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El pez cebra: un organismo modelo
para estudios genéticos en
vertebrados
Lucía F. Franchini
Laboratorio de Genética y Evolución Molecular
INGEBI-CONICET
Buenos Aires, 25 de agosto de 2016
Características
• Danio rerio (pez óseo, teleósteo)
• Orden: Cipriniformes
• Familia: Ciprinidae (carpas,
barbos, goldfish, tencas, gobios)
IG 2015
L González
Habitat natural
• Pez de agua dulce.
• Sur de Asia (India, Pakistán, Nepal, Bangladesh, Burma y Bután).
• Omnívoros (insectos adultos y larvas, pequeños crustáceos y otros
zooplanctons, algas, materia vegetal, detrito).
IG 2015
L González
Desarrollo embrionario
IG 2015
L González
¿Porqué es un buen modelo?
• Pequeño tamaño (4-5 cm).
• Facilidad de cría.
• Desarrollo externo.
• Reproducción continua.
• Tiempo corto de generación (3-4 meses).
• Alta fecundidad (huevos transparentes).
• Embriogénesis rápida (similar a la de vertebrados superiores).
• Alto grado de conservación génica con humanos (70% genes).
• Conservación funcional en procesos biológicos básicos.
✓ Genoma secuenciado
✓ Mutantes disponibles
✓ Herramientas para transgénesis
✓ Knockdowns (morfolinos); Knockouts
IG 2015
✓ Edición de genoma por CRISP-Cas9
L González
Cría en el laboratorio
Our Zebrafish facility
IG 2015
L González
Our Zebrafish facility
IG 2015
L González
IG 2015
L González
IG 2015
L González
IG 2015
L González
Genoma zebrafish
IG 2015
L González
Duplicación del genoma (WGD)
teleósteos
whole genome
duplication (WGD)
IG 2015
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ZFIN – Zebrafish International Resource Center
www.zfin.org
IG 2015
L González
Transgénesis
IG 2015
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Tol2: elemento transponible de Medaka
Tol2: elemento transponible de Medaka
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Ensayo de expresión transiente en zebrafish
IG 2015
L González
Expresión estable en zebrafish (líneas)
IG 2015
L González
expresión transiente
(mosaico)
IG 2015
pEF1α-EGFP
expresión estable
(línea)
L González
Kawakami lab (www.kawakami.lab.nig.ac.jp)
IG 2015
L González
Kawakami lab (www.kawakami.lab.nig.ac.jp)
IG 2015
L González
pEF1α-EGFP
IG 2015
L González
Gene trap
IG 2015
L González
Enhancer trap
IG 2015
L González
Estudio de enhancers
PCR
TOL2(R
)
IG 2015
Enhancer
Prom cFos
GFP
TOL2(L
)
L González
Zebrafish Mutation Project (www.sanger.ac.uk/resources/zebrafish/zmp)
Morfolinos
IG 2015
L González
estudio funcional de genes
inactivación de genes específicos
pez cebra (zebrafish)
MORFOLINOS
IG 2015
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Características
anillo
morfolino
enlace fosforodiamidato
• Derivado sintético de ADN
• Mismas bases que ADN
• Anillo morfolino
• Enlace fosforodiamidato (neutro, resistente a nucleasas)
• Alta estabilidad
• Molécula pequeña (18-25 nt) ⇨ buena difusión intracelular
• Efecto de dilución (ventana temporal de acción) y no específico (off-target)
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Mecanismos de acción (knockdown)
Hibrida e interfiere con ARNm blanco (impedimento estérico):
A) Inhibición de traducción
IG 2015
L González
Mecanismos de acción
B) Alteración del splicing
IG 2015
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Controles - Efectividad del knockdown
A) Inhibición de traducción
Western blot
Inmunohistoquímica/inmunofluorescencia
B) Interferencia de splicing
RTPCR
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inclusión de intrón
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Controles - Especificidad del knockdown
•
Fenotipo similar a mutantes reportados
•
Fenotipo similar con más de un morfolino (≠ mecanismos de acción)
•
Fenotipo co-inyectando dos morfolinos ≠ a concentraciones subóptimas
•
Rescate de fenotipo co-inyectando ARNm de gen blanco
•
Inyección de morfolino mismatch (5 nucleótidos cambiados), standard
(GeneTools) o scramble
•
Co-inyección de morfolino contra p53
IG 2015
USD 400
IG 2015
Microinyección
Embriones en estadio de 1-4 células
Medio de inyección: KCl (100μM) y rojo fenol (0.2%)
IG 2015
L González
Microinyección
IG 2015
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CRISPRCas9
IG 2015
L González
Edición génica mediada por CRISPR-Cas9
Clustered regularly interspaced short
palindromic repeats
(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)
system
IG 2015
L González
Edición génica mediada por CRISPR-Cas9
IG 2015
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