Download Clase 8 Resistencia a bacterias 2013

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Agrobiotecnología. Curso 2013
Clase 8: Resistencia a bacterias fitopatógenas
mediante ingeniería genética
Bacterias fitopatógenas
Transparencia 3-22
La adecuada identificación de las especies, subespecies y patovariedades de
bacterias es tema de fundamental importancia para los microbiólogos y
fitopatólogos.
En la actualidad, existen herramientas genéticas y moleculares que se suman a
la
tradicional caracterización fenotípica de las diferentes bacterias. Entre
estas nuevas
técnicas se encuentran la secuenciación de ADN, la hibridación ADN-ADN, el
análisis
de isoenzimas y los marcadores moleculares. Además, la adecuada
identificación de
las bacterias fitopatógenas resulta de particular interés en el marco de
estudios
epidemiológicos y de impacto ambiental o ecología.
Las bacterias fitopatógenas capaces de infectar y desarrollar enfermedades en
un
gran número de especies vegetales de importancia económica, pertenecen a un
reducido grupo de géneros (transparencis 4 y 5). Los géneros de bacterias
Gramnegativas más estudiados desde el punto de vista de su biología, impacto
fitopatológico y aspectos genético-moleculares son Agrobacterium, Erwinia,
Pseudomonas y Xanthomonas. Estos organismos pueden ser cultivados en el
laboratorio, en medios sencillos de cultivo y pueden inocularse fácilmente en
plantas
para realizar estudios de fitopatogenicidad. Las bacterias Gram-positivas,
como
Clavibacter, Curtobacterium y Rhodococcus, son más difíciles de manejar en
condiciones controladas.
Erwinia chrysanthemi, E. carotovora, E. amylovora y otras 15 especies mas,
son
causantes de pudriciones blandas, por su capacidad para producir grandes
cantidades
de enzimas pectolíticas, principalmente liasas pectasas, capaces de macerar
tejido
parenquimatoso de un amplio rango de especies.
Las Xanthomonas spp. son bacterias aeróbicas, Gram negativas, que presentan
un
único flagelo. La mayoría de las especies de este género produce abundantes
cantidades de polisacáridos extracelulares como el xantano. Este género
comprende
20 especies que atacan a más de 350 vegetales. En particular Xanthomonas
axonopodis pv citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los
cítricos,
enfermedad, que por los daños que produce, ha adquirido una importante
trascendencia socioeconómica en los países productores de cítricos. Por otra
parte,
Xanthomonas campestris pv campestris, es el patógeno causante de la pudrición
negra en crucíferas, entre ellas Arabidopsis, y constituye un modelo de
interacción
planta-patógeno muy estudiado.
Otros géneros de bacterias fitopatógenas son Agrobacterium, Rhodococcus,
Spiroplasma, Xylella y Streptomyces. Xylella fastidiosa, causante de la
clorosis
variegada de los cítricos, fue la primera bacteria fitopatógena cuyo genoma
fue
secuenciado totalmente.
La transparecia 6 muestra las top 10 enfemedades de importancia a nivel
global según
la revista MPP
La transparencia 7 muestra un esquema generalizado de la ultraestructura de
una
bacteria fitopatógena típica. Con excepción de Streptomyces, que posee una
forma
filamentosa, la mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen forma de
bastón. Las
bacterias del género Streptomyces son procariontes filamentosos Grampositivos que
producen esporas como principal mecanismo de dispersión. Sólo unas pocas
especies
entre las 400 descriptas son patógenas de plantas. Las especies de
Streptomyces
fitopatógenas causan enfermedades a nivel de órganos y estructuras
subterráneas de
diversas especies vegetales. Por ejemplo, Streptomyces scabies causa la sarna
de la
papa (escaras a nivel de los tubérculos).
El género Pseudomonas (transparencia 8) comprende bacterias unicelulares Gram
negativas que son móviles por presentar uno o varios flagelos polares
(flagelos
lofotricos). Las bacterias de este género son aeróbicas estrictas. Una de las
características de todas las especies del género es que producen pigmentos
fluorescentes. P. syringae es la especie de mayor importancia económica.
Pseudomonas syringae se clasifica en alrededor de 45 patovariedades y puede
infectar un amplio rango de especies de plantas. Entre ellas podemos
mencionar: Ps
pv. phaseolicola la cual infecta el fríjol causando la enfermedad conocida
como “tizón
de halo”; Ps pv. tomato que produce la “mancha negra” del tomate.
Ralstonia (formalmente Pseudomonas) solanacearum es una bacteria de suelo
Gramnegativa que coloniza el floema de una amplia gama de plantas huésped,
causando
entre otras la podredumbre parda de la papa.
La figura de la transparencia 9 representa esquemáticamente el ciclo de vida
típico de
una bacteria fitopatógena. El ciclo incluye dos fases importantes: la fase
epifita o fase
de colonización y dispersión en el ambiente del patógeno. La fase patogénica
es
aquella en la que el patógeno invade e infecta a una planta y se multiplica
intratisularmente o intracelularmente. Es durante esta etapa del ciclo de
vida que la
planta es capaz de gatillar su sistema defensivo, desarrollando entre otros
mecanismos la Respuesta Hipersensible (HR).
La gran mayoría de las bacterias fitopatógenas ingresa a la planta a través
de
discontinuidades naturales de la epidermis tales como estomas o lenticelas.
En otros
casos, aprovechan también la existencia de heridas o cicatrices. La
transparencia 9
muestra fotografías tomadas al microscopio de barrido que ilustran esta
situación.
Una vez que han traspasado las barreras naturales a nivel de cutícula y
epidermis, las
bacterias fitopatógenas se traslocan por el apoplasto (espacio extracelular)
y/o por los
tejidos de conducción junto con nutrientes del suelo (transparencia 10 y 11).
De esta
manera, logran colonizar diferentes órganos. Se ha comprobado que en los
órganos
de una planta infectada por bacterias, las células o tejidos menos afectados
por las
mismas son los meristemas. Estos tejidos de la planta están pobremente
vascularizados, lo que dificulta el acceso de las bacterias o de cualquier
otro tipo de
patógeno.
La tabla de las transparencias 12 y 13 enumera los principales tipos de
enfermedades
bacterianas en plantas y sus correspondientes síntomas. Las transparencias 14
a 21
presentan ejemplos de las enfermedades más típicas. La cancrosis de los
cítricos
(transparencia 14) es una enfermedad causada por la bacteria Xanthomonas
axonopodis pathovar citri que puede causar un extenso daño a las ramas, las
hojas y
las frutas de las distintas variedades de cítricos susceptibles. Esta
enfermedad causa
a menudo la caída prematura de la fruta y lesiones en la cáscara, lo que
limita su
comercialización. La bacteria que causa la cancrosis de los cítricos puede
sobrevivir
por períodos extensos en las ramas y el tallo de los cítricos. La enfermedad
se
disemina por el viento, el rocío, la lluvia, las actividades mecánicas (por
ejemplo, al
podar, arrancar, y rociar los árboles dentro y entre la arboleda), el
movimiento de las
plantas o de partes de las plantas infectadas y las actividades de las aves,
los
insectos, y/o los mamíferos. La cancrosis de los cítricos es un peligro para
las áreas
que producen cítricos porque se disemina rápidamente y tiene un potencial de
daño
muy alto.
Las bacterias del género Streptomyces producen esporas como principal
mecanismo
de dispersión (transparencia 16). Sólo unas pocas especies entre las 400
descriptas
son patógenas de plantas. Las especies de Streptomyces fitopatógenas causan
enfermedades a nivel de órganos y estructuras subterráneas de diversas
especies
vegetales. Por ejemplo, Streptomyces scabies causa la sarna de la papa
(escaras a
nivel de los tubérculos). El género Erwinia incluye, al igual que otros
miembros de la
familia Enterobacteriaceae, bacterias anaerobicas facultativas de formas
flageladas y
de tipo Gram negativo. Las especies de Erwinia (transparencias 16, 17 y 18)
se
encuentran entre las de mayor impacto económico, ya que son los agentes
causales
de varias enfermedades de frutales, de la podredumbre blanda de la papa y de
cucurbitáceas todas las cuales constituyen importantes problemas sanitarios
en los
países productores.
Las transparencias 19, 20 y 21 representan otras res enfermedades de
importancia
para distintas especies como Ralstonia solanacearum en papa, Agrobacterium
tumefaciens que genera la agalla de corona en numerosas especies leñosas y
Xylelella fastidiosa en cítricos,
Las transparencias 22 y 23 presentan dos de los métodos de manejo agronómico
comúnmente utilizados en el control de enfermedades bacterianas.
Interacciones planta-bacteria
Transparencia 24-35
La transparencia 25 describe algunos de los eventos de señalización que
regulan la
interacción bacteria-planta. Los exudados de las células vegetales
conteniendo
aminoácidos, azúcares y otros compuestos químicos (o) pueden ser reconocidos
como
señales por los microorganismos del suelo e inducen en ellos una respuesta
recíproca
(hacha) que puede ser agresiva (como la toxina albicidina, producida por
Xanthomonas albilineans). Los microorganismos producen también moléculas que
actúan como señales y que pueden ser reconocidas por otros microorganismos
(Δ) o
por las células vegetales (□). Las acil homoserin lactonas son un ejemplo de
moléculas
que son reconocidas por las bacterias. En el caso de bacterias fitopatógenas,
estos
compuestos inducen generalmente la producción de factores de virulencia
(cuchillo).
Las señales moleculares bacterianas pueden ser reconocidas por la célula
vegetal y
funcionar como inductores de la respuesta de defensa de la misma, produciendo
pépticos tóxicos y antibióticos. Hay señales bacterianas que, como en el caso
de
Rhizobium, inducen una interacción mutuamente beneficiosa tanto para el
microorganismo como para la planta.
Las plantas se encuentran enfermas cuando una o varias de sus funciones
(división y
diferenciación celular, desarrollo, absorción de agua y minerales,
translocación de
productos de la fotosíntesis, reproducción y acumulación de reservas) son
alteradas
por diferentes patógenos o por determinadas condiciones ambientales. La
reacción de
las plantas ante el agente que ocasiona la enfermedad se localiza en la zona
afectada
y es de naturaleza química. Poco tiempo después, la respuesta se magnifica y
se
producen cambios histológicos que se hacen notables y constituyen los
síntomas de la
enfermedad. Las células o tejidos afectados de las plantas enfermas se
debilitan o
destruyen a causa de los agentes que causan la enfermedad. La capacidad que
tienen
las células y tejidos para llevar a cabo sus funciones normales disminuyen o
se anulan
y, como resultado, la planta muere o merma su crecimiento (transparencia 26).
La transparencia 27 muestra un esquema de las diferentes estrategias de
ataque de
un patógeno a un organismo vegetal. El gen o los genes de virulencia de un
patógeno
son por lo general específicos para una o unas pocas plantas relacionadas. La
especificidad de estos genes es lo que permite explicar porqué las plantas
son
susceptibles a algunos patógenos y resistentes a otros. A la resistencia de
las plantas
frente a un patógeno que no posee los genes de virulencia adecuados para
atacarlas,
se la denomina resistencia de no hospedante. Por otro lado, unos pocos
patógenos
son capaces de infectar varias clases y a veces cientos de plantas
hospedadoras que,
por lo tanto, resultan ser susceptibles. Estos patógenos poseen una mayor
diversidad
de genes de virulencia o los pocos genes de virulencia que poseen son menos
específicos que aquellos de los patógenos muy especializados. Las plantas
susceptibles a estos patógenos muestran claros síntomas de enfermedad.
Finalmente,
a pesar de que ciertas especies de plantas son susceptibles al ataque de
diversos
patógenos, algunos individuos de esas especies pueden devenir resistentes
adquiriendo genes a través de la evolución o del mejoramiento genético de los
cultivos. La resistencia producida por la presencia de ciertos genes o
combinaciones
de genes se denomina resistencia verdadera. Esta resistencia se denomina
horizontal
cuando esta controlada por numerosos genes (a veces cientos). En este caso,
cada
uno de estos genes juega un rol menor en la totalidad de la resistencia. En
cambio, la
resistencia vertical, es siempre controlada por uno o unos pocos genes
denominados
genes R, genes de resistencia o genes mayores de resistencia.
La transparencia 28 describe las diferencias entre factores de virulencia,
patogenicidad
y avirulencia y en la transparencia 29 se ejemplifican sustancias que
funcionan como
efectores de bacterias fitopatógenas.
La transparencia 30 muestra las combinaciones de genes involucradas en
distintas
interacciones de resistencia/enfermedad entre un patógeno y su hospedador.
Las
bacterias fitopatógenas establecen interacciones compatibles o incompatibles
con sus
respectivos hospedadores. En una relación compatible un patógeno logra
infectar y
enfermar a una planta, y esto ocurre si las condiciones ambientales son
favorables, si
las defensas preformadas de la planta son inadecuadas, si la planta falla en
detectar al
patógeno, e incluso si las respuestas de defensa activadas son ineficientes.
En una
interacción incompatible las plantas resisten al ataque del patógeno. Esta
resistencia
puede ser inespecífica, a través de la denominada resistencia no hospedadora,
basal
o innata, en la cual el patógeno no encuentra condiciones favorables para
infectar o la
planta presenta barreras estructurales preformadas, o sintetiza compuestos
tóxicos
que impiden la proliferación y colonización de la bacteria. La relación
incompatible, y
por lo tanto la resistencia de la planta, puede ser debida también a un
reconocimiento
específico. En este caso existe una base genética muy definida. La presencia
de
genes de resistencia dominantes en el hospedador que le permite reconocer
genes de
avirulencia del patógeno. En los años 40 del siglo pasado, Harold H. Flor
propuso el
modelo del “gen a gen”. Dicho modelo establece que la resistencia se produce
cuando
la planta expresa un gen de resistencia dominante (R) y el patógeno un gen de
avirulencia dominante complementario (Avr). Esta respuesta defensiva de una
planta
está frecuentemente asociada a una Respuesta de Hipersensibilidad (HR; del
inglés:
Hypersensitive Response), la que se caracteriza por una necrosis rápida y
localizada
en respuesta al ataque del patógeno. Es decir, frente a la invasión de
tejidos vegetales
por un microorganismo foráneo, la respuesta defensiva inducible más temprana
es la
muerte celular controlada. Esta respuesta hipersensible de las células
vegetales
ocurre aproximadamente 24 horas después de que la planta percibe un patógeno
potencial.
La transparencia 31 resume algunos efectores descriptos para Xanthomonas que
han
sido ms extensamente estudiados
La transparencia 32 esquematiza las estructuras de varias proteínas
codificadas por
genes de resistencia que han sido particularmente estudiadas. El
descubrimiento de
los genes de resistencia (R) en diferentes cultivares como cebada, maíz y
tomate se
ha acelerado notablemente debido al desarrollo de las técnicas de mapeo,
aislamiento
y secuenciación. Son interesantes las similitudes halladas en la estructura
de las
proteínas R en especies de plantas mono y dicotiledóneas, lo que evidencia
que los
sistemas defensivos han sido conservados durante la evolución y
diversificación de las
plantas. Los genes R más comunes de función conocida codifican proteínas
intracelulares con dominios de unión de nucleótidos y secuencias repetidas
ricas en
leucinas (NB-LRR; nucleotide-binding/leucine-rich repeat) y con un dominio Nterminal
variable. Las proteínas R que presentan en su estructura un dominio
intracelular de
serin/treonin quinasa, un dominio extracelular de LRR (eLRR) y un dominio de
transmembrana son menos comunes. Diversos estudios revelaron que los dominios
LRR de varias proteínas R contribuyen al reconocimiento específico del
patógeno.
Investigaciones posteriores permitieron caracterizar otros tipos de dominios
presentes
en genes de resistencia. Por ejemplo, el gen de Arabidopsis RRS1, que
confiere
resistencia a Ralstonia solanacearum, es una proteína NB-LRR con un dominio
adicional WRKY en el C-terminal. Las proteínas WRKY son factores de
transcripción
con estructura de dedos de zinc que son inducidas durante la HR y que se unen
a
promotores activados durante la misma. De esta manera, la proteína RRS1
podría
unirse a ADN y activar genes que confieren un fenotipo de resistencia. Por el
contrario,
dos genes de resistencia Ve de tomate, confieren resistencia al hongo
Verticillium
alboatrum de manera independiente. Las dos proteínas Ve difieren levemente en
su
estructura. Ve1 contiene un posible dominio CC (coiled coil), pero no tiene
una
secuencia PEST en el extremo C-terminal, y Ve2 no contiene el dominio CC,
pero
contiene el dominio PEST. Los dominios PEST estarían involucrados en la
ubiquitinación y degradación de las proteínas.
BS2: gen de resistencia de pimiento (Capsicum annuum) que confiere
resistencia a
Xanthomonas campestris pv vesicatoria; Cf-2,4,5 y 9: genes de resistencia a
las razas
2, 4, 5 y 9 de Cladosporium fulvum; L6: gen de resistencia a la roya del lino
6; PBS1:
gen de Arabidopsis thaliana que confiere resistencia a Pseudomonas syringae
(la
proteína codificada por este gen es clivada proteolíticamente por el producto
del gen
avrPphB); Pto: gen de resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomato; RPG1:
gen de
resistancia a Puccin2ia graminis sp. tritici 1; RPM1: gen de resistencia a
Pseudomonas
syringae pv. maculicola (gen avrRPM1 o el gen avrB); RPP5: gen de resistencia
a
Peronospora parasitica; RPW8: gen de resistencia de Arabidopsis thaliana que
confiere resistencia a Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium
lycopersici; RRS1:
gen de resistencia a Ralstonia solanacearum 1; Xa21: gen de resistencia a
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae; ECS: señal de endocitosis; NLS: secuencia de
localización nuclear; PEST: secuencia Pro-Glu-Ser-Thr-like.
En la interacción compatible (a), en que el patógeno infecta y produce
enfermedad en
la planta, el producto de un gen de avirulencia interactuaría con y
modificaría a una
determinada proteína vegetal que es denominada “blanco de la virulencia” en
el
esquema que se muestra en la transparencia 33. Mediante esta interacción, el
microorganismo puede crecer y producir los síntomas típicos de la enfermedad.
En
una relación incompatible (b), la resistencia de la planta frente al patógeno
puede
desarrollarse por dos caminos: a) la proteína R1 reconoce e interactúa de
manera
directa con el factor de avirulencia. Este situación ocurre en raras
ocasiones; un
ejemplo de la misma es la interacción entre Avr-Pita y Pi-ta en la
interacción entre
Magnaporthe grisea y arroz; b) la proteína R2 es una proteína “guardiana” que
puede
reconocer a la proteína “blanco de virulencia” luego de que ésta es
modificada por su
interacción con el factor de avirulencia del patógeno.
La transparencia 34 esquematiza uno de los procesos de secreción mas
importante
descripto en bacterias fitopatógenas, el modelo de secreción tipo III mediado
por
proteínas tipo Hrp o Hairpin.
Harpin is one of a class of proteins produced in nature by certain bacterial
plant
pathogens. It acts by eliciting a complex natural defense mechanism in
plants,
analogous to a broad spectrum immune response in animals. While most
pesticides act
directly on the target pest, Harpin, by contrast, elicits a protective
response in the plant
that makes it resistant to a wide range of fungal, bacterial, and viral
diseases. Because
Harpin does not interact directly with disease pests, these organisms are not
expected
to develop resistance to it. Harpin protein can be used on a broad range of
crops,
including traditional field crops, minor use crops, turf and ornamentals.
With no
expected adverse effects to human health or the environment, use of Harpin
protein
has the potential to substantially reduce use of more toxic pesticides,
especially
fungicides and certain soil fumigants, such as methyl bromide.
La transparencia 35 ejemplifica el sistema de secreción tipo III basado en
efectores
TAL descripto para Xanthomonas
La planta y su sistema defensivo
Transparencia 36-42
La transparencia 37 puntualiza las diferencias entre inmunidad innata e
inmunidad
inducida. La transparencia 38 esquematiza el modelo de interacción plantabacteria,
distinguiendo la inmunidad inducida por efectores del tipo PAMP (Pathoen
Assocaited
Molecular Patterns) reconocida por receptores (PTI) de la inmunidad inducida
por
efectores específicos como los genes AVr que son reconocidos por genes R
(ETI)
En una interacción incompatible con el patógeno, la respuesta defensiva de
una planta
está frecuentemente asociada a una Respuesta Hipersensible (HR;
Hypersensitive
Response), la que se caracteriza por una necrosis rápida y localizada en
respuesta al
ataque del patógeno (bacterias, virus u hongos). La HR se basa en el
reconocimiento,
a través de una interacción directa o indirecta, del producto del gen de
avirulencia del
patógeno por receptores específicos codificados por los genes de resistencia
de la
planta (planta resistente). Alrededor de la zona de la respuesta HR se
acumulan
compuestos de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana (denominados
genéricamente fitoalexinas) muchas de las cuales pertenecen a la familia de
los
flavonoides. Al acumularse alrededor de la zona en que se produce la HR (zona
de
penetración inicial del patógeno), estos compuestos actúan inhibiendo su
dispersión a
otros tejidos. La ausencia del gen de resistencia en la planta o del gen de
avirulencia
en la bacteria implica el desarrollo de los síntomas típicos de la infección
(planta
susceptible). Luego de una HR, la planta adquiere resistencia en tejidos
distales al sitio
primario de infección. Esta resistencia, que protege a toda la planta, es
conocida como
Resistencia Sistémica Adquirida (SAR; Systemic Acquired Resistance). La
transparencia muestra, a modo de ejemplo, dos interacciones que inducen la HR
en
Arabidopsis thaliana. RPS2 (Resistance to Pseudomonas syringae 2) es un gen
de
resistencia que confiere resistencia a las cepas de P. syringae 2 que
expresan el factor
de avirulencia avrRpt2. RPM1 (Resistance to P. syringae pv maculicola 1) es
un gen
de resistencia de A. thaliana que induce resistencia a cepas que expresan el
gen de
avirulencia avrRPM1 (transparecnia 39).
La transparencia 40 muestra un esquema de los mecanismos moleculares
implicados
en el desencadenamiento de una respuesta defensiva inducible. Las proteínas
receptoras de la planta reconocen señales derivadas del patógeno o que surgen
de la
interacción entre el patógeno y el hospedante. Estas señales incluyen
productos
directos o indirectos de los genes de avirulencia (Avr), contacto físico, y
componentes
propios de cada especie como pueden ser quitinas, enzimas, y fragmentos de la
pared
celular vegetal. Los receptores de las plantas pueden ser o no productos de
los genes
de resistencia. Una vez reconocido el patógeno, la membrana plasmática
estimula
rápidamente el intercambio de iones con el medio extracelular. De esta forma,
se
incrementa la concentración intracelular de H+ y Ca2+, mientras disminuye la
de Cl- y
K+. Este intercambio de iones es un prerrequisito para la activación de las
proteín
quinasas activadas por mitógenos (MAPK; mitogen-activating protein kinase) y
de la
generación de especies de oxígeno reactivas (ROS; reactive oxygen species) a
través
de una NAD(P)H oxidasa asociada a membrana. Una vez activadas las MAPK,
algunas son traslocadas al núcleo y otras son rápidamente fosforiladas y
desfosforiladas. Finalmente, se produce la inducción transcripcional de un
considerable número de genes en la célula vegetal, entre ellos los de las
proteínas
relacionadas a la patogenicidad (PR; pathogenicity related proteins) y los
genes
involucrados en la biosíntesis de fitoalexinas, metabolitos secundarios
lipofílicos de
bajo peso molecular y con actividad antimicrobiana.
La transparencia 41 muestra un esquema general de la red de señalización que
controla la activación de la respuesta de la defensa local en las plantas.
Existen cinco
cascadas de señalización [denominadas (a), (b), (c), (d) y (e) en el esquema]
y
numerosas evidencias sobre la presencia de reguladores positivos y negativos
y sobre
la interacción de las diferentes cascadas. Cada cascada de señalización está
definida
por 4 clases características de proteínas codificadas por genes R. De acuerdo
con la
cascada en cuestión, estas proteínas son: (a) Pto, una proteín quinasa
serina/treonina;
(b) CC-NB-LRR; (c) TIR-NB-LRR; (d) RPW8. La resistencia mediada a través de
la
quinasa Pto (a) , involucra interacciones con RAR1 y con los factores de
transcripción
Pti4/5/6, lo que le permite activar directamente la expresión de los genes
relacionados
a la patogenicidad (proteínas PR). La proteína Prf es requerida río abajo en
la cascada
de resistencia mediada por Pto pero su posición no es precisa y no se muestra
en el
esquema. La mayoría de las proteínas CC-NB-LRR (b, c) requieren de NRD1 para
ejercer su función. Por otro lado, las proteínas R/TIR-NB-LRR son
dependientes de
EDS1. RPW8 opera a través de EDS1 y SGT1 (d). Un posible punto de
convergencia
para las cuatro cascadas mencionadas es RAR1/SGT1. Ambos componentes actúan
rio arriba de la Respuesta Hipersensible (HR) y la formación de especies
activas de
O2 (OB). El óxido nítrico es otra de las señales tempranas de defensa y puede
potenciar la HR y la formación de OB. En la cascada que involucra las
proteínas TIRNB-LRR, existe una potenciación de la respuesta debida a la
acción combinada de
EDS1 y PAD4, EDS5, SA, y NPR1. A su vez, EDR1, MAPK4 y SSI2 pueden reprimir
la
señal inducida por el ácido salicílico (AS). Varias proteínas que se unen a
SA
(proteínas SABPs) y que se localizan en distintos compartimentos celulares
podrían
estar modulando la disponibilidad de SA. Las especies activas de oxígeno
pueden
potenciar la acción del SA ya sea directamente o a través de una cascada de
proteín
quinasas, como por ejemplo SIPK. NPR1 es requerido río debajo de la acción
del SA.
El SA induce la translocación de NPR1 al núcleo, en donde, interactuando con
varios
factores de transcripción TGAs (factores que se unen a la secuencia TGACG de
ADN)
induce la expresión de genes PR. Las cascadas de señalización (a), (b), (c) y
(d) son
importantes en la resistencia a patógenos biotróficos. Otro camino de
señalización (e),
que induce la defensa contra patógenos necrotróficos, es el que involucra al
ácido
jasmónico/ácido 12-oxofitodienoico y al etileno en dos cascadas paralelas. La
primera
(cascada del ácido jasmónico), requiere secuencialmente de COL1 y JAR1. La
segunda` (cascada del etileno), requiere de EIN2 para la expresión de PDF1.2,
un
marcador de defensa. Las proteínas EDR1, MAPK4 y SSI2, participan de la
comunicación de las cascadas de ácido jasmónico y el etileno.
CET1/CET3: constitutive expression of thionin 1/3; COI1: coronatine
insensitive 1;
EDR1: enhanced disease resistance 1; EIN2: ethylene-insensitive 2; NDR1: nonrace
specific disease resistance 1; OPDA: 12-oxophytodienoic acid; PAD4:
phytoalexindeficient 4; PDF1.2: plant defensin 1.2; Pti4/5/6: Pto-interacting
4, 5 and 6; SID2: SA
induction deficient 2; SSI2: suppressor of salicylate insensitivity of NPR15.
La transparencia 42 esquematiza los componentes de la red de señalización que
participan de las respuestas de defensa sistémica. La Resistencia Sistémica
Adquirida
(SAR; Systemic Acquired Resistance) ocurre como consecuencia de la Respuesta
Hipersensible (HR). Esta respuesta temprana induce la SAR en zonas distales
no
infectadas del tejido vegetal y prepara a la planta para resistir ataques
posteriores. La
señal sistémica para esta respuesta podría ser un compuesto lipídico móvil
que
interactuaría con DIR1 (defective in induced resistance 1), una proteína
apoplástica
transportadora de lípidos, y desencadenaría la acumulación de ácido
salicílico (SA) y
SAG (SA 2-O-beta-D-glucósido) en distintos tejidos de la planta. La proteína
NPR1 es
requerida río abajo de la señal de SA. NPR1 se moviliza al núcleo, uniéndose
a varios
factores de transcripción de clase TGA que inducen la expresión de distintos
genes PR
(Pathogenicity Related). Los factores de transcripción WRKY son también
activados
durante el desarrollo de la SAR. SNI1 es un regulador negativo de la SAR que
actúa
río abajo de NPR1. Las proteínas EDS5, EDS12 y Dth9 juegan también un papel
en
SAR, pero su localización es incierta. La Resistencia Sistémica Inducida
(ISR; Induced
Systemic Resistance) por bacterias del suelo no patógenas, como las
rizobacterias,
requiere tanto de ácido jasmónico (AJ) como de etileno (ET) y de la proteína
NPR1.
Las proteínas EDS8, JAR1 y COI1 son requeridas para la ISR y su actividad se
localiza entre AJ y NPR1, mientras que las de ISR1 y EDS4 operan entre el
nivel de
acción del ET y de NPR1. La inducción de ISR requiere también de EDS10, la
que
actúa tanto rio abajo como arriba de NPR1. La ISR no involucra la acumulación
de
proteínas PR y no requiere de AS. Ambas respuestas, SAR e ISR, pueden ser
simultáneamente activadas. MAPK4, aumenta la señal mediada por AJ y suprime
la
señal de AS. Un tercer tipo de respuesta sistémica es llamada Respuesta
Independiente de SAR (SIR; SAR Independent Resistance). Este fenómeno, que no
involucra expresión de proteínas PR ni acumulación de AS, se activa a través
de un
mecanismo de regulación negativa, siendo la proteína SON un supresor de NPR1.
Dth9: detachment 9; ISR1: induced systemic resistance 1; JAR1: JA resistance
1; NPR1-1
inducible; SNI1: suppressor of SON1: suppressor of nim1-1; SAG: salicylic
acid glucoside.
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias mediante ingeniería
genética
Transparencia 43-70
En la transparencia 44 y 45 se enumeran diferentes estrategias que han sido
utilizadas
para obtener plantas resistentes a patógenos por técnicas de ingeniería
genética.
Entre estas estrategias, se incluye la producción de compuestos
antimicrobianos de
diverso origen no vegetal, la expresión de proteínas inhibidoras de la
patogenicidad o
virulencia, la activación del sistema defensivo de la planta y la muerte
celular inducida
en el sitio de infección. Existe gran diversidad de proteínas de orígenes
variados que
presentan actividad antibacteriana y/o antifúngica. Estas proteínas
constituyen un
componente clave en el mecanismo defensivo de todo organismo vivo, actuando
en
muchos casos en forma sinérgica junto con otros compuestos biológicamente
activos.
Pueden también actuar en forma aislada mediante efectos altamente
específicos. Las
transparencias presentan un listado de proteínas de que han sido expresadas
en
diferentes especies vegetales. El efecto de estas proteínas foráneas ha sido
evaluado
a través de ensayos de resistencia y/o tolerancia frente a patógenos fúngicos
y
bacterianos (se detallan las especies de bacterias usadas en los desafíos).
En la
columna de la derecha se resume el efecto o nivel de resistencia observado en
las
plantas transgénicas que expresan las proteínas de interés.
La transparencia 46 muestra la estructura de diferentes péptidos
antimicrobianos. La
amplia distribución de este tipo de moléculas en los reinos animal y vegetal
sugiere
que han cumplido un rol fundamental en su evolución como organismos
multicelulares
complejos. Constituyen armas defensivas de amplio espectro contra bacterias y
hongos. La mayoría de los péptidos antimicrobianos presenta una estructura
anfipática
en la que diferentes aminoácidos catiónicos y aminoácidos hidrofóbicos se
organizan
espacialmente en sectores discretos de la molécula. Los péptidos lineales
como la
cecropina y la magainina sólo adoptan esta conformación una vez que se
insertan en
la membrana en la que asumen una estructura anfipática secundaria en forma de
hélice.
Los péptidos antimicrobianos actúan frente a los microorganismos en forma
específica
(transparencia 47). La base de esta especificidad está determinada por la
diferente
naturaleza de la membrana de las células bacterianas y las células animales o
vegetales. En las bacterias, la membrana está organizada de forma tal que la
gran
mayoría de fosfolípidos con carga negativa está expuesta al medio externo. En
el caso
de las células de mamíferos y de plantas, la membrana presenta sólo lípidos
sin carga
neta hacia el exterior. Los lípidos con carga negativa se disponen hacia el
interior de la
célula, es decir, hacia el citoplasma. Por esta razón, los péptidos con carga
positiva se
unen electrostáticamente con los lípidos de carga negativa presentes en la
cara
externa de la membrana bacteriana, pero no interactúan con los lípidos que
constituyen las membranas de las células superiores.
La transparencia 48 ilustra un modelo para explicar el mecanismo de acción de
los
péptidos antimicrobianos propuesto por Shai-Matsuzaki-Huang. Se representa un
péptido con su estructura en -hélice. A: reconocimiento de la membrana
bacteriana
por parte de los péptidos. B: inserción del péptido a la membrana mediada por
la
atracción electrostática de cargas; adelgazamiento de la capa externa de la
membrana; se generan tensiones en la bicapa (flechas). C: formación de poros
en la
membrana. D: transporte de péptidos y lípidos a la capa interna de la
membrana. E:
acción de los péptidos sobre “blancos” intracelulares (en algunos casos). F:
colapso de
la membrana bacteriana y ruptura de la célula. Los lípidos representados en
amarillo
poseen carga negativa. Los lípidos representados en negro no poseen carga
neta.
La transparencia 49 presenta los resultados obtenidos a partir de ensayos de
infección
de plantas que expresan un péptido antimicrobiano (un análogo de magainina)
contra
P. syringae. Se muestran las fotos de un ensayo de infección en plantas de
Nicotiana
tabacum transformadas con el gen MSI-99. Se rasparon áreas de 5-7 mm en hojas
de
plantas transformadas R0 y de plantas control con un papel de lija fino y se
inocularon
en las mismas 10 l de 8.106, 8.105, 8.104, 8.103 y 8.102 células de P.
syringae pv
tabaci. Las fotos se tomaron 5 d post-inoculación. La hoja transgénica
muestra una
ligera decoloración, mientras que la hoja control muestra necrosis.
La sarcotoxina (transparencia 50) es un péptido antibacteriano aislado a
partir de
larvas de Sarcophaga peregrina por el laboratorio de Dr. Y. Ohashi de la
Universidad
de Tokio. Este péptido posee 39 aminoácidos y pertenece al grupo de las
cecropinas.
Las cecropinas son pequeños péptidos, aislados de la hemolinfa de insectos,
que
presentan actividad lítica y antibacteriana contra muchas bacterias Gram
positivas y
Gram negativas. Poseen una región N-terminal bastante básica y una larga
secuencia
hidrofóbica en el extremo C-terminal. Estas características determinan su
acción
antibacteriana a través de la formación de canales en las membranas que
provocan el
vaciamiento y muerte de las células bacterianas. En estudios in vitro, la
sarcotoxina
ha resultado altamente eficiente en la inhibición del crecimiento de algunas
bacterias
fitopatógenas tales como Xhantomonas axonopodis pv. Citri. Se ha comprobado
que la
expresión de sarcotoxina en plantas de tabaco bajo el control de un promotor
constitutivo aumenta la resistencia de estas plantas a P. syringae pv. tabaci
y E.
carotovora pv. carotovora. (transparencia 50). También en plantas de tabaco,
pero en
este caso transformadas con el gen de la sarcotoxina bajo el control de un
promotor
inducible por ácido salicílico (PR1a), se ha observado un aumento de la
resistencia
tanto a bacterias fitopatogénicas como a los hongos Rhizoctonia solani e
Pythium
aphanidermatum.
Estas enzimas del tipo lisozima catalizan la hidrólisis de la mureína,
constituyente de la
pared celular bacteriana. Las lisozimas se localizan en las vacuolas de
numerosas
especies vegetales por lo que entran en contacto con las bacterias
fitopatógenas una
vez que éstas han producido la lisis o ruptura de la célula vegetal. Pocas
lisozimas
vegetales han sido caracterizadas y clonadas, por lo que se han buscado
lisozimas de
otros orígenes para ser expresadas en plantas transgénicas, como las del
bacteriófago
T4 (los bacteriófagos son virus que infectan a las bacterias) y la del huevo
de gallina.
La transparencia 51 muestra la estructura del vector pSR-2, el que contiene
un gen
quimérico de la lisozima del fago T4 fusionado a la secuencia codificante del
péptido
señal de la -amilasa de cebada y es dirigido por el promotor de 35S del
Cauliflower
mosaic virus (CaMV). El gen de la lisozima del fago T4, uno de los miembros
más
activos de esta familia de enzimas bacteriolíticas, se expresó en plantas de
Solanum
tuberosum. Las plantas transgénicas obtenidas fueron infectadas con la
bacteria
fitopatógena E. carotovora pv. atroseptica bajo condiciones de laboratorio e
invernáculo. Usando una alta presión de infección, se observó una reducción
significativa en la maceración de los tejidos infectados. También se comprobó
que la
capacidad de brotación de los tubérculos transgénicos desafiados con el
patógeno
estaba sumamente disminuida.
Las transparencias 52-54 muestran los resultados obtenidos en ensayos de
infección
realizados con diferentes líneas transgénicas de Solanum tuberosum que
expresan un
gen quimérico de la lisozima del fago T4. La fotografía superior de la
transparencia 46
muestra un ensayo de brotación realizado con tubérculos dormidos que fueron
inoculados con E. carotovora pv. atroséptica (las 6 macetas de izquierda
portan
tubérculos de líneas transgénicas, mientras que las macetas 6 macetas de la
derecha
corresponden a tubérculos no transgénicos). Sólo los tubérculos
correspondientes a la
línea T424 fueron capaces de brotar luego de la infección en condiciones de
invernáculo. La foto superior presenta los resultados de un ensayo de
brotación de
tubérculos. El histograma de la parte inferior grafica los porcentajes de
brotación de
tubérculos transgénicos (T#) y de tubérculos no transgénicos (Z2) luego de
ser
infectados con E. carotovora.
Las transparencias 55-56 muestran otro ejemplo de resultados obtenidos en
ensayos
de infección con Erwinia caratovora realizados con diferentes líneas
transgénicas de
Solanum tuberosum que expresan tres genes: Dermaseptina de Phylomedusa
sauvagii, AP24 de Tabaco y Lisozima de Pollo
En otro trabajo, se transformaron plantas de tabaco con dos construcciones
diferentes
comprendiendo secuencias que codifican, respectivamente, α-tioninas de cebada
y
trigo. La transparencia 57 muestra un esquema de las construcciones genéticas
utilizadas. En el caso de la tionina de cebada, se utilizó la secuencia
genómica del
gen; en el caso de la tionina de trigo una copia de ADNc. Ambas
construcciones están
dirigidas por el promotor constitutivo 35S de CaMV. El terminador de la
transcripción
corresponde al gen de la octopina sintetasa. Se seleccionaron líneas
transformadas
por selección en kanamicina y las plantas transgénicas se desafiaron con
bacterias
fitopatógenas (P. syringae pv. tabaci 153 y P. syringae pv. syringae). La αtionina
purificada de las plantas transgénicas presentó los patrones de movilidad e
inmunogenicidad correspondientes a la proteína nativa y exhibió, in vitro,
las
propiedades antibióticas esperadas. Las transparencias 58-60 muestran
resultados
obtenidos en el mismo trabajo. Como se observa en las fotografías de la
transparencia
60, las plantas transgénicas que expresan el gen de la α-tionina (UPI),
mostraron
menor proporción de lesiones necróticas en comparación con la planta no
transgénicas (A). Se midió el número de lesiones en función de la expresión
de tionina,
observándose un incremento en el mismo en la medida que ésta disminuye. Se
tomaron por lo menos 10 plantas y 30 puntos en 3 experimentos independientes.
Se
ensayaron plantas de Nicotiana tabacum Samsun NN (SNN) no transformada,
plantas
de N. tabacum Samsun NN transformadas con un vector vacío (SNN+CS), plantas
homocigotas de transformantes UP1 y UP2 que expresan la tionina de cebada
(UP1
hz y UP2 hz), progenies de transformantes heterocigotos que expresan la misma
construcción (UP6 pg y UP7 pg) y plantas homocigotas de los transformantes
UP3 y
UP4 que expresan la tionina de trigo (UP3 hz y UP4 hz).
Otro ejemplo de resistencia conferida a bacterias y hongos es la snakina,
péptido
antimicrobiano, cuyos genes fueron aislados de papa y cuya sobreexpresión
confiere
resistencia al hongo Rhizoctonia solani y a la bacteria Erwinia carotovora
(transparecia
61)
Las toxinas inespecíficas son un importante componente de la virulencia de
hongos y
bacterias fitopatógenas. La faseolotoxina, una toxina producida por P.
syringae pv.
phaseolicola, inhibe específicamente una enzima involucrada en la biosíntesis
del
glutamato, la ornitilcarbamoil transferasa (OCTasa), lo que provoca necrosis
en los
tejidos afectados por la bacteria. Para protegerse de los efectos de la
toxina, la
bacteria posee una versión de la OCTasa resistente a la misma. La
transparencia 62
indica el mecanismo de acción de la faseolotoxina y presenta la estructura
química de
esta molécula. En el trabajo que se presenta en las transparencias 63-65, se
obtuvieron plantas transgénicas de Nicotiana tabacum que expresan el gen de
la
OCTasa bacteriana resistente a faseolotoxina, como estrategia para obtener
plantas
insensibles a la toxina y más resistentes al ataque de P. syringae pv.
phaseolicola.
Debido a que la ruta de síntesis del glutamato está localizada en los
cloroplastos, se
agregó a la secuencia del gen una secuencia que codifica un péptido de
transporte a
dicha organela (construcción SSU-OCTasa). La transparencia 56 muestra los
resultados obtenidos al evaluar la susceptibilidad a la faseolotoxina de la
OCTasa
presente en las plantas control y en las transgénicas. La actividad OCTasa
presente
en los controles fue inhibida en un 96% a una concentración de 35 ng/mL de
faseolotoxina, y en un 99% a una concentración de 375 ng/mL. En el caso de
las
plantas transgénicas que expresaban la construcción SSU-OCTasa, la inhibición
de la
enzima fue de entre 14 y 62% para las mismas concentraciones de
faseolotoxina. El
grado de inhibición de la OCTasa fue diferente para cada línea transgénica.
Este valor
fue mínimo en el caso de las líneas que presentaban mayores niveles de
expresión de
actividad OCTasa. Para evaluar si la presencia del transgen tenía un efecto
protector a
la faseolotoxina se aplicó esta toxina en las hojas de plantas control y
transgenicas
(transparencia 65). Las plantas control desarrollaron halos cloróticos
similares a los
que se observan en las infecciones de Phaseolus. Por el contrario, en las
hojas de las
líneas transgénicas tratadas con faseolotoxina no aparecieron halos
cloróticos. No se
apreció variación alguna en el contenido de clorofila en las hojas de las
plantas SSUOCTas tratadas con la faseolotoxina, mientras que las plantas
control presentaron una
disminución de clorofila del 30% a las 24 h de la aplicación de la toxina. En
la
transparencia 58 muestran los obtenidos al estudiar el comportamiento de las
plantas
transgénicas SSU-OCTasa en ensayos de infección con P. syringae pv.
phaseolicola
utilizando diferentes condiciones de inoculación. Se logró una interacción
compatible
entre la bacteria y N. tabacum al mantener las plantas en la oscuridad luego
de la
infección. La transparencia muestra fotografías de las plantas ensayadas: A)
y C):
aspecto general y detalle de una planta no transformada; B) y D): vista
general y
detalle de una hoja de una planta transgénica SSU-OCTasa. Las plantas de
tabaco no
transformadas (A) desarrollaron lesiones necróticas (C) que derivaron en una
infección
sistémica en algunas plantas. Estas plantas no se elongaron en respuesta a la
oscuridad y murieron. Por el contrario, las plantas transgénicas de tabaco,
inoculadas
bajo las mismas condiciones, no presentaron lesiones necróticas ni
desarrollaron
infección sistémica y se elongaron en respuesta a la oscuridad (B y D).
Xa21 es el primer gen de resistencia de arroz que ha sido bien caracterizado
(66-67).
La proteína codificada por este gen posee un dominio de quinasa
serina/treonina
similar al que posee Pto en tomate y es capaz de autofosforilarse en varios
sitios en el
curso de una interacción incompatible. Xa21 confiere resistencia a la mayoría
de las
razas de X. oryzae pv. oryzae (Xoo) y fue introducido por transformación
genética en
los cultivares Minghui 63-12 e IR72-82 susceptibles a Xanthomonas, con el
objetivo de
obtener resistencia. En la transparencia 67 se muestran los datos
correspondientes a
ensayos realizados en diferentes generaciones de plantas de la variedad
Minghui.
Panel A: línea 63-12; Panel B: línea IR72-82 y los respectivos controles no
transgénicos. La resistencia se mide como disminución del tamaño de las
lesiones
foliares. Los datos fueron obtenidos a los 14 d luego de la inoculación con
Xanthomonas. El panel C ilustra la reducción de los síntomas observada en las
plantas
transgénicas (izquierda) en comparación con las plantas control no
transgénicas
(derecha). Otro de los genes de resistencia, además del Xa21, aislados de
arroz y que
confiere resistencia a X. oryzae pv. oryzae, es el gen Xa26. Si bien ambos
genes
codifican para proteínas muy similares, el Xa26 confiere resistencia a
plantas jóvenes
como adultas. Mientras que el gen Xa21 sólo tiene efecto en plantas adultas,
lo que
sugiere que estaría regulado por genes involucrados durante el desarrollo de
la planta.
El gen Xa26 (transparencia 60) fue aislado del cultivar Minghui 63 (MH63,
Oryzae
sativa ssp. indica), moderadamente resistente a Xhantomonas, y transferido al
cultivar
susceptible Mudanjiang 8 (MDJ8, O. sativa ssp. japonica). En la gráfica
superior de la
transparencia 68, se presenta el crecimiento bacteriano en escala logarítmica
para el
cultivar susceptible, el moderadamente resistente y la planta susceptible
transformada
con el gen Xa26, observándose un considerable incremento de la resistencia (o
menor
crecimiento bacteriano) en ésta última respecto de las dos primeras. En el
panel
inferior se pueden apreciar los síntomas producidos por X. oryzae pv. oryzae
sobre
plantas de arroz y se comparan plantas resistentes y susceptibles. Se
presentan líneas
transgénicas para el gen Xa26 (Rb17 y Rb18), resistentes (IRBB3),
moderadamente
resistente (MH63) y susceptibles (IR24 y MDJ8) y la F1 (filial 1) de un
cruzamiento
entre MDJ8 y MH63. Se pueden observar diferencias significativas en la
longitud de
las lesiones. Las plantas transformadas con el gen Xa26 mostraron mayor
resistencia,
incluso cuando se las compara con la línea donante del gen Xa26 (MH63). Este
resultado sugiere que la resistencia conferida por Xa26 está condicionada por
el fondo
genético del cultivar receptor.
El gen Pto de tomate codifica una proteín quinasa de serina/treonina que le
confiere a
la planta resistencia a las cepas de P. syringae pv tomato que contienen el
gen avrPto.
La transparencia 69 muestra los resultados de un trabajo en que se introdujo
el gen de
resistencia de tomate Pto en plantas de tabaco. Como se muestra en la
gráfica, se
observó un aumento de la resistencia de estas plantas a P. syringae pv tabaci
que
expresan el gen avrPto. En comparación con las plantas no transformadas de
tabaco,
las plantas transgénicas mostraron un desarrollo más rápido de la Respuesta
Hipersensible (HR), un descenso en la formación de síntomas y disminución del
número de bacterias en las hojas inoculadas. La figura muestra el crecimiento
de P.
syringae pv tabaci en plantas de tabaco transformadas con el gen Pto (líneas
sólidas)
y en plantas control no transformadas (líneas discontinuas). Se inocularon
hojas
completamente expandidas de plantas de 9 semanas con 106 cfu/mL de bacterias
que
expresan el gen avr/Pto (cuadrados) o que no lo poseen (triángulos). Los
tipos de
interacciones que se indican son: [1]: incompatibilidad (presencia de gen R y
gen avr);
[2]: compatibilidad (ausencia del gen R y presencia del gen avr); [3]:
compatibilidad
(presencia del gen R y ausencia del gen avr); [4]: compatibilidad (ausencia
del gen R y
del gen avr).
Una estrategia mas reciente se basa en la resistencia conferida por la
expresión de
receptores de PAMPs de patógenos con la ventaja de conferir un tipo de
resistencia
horizontal eficaz sobre distintas especies de patógenos ( transparencia 70)
Regulación de factores de virulencia
Transparencia 71-81
Las bacterias fitopatógenas han desarrollado una serie de compuestos que
contribuyen para que éstas puedan invadir y colonizar los respectivos
hospedadores.
Estos compuestos o factores de virulencia, determinan la patogenicidad y el
grado de
virulencia del patógeno. Dependiendo de la interacción planta-bacteria, las
bacterias
producen factores, algunos de los cuales son comunes y otros específicos para
cada
interacción patógeno-hospedador.
Muchos de estos factores son proteínas que son inyectadas directamente en la
célula
hospedadora (proteínas efectoras) a través del sistema de secreción tipo III
(SST-III),
un sistema común entre las bacterias patógenas tanto de plantas como
animales, y
que se induce cuando la bacteria toma contacto con el hospedador.
Lamentablemente
para el agente patógeno, estas proteínas son moléculas ideales para ser
reconocidas
por el sistema de defensa de la planta (sistema gen a gen). En donde la
planta, a
través de una proteínas de resistencia (proteína R) puede "reconocer" la
presencia de
determinada proteína efectora (proteína AVR), desencadenando la ya mencionada
respuesta hipersensible (HR).
Algunos de los factores de virulencia han sido caracterizados recientemente
como
supresores de la respuesta de defensa vegetal y le permiten a la bacteria
promover su
crecimiento y difusión dentro del tejido vegetal. Varios de estos incluyen
proteínas
efectoras secretadas por el SST-III, pero también exopolisacáridos y
fitotoxinas, han
sido reseñadas en la literatura.
Las bacterias no viven aisladas sino que forman una comunidad estructurada,
coordinada y funcional que se denomina comúnmente biopelícula o biofilm.
Se ha podido observar una relación directa en la capacidad de producir
biofilms y la
virulencia de estas bacterias. Los biofilm son estructuras importantes en el
desarrollo
bacteriano y podrían ser un blanco muy apropiado para contrarrestar las
enfermedades producidas por éstas en los respectivos hospedadores.
Entre las ventajas que le proporciona a la bacteria poseer la capacidad de
desarrollar
un biofilm, podemos mencionar:
 Protección del medio ambiente
 Mayor disponibilidad de nutrientes
 Cooperación entre especies (microconsorcio; sintrofismo)
 Adquisición de nuevas características genéticas
La formación de biofilms requiere de la capacidad de las bacterias de unirse
a distintas
superficies, en particular el tejido vegetal. Para lograr esta asociación as
bacterias
utilizan diversas moléculas entre las cuáles están los exopolisacáridos (EPS)
y las
proteínas de superficie. La expresión de los genes involucrados en la
síntesis de estas
moléculas de adhesión, así como otros factores de virulencia, están regulados
por
mecanismos dependientes de la densidad celular. Cada especie bacteriana
responde
a sus propias señales ambientales a través de un conjunto de mecanismos
moleculares. A pesar de esta gran diversidad, hay un sistema conservado de
regulación que responde a varios estímulos que son importantes para la
asociación
entre bacterias y plantas. El sistema de regulación de la formación de
biofilm, al igual
que algunos factores de virulencia, en particular las enzimas extracelulares
y los EPS,
son dependientes del número de bacterias presentes, o del mecanismo
comúnmente
denominado quorum sensing.
El fenómeno de quorum sensing fue reconocido en la década de los 60 en
estudios
realizados con la bacteria Vibrio fischeri. Esta bacteria marina
bioluminiscente produce
luz sólo cuando hay una gran cantidad de bacterias presentes. Se observó que
la
luminiscencia se producía por acumulación de un activador o molécula
“autoinductora”.
Esta molécula es producida por la bacteria y activa la luminiscencia cuando
alcanza
una determinada concentración crítica. Las bacterias son capaces de sensar su
densidad de población a través de la detección de esta molécula
autoinductora. Al
mecanismo del sensado de la densidad celular se lo llamó quorum sensing y la
molecula activadora producida por V. fischeri fue aislada en el año 1981,
siendo
identificada como una N-(3-oxohexanoyl)-homoserin lactona, con una estructura
similar a la que se muestra en la figura de la transparencia 68.
El quorum sensing es un proceso relativamente simple. Las acil-homoserin
lactonas
(HSL) son sintetizadas a bajo nivel basal por las acil-HSL sintasas
(generalemente
homólogas a las proteínas tipo LuxI de V.fisheri). Las moléculas de acil-HSLs
sintetizadas son rápidamente liberadas por las células bacterianas por
difusión. El
incremento en el tamaño de la población bacteriana eleva la concentración de
las acilHSLs. A pesar de que cada célula individual produce un bajo nivel de
acil-HSL, al
agregarse la población bacteriana produce mayores concentraciones de estas
moléculas señal. A niveles elevados, las acil-HSLs interactúan con un factor
de
transcripción (homólogo a la proteína LuxR de V. fisheri) que modula la
expresión de
de los genes regulados por quorum sensing.
La transparencia 74 muestra un modelo simplificado de la traducción de
señales en el
proceso de quorum sensing. En la regulación de factores de virulencia a
través de
quorom sensing, las proteínas I y R juegan un rol central. La célula
bacteriana (en
gris) contiene una proteína I que es responsable de la síntesis de moléculas
difusibles
(en verde) de acil homoserin lactonas (A-HSLs), las que actúan como
señalizadoras. A
una alta concentración celular, las moléculas señalizadoras interactúan con
la proteína
R. La interacción con la misma induce un cambio conformacional que aumenta su
afinidad por determinadas secuencias de ADN (secuencias lux) presentes en las
regiones promotoras de los genes regulados por acil homoserin lactonas.
La transparencia 75 muestra un modelo del mecanismo de acción de los genes
rpf. La
bacteria Xanthomonas produce enzimas (endoglucanasas, pectinasas, proteasas y
lipasas) y polisacáridos (EPS) extracelulares. Uno de estos polisacáridos es
denominado xantano. Se ha postulado que estos factores estarían involucrados
en la
patogénesis; no obstante, sus mecanismos de acción son desconocidos. En X.
camprestris pv campestris (Xcc), un patógeno que afecta crucíferas, la
producción de
las enzimas extracelulares y de EPS está regulada por el grupo de genes rpf
(regulation of pathogenicity factors), compuesto por 9 genes (rpfA-I). Los
genes rpfB y
rpfF están implicados en la regulación mediada por pequeñas moléculas
difusibles
denominadas DSF (diffusible signal factor), las cuales actuarían como
comunicadoras
intercelulares. En el modelo que se presenta, los cambios en el ambiente o en
los
mismos DSF (representados en la figura con triángulos violetas), interactúan
con el
dominio sensor de la proteína RpfC; esto estimula la autofosforilación de
este dominio,
desencadenando una serie de fosforilaciones (representadas por línea
punteada)
sobre la proteína reguladora RpfG. RpfH podría actuar como una proteína
accesoria
para la unión de ligandos. En el esquema, los residuos de histidina y
aspartato
involucrados en la fosforilación están representados como H y D. P indica el
grupo
fosfato. La proteína RpfG fosforilada regula positivamente la expresión de
genes
requeridos para la patogenicidad, incluyendo aquellos que codifican una
endoglucanasa (engXCA), una proteasa (prtA) y al grupo de genes gum, que
codifican
proteínas involucradas en la producción del xantano.
La transparencia 76 muestra un esquema de las diferentes estrategias que
pueden
utilizarse para interferir la comunicación entre células bacterianas. Los
microorganismos censan sus poblaciones a través de un sofisticado mecanismo
de
comunicación celular. Cuando la densidad celular alcanza un determinado
umbral se
dispara la expresión de determinados genes. Este tipo de regulación que
controla
diversas funciones biológicas, entre ellas las de virulencia, es conocido
como
autoinducción o quorum sensing. Las moléculas señalizadoras esenciales de
este
sistema son la acil-homoserin lactonas (acil-HSL). Existen diferentes
mecanismos que
afectan la regulación por acil-HSL. Existen mecanismos bioquímicos que
interfieren en
la comunicación entre bacterias a nivel de la generación de la señal: por
ejemplo la
inhibición de la síntesis o de la transferencia de estas moléculas señal o de
sus
precursores. Existen además posibles interferencias en el transporte y en la
recepción
de la señal. Otras estrategias de interferencia a la comunicación entre
células
bacterianas se relacionan con la degradación de las acil-HSL.
Algunos
microorganismos son capaces de sintetizar compuestos que imitan a las acilHSL con
el objeto de interferir la comunicación entre otras especies y competir con
ellas por
nichos ecológicos.
La transparencia 77 presenta los diferentes mecanismos que afectan la
regulación por
acil homoserin lactonas (acil-HSL). Las moléculas que degradan acil-HSLs (la
aminoacilasa de Variovax sp. y la lactonasa de Bacillus sp.) atenúan la
virulencia de
los patógenos que las utilizan como moléculas señalizadoras. Entre las
moléculas que
interfieren con el sistema de señalización entre bacterias mediado por acilHSLs están
las furanonas. Por ejemplo, las furanonas halogenadas producidas por el
microalga
marina Delisea pulchra inhiben el quorum sensing entre bacterias, impidiendo
la
formación de biofilmes en Pseudomonas spp. y anulando factores de virulencia
en E.
carotovora. La estrategia de los organismos oportunistas consiste en que
cuentan con
homólogos de la proteína Lux-R por lo que reconocen las acil-HSLs de otros
organismos e interfieren en su mecanismo de comunicación. No son productores
de
acil-HSLs propias.
Se ha demostrado recientemente que el gen aiiA de la bacteria Gram positiva
Bacillus
sp. 240B1, codifica una aminoacilasa (acil-homoserin lactonasa; acil-HSLasa)
capaz
de degradar las moléculas de acil-homoserin lactonas (acil-HSL) y liberar
homoserin
lactonas. Se introdujo el gen aiiA en plantas Nicotiana tabacum y Solanum
tuberosum,
para evaluar el efecto de la acil-HSLasa en ensayos de infección con E.
carotovora. La
transparencia 78 muestra resultados de dicho trabajo. Se muestran hojas de
tabaco
inoculadas (de arriba a abajo) con 60.000, 6.000 y 600 unidades formadoras de
colonias (ufc) a las 20 h de la inoculación. En el panel de la derecha, se
muestran
rodajas de tubérculos inoculados con E. carotovora con un inóculo de 25.000
ufc las
48 h de la inoculación. Como puede observarse, la expresión de acil-HSLasa
interfirió
con la patogenicidad incrementando la resistencia a la infección bacteriana.
La producción de N-oxoacil-homoserin lactona (OHL) juega un papel esencial en
el
control de los factores de virulencia durante la infección por Erwinia
carotovora en
tabaco. Los genes bacterianos que codifican enzimas que degradan la pared
celular
vegetal, son inducidos en presencia de una alta densidad de bacterias. Esta
densidad
es detectada por el censado de OHLs presentes en el medio extracelular. Los
productos de degradación de la pared vegetal pueden también inducir una
respuesta
defensiva de la planta, pero la alta densidad bacteriana impide que ésta sea
exitosa. El
mecanismo de quorum sensing, que regula estos factores de virulencia, podría
ser
importante para el establecimiento de una infección exitosa, evitando que la
bacteria
pueda ser detectada prematuramente. Con la idea de alterar la expresión de
los
factores de virulencia, se introdujo el gen expI de E. carotovora, (que
codifica la
enzima responsable de la síntesis de OHLs) en plantas de Nicotiana tabacum.
La
presencia de las OHLs en la planta al inicio del curso de la infección induce
la
expresión de los genes de virulencia, proceso que normalmente no ocurre hasta
que la
población bacteriana alcanza una densidad mayor. La inducción de la defensa
vegetal
en forma temprana puede contrarrestar la infección bacteriana debido a la
baja
densidad celular. En la transparencia 79 se muestran resultados de ensayos de
infección con E. carotovora de plantas de tabaco transgénicas. Se muestran
dos hojas
provenientes de plantas transgénicas (A) que expresan el gen expl y de una
planta
control no transformada (B). Se observó que la bacteria posee reducida
capacidad de
producir síntomas en la planta transgénica (comparar A con respecto a B). En
el
histograma se observan los resultados obtenidos (% de plantas infectadas)
para dos
líneas transgénicas (barra verde y anaranjada) y una planta no transgénica
(barra
violeta). El % de plantas infectadas, con desarrollo de síntomas, es
sensiblemente
menor en las dos líneas transgénicas respecto de lo observado para la planta
no
transformada. Estos valores se obtuvieron 24 y 48 h post-infección.
Las transparencia 80 esquematiza el sistema de secreción Tipo III descripto
para
Xanthomonas y la 81 resume las aplicaciones biotecnológicas de este tipo de
sistema
de secreción en estrategias de incorporación génica dirigida como “gene
targeting”.
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