ahora,
clonar el gen zwf y establecer un protocolo experimental para purificar la G6PDH de P.
aeruginosa en cantidades significativas, han permitido empezar a estudiar algunas
características cinéticas de la enzima, pero en el futuro próximo permitirán, con ayuda
de la mutagénesis sitio-específica, conocer las relaciones entre la estructura y la
función de esta molécula.