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REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504
Seguimiento virológico para anticuerpos contra el virus de la
encefalomielitis murina en colonia de ratones balb/c (Virological
follow-up for antibodies against the virus of Encephalomyelitis of mouse
in mice Balb/c colonies)
Figueroa, Teresa: Centro Nacional Para la Producción de Animales de
Laboratorio. CENPALAB | Peraza C: Centro Nacional De diagnóstico
Veterinario Pérez M: Centro Nacional Para la Producción de Animales de
Laboratorio. CENPALAB | Acevedo MC: Centro Nacional Para la
Producción de Animales de Laboratorio. CENPALAB | García IC: Centro
Nacional Para la Producción de Animales de Laboratorio. CENPALAB |
Donatién M: Centro Nacional Para la Producción de Animales de
Laboratorio. CENPALAB | Rodríguez Y: Centro Nacional Para la Producción
de Animales de Laboratorio. CENPALAB | Caraballoso Y: Centro Nacional
Para la Producción de Animales de Laboratorio. CENPALAB | Burón M :
Centro Nacional Para la Producción de Animales de Laboratorio.
CENPALAB| Galbán O: Centro Nacional Para la Producción de Animales de
Laboratorio. CENPALAB | Beovidez P: Centro Nacional Para la Producción
de Animales de Laboratorio. CENPALAB | Fernández N: Centro Nacional
Para la Producción de Animales de Laboratorio. CENPALAB
Resumen
Según Código Práctico para el uso de los Animales de Laboratorio,
elaborado en nuestro país y vigente, en el mismo se listan para cada
especie un número de microorganismos a diagnosticar en dicha colonias.
El virus de la Encefalomielitis del ratón o enfermedad de Theiler (TMEV)
constituye uno de los más estudiados en esta especie de animal de
laboratorio, debido al grado de prevalencia que desarrolla una vez que se
introduce en las colonias de cría. Este virus causa una infección
persistente en el sistema nervioso central e induce de forma crónica la
enfermedad de desmielinización trasmitida por células TCD4+. El
seguimiento virológico periódico de las colonias de ratones, ha sido uno
de los aspectos más discutidos e importantes para garantizar el estado
sanitario y el control de la calidad de las producciones de animales de
laboratorio. El presente trabajo tuvo como objetivo analizar la
prevalencia de anticuerpos contra el virus de la encefalomielitis de
Theiler en ratones Balb/c, infectados de forma experimental por método
indirecto del tipo ELISA e IFA. La prevalencia establecida fue del 73 y
67%, respectivamente, siendo los valores de sensibilidad, especificidad y
kappa de 100%, 76,2% y 0,8 respectivamente.
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Palabras clave: Prevalencia | virus de la encefalomielitis de Theiler.
Abstract
According to the Practical Code for the use of Laboratory Animals,
elaborated and valid in our country, appears listed for each species a
number of microorganisms to be diagnosed in these colonies. The virus
of Spontaneous Encephalomyelitis of the mouse or Theiler disease
(TMEV) constitutes one of the most studied for this species of laboratory
animal, due to the degree of prevalence it develops once is introduced in
the breeding colonies. This virus causes a persistent infection of the
Central Nervous System and chronically induces demyelination disease
transmitted by TCD4+ cells. The periodical virological follow-up of mice
colonies has been one of the more discussed and important aspects to
guarantee the sanitary status and quality control of the laboratory
animals production. The goal of the present paper is to analyze the
antibodies prevalence against TMEV in mice Balb/c, experimentally
infected measured by indirect method of ELISA and IFA type. The
prevalence established was of 73 and 67 % respectively, the values of
sensitivity, specificity and kappa being of 100 %, 76.2 % and 0.8
respectively.
Keywords: Prevalence, virus of encephalomyelitis of Theiler.
Introducción
Los animales de laboratorio son de gran importancia para el desarrollo de
las ciencias biológicas. Estos son utilizados en la reproducción e
investigación de patologías y síndromes que pueden afectar tanto al
hombre como a los animales (Ejemplo: SIDA, Hipertensión Arterial,
Epilepsia y Leucemia). Estos animales son usados además en pruebas de
alergias y toxicidad de medicamentos y biopreparados, en pruebas de
comportamiento y conducta, en la elaboración y evaluación de vacunas y
productos farmacéuticos, en estudios nutricionales y en la producción de
anticuerpos monoclonales, entre otros. El Centro Nacional para la
Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) fue creado en 1982
con el objetivo de obtener, criar, reproducir y expedir los animales
necesarios para el desarrollo de las líneas de investigación en la
biotecnología y la industria biofarmacéutica en Cuba. La entrega
ininterrumpida a los centros usuarios de estos biomodelos con la calidad
requerida permite obtener resultados confiables de los experimentos y la
reproducibilidad de los datos de aquellas investigaciones donde se
empleen. Entre las especies de animales de laboratorio producidas
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en CENPALAB, los roedores (ratas y ratones) Libres de Gérmenes
Patógenos Específicos (SPF, del inglés Specific Pathogen Free) criados y
mantenidos en condiciones controladas son los más usados debido, por
una parte a las características propias de su fisiología y por la otra
debido a las regulaciones internacionales cada vez más exigentes acerca
de la calidad genética e higiénico sanitaria de los animales de laboratorio.
El virus de la Encefalomielitis del ratón o enfermedad de Theiler (TMEV)
constituye uno de los más estudiados en esta especie de animal de
laboratorio, debido al grado de prevalencia que desarrolla una vez que se
introduce en las colonias de cría. Este virus causa una infección
persistente en el sistema nervioso central e induce de forma crónica la
enfermedad de desmielinización trasmitida por células TCD4+. La
ejecución de un programa de control para TEMV requiere medios de
diagnóstico económicos con altos niveles de sensibilidad y especificidad
que permita evaluar a un grupo elevado de muestras y en breve tiempo.
Objetivo: El presente trabajo tuvo como objetivo de realizar un
seguimiento virológico para anticuerpos contra el virus de la
Encefalomielitis Murina en colonias de ratones BALB/c, infectados de
forma experimental y evaluar los métodos utilizados para ello.
Material y métodos
Definición del método a emplear:
Para la realización de éste trabajo se empleó como método a emplear
para realizar la evaluación de las muestras el ELISA y el IFI de Tipo
indirecto como técnicas serológicas.
Obtención de sueros: Muestras Problemas. Se emplearon como
Suero Control Positivo ratones de la línea de Biomodelos: BALB//c. (SPF),
de 6 semanas de edad y para ello un total de 90 animales, Inoculados
experimentalmente, con el virus TEMV, Cepa GDVI. Se empleó la vía
intramuscular con una dosis de 0.5ml. Se realizaron 4 inoculaciones. El
inóculo se preparó con adyuvante Completo e incompleto, realizándose
inoculaciones los días 0, 7, 14 y 21 evaluando estos resultados hasta que
los animales levantaron títulos acorde a las especificaciones establecidas.
Se empleó como suero de referencia (control positivo) un suero
comercial de Charles Rivers. Cód: 1126778 A.
Los sueros negativos empleados fueron
obtenidos de la línea de
biomodelo BALB/c. (SPF), se partió de sangre total de ratones con 6
semanas de edad. Se empleó como suero de referencia (control
negativo) un suero comercial de Charles Rivers, Código: 112389ª
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Se realizó el análisis de 35 muestras por el método inmunoenzimatico /
(ELISA) e (IFI) del tipo indirecto y 55 Muestras por ELISA.
El criterio de lectura empleado para determinar el Cut Off o valor de
corte estuvo en sumar los valores de DO de los sueros controles
negativos y a la media de ello sumarle el valor superior del suero control
negativo. Como lo muestra la ecuación siguiente:
V.C= D.O (-) + D.O (-) + V S.C.N.
Método de Evaluación
Se utilizó como método de evaluación una tabla de contingencia de
cuatro casillas (Ramp y Gottstein, 1987), seleccionando 90 muestras
como Panel de sueros a evaluar. Se determinó Sensibilidad, VPP, VPN,
Especificidad y Eficiencia empleando ecuaciones establecidas para ello y
utilizando métodos estadísticos
Resultados y discusión
Los valores óptimos de sensibilidad y especificidad dependen de los
propósitos de la técnica, idealmente100 % para ambos, aunque por lo
general una elevada sensibilidad se alcanza a expensas de la
especificidad y viceversa, estableciéndose habitualmente un compromiso
sobre los valores deseados.
Se realizó la evaluación de las muestras para la presencia de anticuerpos
a TEMV. durante el procesamiento de las muestras de suero de ratón
por los sistemas de ELISA e IFA, Los resultados de cada uno de los
ELISAs
fueron analizados, procesados y llevados a una tabla de
contingencia de cuatro casillas (Tabla 1), agrupando los casos positivos y
negativos por ambos métodos, para realizar el cálculo de la sensibilidad,
especificidad, VPP, VPN y eficiencia del método normalizado según las
fórmulas expuestas por Ramp y Gottstein en 1987.
Tabla 1. Tabla de contingencia para las muestras de suero de ratón
procesadas por la técnica ELISA e IFA.
IFA
Negativos
Positivos
Negativos
A
B
Positivos
C
D
ELISA
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En la tabla 2 se muestran los resultados de la evaluación de las técnicas
serológicas para la detección del virus de la Encefalomielitis murina o
enfermedad de Theiler (TEMV).
Tabla 2. Valores obtenidos de los diferentes parámetros evaluados en el
proceso de evaluación en suero de ratón y Patrón de fluorescencia para el
virus TEMV.
Parámetros
Valor (%)
Sensibilidad
98
Especificidad
86
Valor predictivo positivo (VPP)
99.2
Valor predictivo negativo (VPN)
98
Eficiencia
Patrón de Fluorescencia
99.7
9 Fluorescencia en citoplasma
celular.
Los sistemas ELISA e IFI mostraron un 98 % de sensibilidad ya que las
muestras positivas, fueron detectadas por la técnica y esto eleva la
probabilidad de que un animal realmente enfermo sea detectado como
tal por el sistema, mientras que la especificidad mostró valores de 86%,
lo cual coincide con los criterios de que una prueba diagnóstica nunca es
considerada perfecta, aunque el valor obtenido es alto.
Los sistemas validados mostraron un 99.2% para el valor predictivo
positivo, es decir existe la probabilidad de que el 98 % de los resultados,
sean falsos positivos. Con relación al valor predictivo negativo, los
sistemas mostraron un valor de 100%, lo que habla a favor de una
elevada probabilidad de que el animal detectado como sano por la
técnica sea realmente sano y esto favorece la eficiencia o valor global del
método normalizado, el cual reflejó un 99.7 %. Estos resultados
demuestran la confiabilidad que se obtiene con la utilización de estos
sistemas de diagnóstico.
Después de establecidas las producciones en CENPALAB de los juegos de
diagnóstico y a partir de 1996, estos se han empleado en el programa de
monitoreo de salud, para la certificación virológica de los Biomodelos
experimentales y en específico para la detección del virus de la
Encefalomielitis murina o enfermedad de Theiler (TEMV) como técnicas
del tipo indirecto y el estudio en masa de los animales de producción.
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Anualmente se han enviado muestras de sueros de estos Biomodelos a
centros de referencia en Holanda (QM Diagnostic, UMC St Radboud) y se
ha verificado los resultados emitidos por CENPALAB, mostrando la
eficacia de nuestro método diagnóstico en la detección de virus TEMV. En
todos los casos los resultados han coincidido con los reportados,
corroborado la confiabilidad y reproducibilidad de estos métodos de
diagnóstico.
Tabla No 3 Valores de las medias entre los ensayos de ELISA realizados.
Sueros
ELISA1 ELISA 2 ELISA 3 Media
D.S
Controles
C.V
(%)
(+)
1.151
1.082
1.158
1.133
0.036
3.2
(- )
0.149
0.141
0.148
0.146
0.004
2.4
Tabla No 4 Coeficiente de correlación y nivel de significación entre los
valores de las medias de los lotes de juegos de diagnóstico
X(i) vs X(j) (Lotes)
Coeficiente de
Nivel de significación
correlación
(%)
1vs2
0.999999
p> .99
1 vs 3
0.98258
p> .98
2 vs 3
0.98126
p> .98
Los resultados de las muestras evaluadas por los Kit de Producción
nacional para el diagnóstico del virus de la Encefalomielítis murina
mostraron una prevalencia del 71% tanto por ELISA como por IFI para
un 73 % de prevalencia con el empleo de los Kit comerciales de la firma
Charles Rivers, resultados que avalan
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Conclusiones
1. Las Técnicas de ELISA e IFI del tipo indirecto mostraron altos
niveles de sensibilidad y especificidad para ser utilizadas en el
programa de control serológico para virus Theiler en colonias de
ratón.
2. La Cepa GDVI, adquirida de la ATCC y mantenida en nuestras
condiciones, utilizada como Ag en la infección experimental en la
producción de Ac al virus Theiler fue efectiva.
3. Los animales presentaron títulos de anticuerpos al virus y efecto
citopático característico.
4. El método de diagnóstico del tipo ELISA e IFI, empleado para la
evaluación de la presencia de anticuerpos a virus Theiler, mostró
confiabilidad y reproducibilidad.
5. El BALB/c como biomodelo mostró ser susceptible a la infección del
virus Theiler de forma experimental.
Bibliografía
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Tesis presentada en opción al título académico de Maestro en
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pp 59-81. New York.
REDVET: 2012, Vol. 13 Nº 06B
Ref. 011ATM01_REDVET / Publicado: 01.06.2012
Este trabajo fue presentado en las Jornadas Científicas por el 120 Aniversario del Sabio de la
Medicina Veterinaria Cubana Dr. Ildefonso Pérez Vigueras, celebrado en Pinar del Río, Cuba, del
9 al 11 de Febrero del 2012 y está disponible en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n060612B.html concretamente en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n060612B/PR21.pdf
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Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org
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