Download transgenicas resistentes a hongos

ESTRATEGIAS PARA EL
DESARROLLO DE PLANTAS
TRANSGÉNICAS
RESISTENTES A HONGOS
Marisa Lopez Bilbao
[email protected]
Instituto de Biotecnología, INTA-Castelar.
Curso Fitopatología Molecular. Año 2016
En la naturaleza las plantas son desafiadas continuamente por
bacterias, virus, hongos y nematodos. Sin embargo muy pocos logran
entrar en una planta huésped
Las enfermedades no son muy
habituales en la naturaleza
Cultivos intensivos
Enormes superficies con clones
Infecciones fúngicas
Grandes pérdidas económicas
Mayoría de las especies
Enfoques para el control de enfermedades fúngicas
1. Control mediante prácticas agronómicas:
a) Rotación de cultivos
b) Empleo de fungistáticos químicos que funcionan sólo como
"protectores" y no como "curativos".
•Resultados no deseados desde el punto de vista ecológico
•Riesgo la salud
•Costosa,
Ineficaz: lluvias no previstas
y fungoresistencia
2. Obtención nuevas variedades resistentes
a) Por introgresión
+ Disponibilidad de fuentes de resistencia taxonómicamente
compatibles
- Acompañamiento de genes no deseados
b) Obteniendo variedades transgénicas
Enfoque biotecnológico
E
n
f
o
q
u
e
C
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á
s
i
c
o
Transgénicas Bt
(resistencia a
insectos)
Transgénicas RR
(resistencia a
herbicidas)
Resistencia a virus
Modificaciones en
rutas metabólicas
Pocas especies
vegetales soja, maíz,
algodón, canola,
remolacha azucarera, calabaza,
berenjena, papa, papaya, alamo
Para transformar una especie vegetal
Sistemas modelo/especies
vegetales de interés comercial
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos menos
usados)
Ensayos de transformación
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
Camino hacia la desregulación y
comercialización
¿¿ Qué genes expreso en la planta
para que le confieran resistencia ???
Para eso, hay que conocer cómo se
defienden las plantas
y
qué mecanismos se disparan
Específicos
Inespecíficos
Mecanismos de defensa de las plantas ante el ataque de patógenos
Genes R (Resistance genes):
E
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Reconocen un factor de avirulencia (Avr) del patógeno y
confieren resistencia actuando según el modelo clásico gen
a gen.
R (en planta) +
resistencia
Avr (en patógeno)
Se dividen en 4 grupos:
-NB-LRR(nucleotide binding leucine rich repeat)
-Ser/Thr kinasas
-RLKs (receptor like kinases)
-RLPs (receptor like proteins)
Mecanismos de defensa de las plantas ante el ataque de patógenos
I
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Las plantas desarrollan un complejo mecanismo coordinado de defensa
frente al ataque de patógenos.
A nivel de la célula atacada por el patógeno:
1) producción de especies reactivas de oxígeno,
2) acumulación de fitohormonas: ácido salicílico, etileno y ac. Jasmónico
3) Producción compuestos fenólicos como ácido benzoico,
4) fortificación de la pared celular,
5) aumento de la actividad lipoxigenasa,
6) producción de compuestos antimicrobianos (fitoalexinas) y de proteínas
relacionadas con la patogénesis o proteínas PR (“Pathogenesis Related
proteins”), así como otros péptidos o proteínas antifúngicas
Proteínas antifúngicas
1-RIP:
Remueve un residuo de adenina del rRNA 28S inactivando los ribosomas,
inhiben la elongación de las proteínas.
2- Péptidos ricos en cisteínas:
-chitin-binding proteins (aglutinina), Tomate/ Tricoderma hamatum
-defensinas (homólogas a proteínas de defensa de insectos y mamíferos),
-tioninas (formación de poros en la membrana) Arabidopsis/ Fusarium
oxysporum
3-Proteínas PR:
Estas proteínas fueron descubiertas en 1970 en plantas de tabaco infectadas
con el virus del mosaico de tabaco (TMV), y se observó que eran fuertemente
inducidas de novo (Van Loon, 1970).
Desde entonces se han encontrado en una gran variedad de especies
vegetales. Hidrolizan pared, permeabilizan pared, función biológica
desconocida, En la mayoría de las familias de proteínas PR se han identificado
isoformas tanto vacuolares como intercelulares. En varios casos, como AP24,
quitinasa y -1,3-glucanasa, se ha demostrado que el sitio de localización es
la vacuola.
Genes involucrados en los
mecanismos de defensa
Plantas transgénicas
(estudiados, aislados y clonados)
(know how/metodología)
Obtención de variedades
resistentes
Genes de resistencia de plantas (R)
La incorporación en una planta
susceptible de un gen R de una
planta resistente, le incorpora
resistencia contra el patógeno
que lleva el gen avr
correspondiente.
En casos experimentales se lograron altos niveles de resistencia a patógenos
bacterianos y fúngicos expresando los genes de resistencia r, pto y xa21 en
tomate y arroz, respectivamente, sin embargo la resistencia conferida es
patógeno específica (Pseudomonas tomatae, Xanthomonas oryzae).
Lo ideal parecería ser apilar genes R por transgénesis
Esto evitaría que se perdiera la resistencia (mutación en el Avr)
Ampliaría el rango de patógenos
La expresión constitutiva de varios genes R activaría las rutas de
defensa en detrimento del normal crecimiento y desarrollo de la
planta
Genes antifúngicos
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En 1991 se reportó el primer caso de una planta transgénica de
tabaco con mayores niveles de resistencia al hongo Rhizoctonia
solani, mediante la expresión constitutiva de un gen de quitinasa
básica que poseía un probado efecto antifúngico in vitro (Broglie,
1991).
Esta mayor resistencia por la expresión de quitinasas ha sido
demostrada en ensayos de campo en tabaco (Howie et al. 1994) y en
Brassica napus (Grison et al. 1996).
También se obtuvieron plantas transgénicas con expresión constitutiva
de β-1,3-glucanasas en tabaco con mayores niveles de resistencia.
Veamos un listado de transgénicas con distintos PR:
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Se debe tener presente que:
Las plantas están expuestas a un amplio e impredecible espectro de
patógenos en la naturaleza, es más ventajoso desplegar una variedad
de estrategias de defensa. Por lo que la estrategia de protección
apunta a desarrollar plantas con un amplio rango de resistencia a
patógenos fúngicos por ingeniería genética.
Así, se implementó la estrategia de producir plantas transgénicas que
expresen diferentes proteínas antifúngicas simultáneamente.
Se ha demostrado que existe un efecto sinérgico de las proteínas
quitinasa II y la 1-3 glucanasa en la generación de la resistencia en
tabaco (Zhu y col. 1994 y Jach y col 1995) y tomate (Jongedijk y col.
1995).
En el año 2006, con la estrategia de transformar con
quitinasa II y 1-3 glucanasa se publicaron 2 trabajos:
- En frutilla se logró protección contra Botrytis
cinerea pero no ocurrió lo mismo contra Colletotrichum
acutatum, el agente etiológico causante de antracnosis
contra el que se buscaba protección (Vellicce y col.2006).
- En Brassica napus, aunque los producto de los
transgenes se expresan correctamente, las plantas no
muestran a campo un mayor nivel de resistencia que las
plantas sin transformar (Melander y col 2006).
Vamos a ver ejemplos
plant defensin in rice
Expression of a plant defensin in rice confers resistance
to fungal phytopathogens
by Sanjay Jha and Bharat B. Chattoo. Transgenic Res (2010) 19:373–384
Magnaporthe oryzae (Ascomicete,
28 T0
confirmadas
por PCR
apresorios en la parte aérea y en las
raíces hifospodios). Es muy variable por lo
que la obtención de resistencia a través
del mejoramiento convencional fue muy
limitada
Rhizoctonia solani (Basidiomicete se
reproduce por micelios y/o esclerocios)
Rs-AFP2: defensina extraída de la
semilla del rábano negro (Raphanus
sativus) interactúa con la
glucopyranosylceramida de la membrana
plasmática de la hifa y hace que se libere
K+ y entre Ca++, produce una
superramificación de las hifas y reduce
su crecimiento.
Hojas maduras de
plantas T2
homocigotas
C-
4 líneas
mostraban 1 sola
banda. Se usaron
para los análisis
de expresión
plant defensin in rice
Se expresa el transgen en las 4 líneas?
Inmunodetección, usando suero
policlonal anti-Rs-AFP2.
C+
C-
Hoja
20 ug proteína total
La proteína se expresa
constitutivamente en las transgénicas
y no en el control sin transformar
Se determinó la
cantidad de proteína
producida en extractos
de hojas de las líneas
transgénicas
Raíz
Semilla
plant defensin in rice
¿Se dispara el sistema de defensa de la planta por la expresión constitutiva
de esta proteína? (efecto no deseado)
Analizan la expresión del gen endógeno OsPR-1a
Planta sin transformar desafiada con M. oryzae
¿Localización subcelular?
Inmunolocalización
Transgénica
Control
Hoja
En apoplasto
Raíz
plant defensin in rice
¿Tolerancia de las 4 líneas transgéncias a los patógenos?
Estudios in planta (invernáculo)
Actividad antifúngica in vitro
M.
oryzae
R.
solani
Demuestran que la resistencia de las plantas transgénicas de arroz
se debe a la interacción de la proteína Rs-AFP2 con la membrana del
hongo y que produce su inhibición
Chi194 de trigo en tomates
Transgenic tomato plants expressing a wheat endochitinase gene
demonstrate enhanced resistance to Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
P. V. Girhepuje • G. B. Shinde
Plant Cell Tiss Organ Cult (2011) 105:243–251
Antecedentes: Various chitinases have been shown to inhibit the growth of
fungal pathogens in in vitro as well as in planta conditions.
Trabajo: chi194, a wheat chitinases gene encoding a 33-kDa chitinase
protein overexpressed in tomato plants (cv. Pusa Ruby) under the control of
maize ubiquitin 1 promoter.
Chi194 de trigo en tomates
Polymerase chain reaction (PCR) amplification of wheat chitinase gene in T0 transgenic tomato lines.
P plasmid as a positive control; UT untransformed Pusa Ruby; 1–25 putative transgenic tomato plants
(TTC-1–TTC-25); M marker
Southern blot analysis of genomic DNA from 14 T0 transgenic tomato plants.
TTC-1–TTC-25, T0 transgenic tomato lines; UT untransformed Pusa Ruby as a negative
control; P EcoR1 digested fragment of plasmid pCAMBAR194 as a positive control
Chi194 de trigo en tomates
Segregation analysis in the T1 generation
Seeds of 13 Southern blot-positive T0 transgenic plants were used for the segregation study of the
chi194 gene in the T1 generation.
For the seeds from the 13 transgenic T1 tomato lines tested using the hygromycin sensitivity test,
eight lines showed a 3:1 ratio of segregation; further, this was confirmed with the PCR analysis of line
TTC-11.
Eighteen of 25 plants tested were PCR-positive for chi194, while seven were PCR-negative, which
matches the Mendelian segregation ratio of 3:1 (Fig. 4).
Chitinase activity in T0 transgenic tomato
lines and control non-transgenic plants.
The bars represent the chitinase activity.
(Chitinase activity in the leaves of T0
transgenic tomato plants was measured by
using deacetyl glycol chain as a substrate)
Chi194 de trigo en tomates
Fusarium wilt disease resistance assay on
the chi194 gene-expressing transgenic
tomato plants.
a Untransformed control.
b Transgenic tomato line TTC-11 inoculated
with the fungal pathogen Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici
In this study, the overexpression of the wheat chitinase
gene, chi194, in tomato demonstrated the enhanced resistance
to the fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici. The field performance of transgenic plants
would facilitate further evaluation of disease resistance and
for the commercial exploitation of this transgenic tomato.
Greenhouse testing of transgenic lettuce plants expressing SN1
against Rhizoctonia solani
Dra. Marisa Lopez Bilbao
Dra. Laura Radonic, Lic. Flavia Darqui
Lic Nilda Lopez y Dr. Esteban Hopp
Grupo de Transformación de Asteráceas
Instituto de Biotecnología, INTA
Argentina
Estudio de la actividad in-vivo del péptido antimicrobiano codificado por el gen snakin1
Desafío con R. solani
Non-inoculated
Desafío con E. carotovora
S3
Inoculated
WT
S3
WT
% surviving plants
100
Silenciamiento de snakin1
•
reducción de tamaño y alteraciones
en la hoja, con células más grandes
•
alteración del metabolismo de la hoja
y composición de la pared celular
S1
S3
S5
WT
75
S1
50
S3
S5
WT
S3
25
WT
0
2
4
6
8
days post infection
Enhanced resistance of SN1 transgenic potato plants to E. carotovora
subsp. carotovora
Plant
Lesion average
Lesion
Fallen
Thickened
line
reduction (%)
leaves
stems
(mm2) SEM
S1
S3
S5
WT
Non-inoculated
S1
S3
S5
WT
14,3 4.1 *
12,8 2.7 *
3,2 1.0 *
46.5
52.1
88.1
6
9
0
0/10
0/10
0/10
WT
0
20
7/10
32.05 7.1
Evaluation of disease parameters from 10 replicas of each transgenic
line (S1-S5) and non-transgenic plant (NT) at 10 days post infection. *
denote significant differences (P < 0.05) with respect to non-transgenic
plants.
S3
WT
Inoculated
Almasia et al., 2008
Snakin-1
•
•
Nahirñak et al., 2008
Defensa frente a infecciones fúngicas y bacterianas in-vivo
Rol en crecimiento y desarrollo
Obtuvimos 5 líneas portadoras del péptido antimicrobiano
snakin-1 (SN1 de Solanum chacoense) en lechuga
Caracterización fenotípica
y molecular
Ensayo de desafío in vitro con Rhizoctonia solani, en plántulas T3
100%
50%
0%
GRWT
1.7A
100%
50%
0%
GRWT
1.7D
GRWT
2.2B
GRWT
4.1A
GRWT
4.2.2C
100%
50%
0%
*
100%
50%
0%
*
100%
50%
0%
*
Todas las líneas transgénicas
presentaron un mayor porcentaje de
plántulas sin daño en comparación con la
línea control en las condiciones
descriptas. Esta diferencia fue
significativa (*) para las líneas 2.2B, 4.1A
Y 4.2.2 C según la prueba de chicuadrado de Pearson (p<0,05).
Ensayo de desafío en invernáculo
con R solani, en plántulas T3
Se utilizaron 13-16 plantas por línea
Se inocularon 5 hojas por planta, con
disco de hongo en la cara adaxial
14 dpi, se tomaron fotos de todas las
hojas afectadas (scanner)
100%
*
***
*
**
75%
Se contó n° hojas muertas,
necrosadas y puntilladas.
Presentaron síntomas 40 a 50
hojas por línea.
50%
25%
0%
GRWT 1.7A
muerta
1.7D
2.2B
4.1A 4.2.2C
necrosada
puntillada


Ensayo con
Sclerotinia
Se observó una mejor
respuesta en las líneas
transgénicas en relación a las
plantas no transgénicas ( test
Χ2 de Pearson en tablas de
contingencia, donde se
comparan todas las líneas
contra el mismo control)
* p<0,1
** p<0,05
*** p<0,01
Mas estrategias:
- Apilamiento de genes
- Silenciar genes