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Enero 2016
Fecundación y desarrollo
temprano de animales
Taller del Proyecto de Laboratorios
Portátiles para la enseñanza de la Biología
en la Educación Media
11 al 15 de enero de 2016
Facultad de Ciencias, Universidad de Chile
www.uchile.cl
www.genomacrg.cl
Enero 2016
Instructores
Geraldine Aedo
Consuelo Anguita
Myra Chávez
Sandra Edwards
Rodrigo Gómez
Javiera de La Paz
Daniela Gutiérrez
Victor Guzmán
Fernanda Lourido
Claudia Molina
Carlos Muñoz
Cristina Muñoz
Salomé Muñoz
Rodrigo A. Morales
Luisa Pereiro
Diego A. Rojas
Laboratorios
Prof. Juan Fernández
Facultad de Ciencias, Universidad de Chile
Prof. Alvaro Glavic
Centro de Regulación del Genoma
Facultad de Ciencias, Universidad de Chile
Prof Miguel L Allende
Centro de Regulación del Genoma
Facultad de Ciencias, Universidad de Chile
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Enero 2016
Introducción.
La biología del desarrollo es una disciplina que surge de la fusión de
numerosas áreas de la biología moderna, incluyendo la embriología, la genética, la
biología celular, la evolución y la genómica. Numerosos descubrimientos de vital
importancia científica y de relevantes aplicaciones biomédicas han surgido de la
biología del desarrollo. Se hace necesario que la sociedad conozca, en lo posible,
algunos conceptos elementales para entender las consecuencias de estos avances y
para tener opinión respecto a políticas públicas que se basen en este conocimiento.
Las células madre, la clonación, la edición de genomas, los organismos transgénicos
son todos desarrollos tecnológicos que involucran aspectos de la biología del
desarrollo y que aparecen cotidianamente.
El objetivo de este taller es brindar un conocimiento básico del desarrollo
embrionario y post embrionario de las especies animales. Por razones de tiempo y
espacio, hemos dividido el curso en sesiones teóricas, para proporcionar el
conocimiento necesario para la comprensión de los fenómenos, y experiencias
prácticas, para visualizar in situ muchos de los conceptos y descripciones hechas de
manera teórica. La biología del desarrollo es una disciplina eminentemente visual; es
necesario experimentar y observar directamente los fenómenos para comprenderlos
en su justa dimensión. Además, los embriones tienden a ser estéticamente atractivos,
siendo muchas veces hermosas estructuras vivientes que impresionan y motivan. Es
decir, se prestan especialmente bien a la difusión de la ciencia entre los niños y
jóvenes ya que se maravillan fácilmente al tener un organismo en desarrollo frente a
sus ojos. La gran pregunta que nos hacemos los que cultivamos esta disciplina es:
“cómo se forma un organismo adulto a partir de una sola célula?” Si bien, en las
últimas décadas hemos avanzado enormemente en el campo, debemos reconocer
que no estamos cerca aún de responder satisfactoriamente esta pregunta. Este
misterio también genera gran curiosidad y por ello, muchos jóvenes se sienten
atraidos por el estudio del desarrollo embrionario.
El taller se centrará principalmente en dos modelos animales, la mosca del
vinagre Drosophila melanogaster y el pez cebra, Danio rerio. Estos modelos se han
usado por décadas para estudiar el desarrollo gracias a la facilidad con que se
pueden mantener en el laboratorio y a las poderosas herramientas genéticas y
celulares disponibles con ellos.
Recomendamos, si se quiere profundizar en el tema, el libro Developmental
Biology de W. Gilbert, que tiene algunas ediciones traducidas al español.
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Conceptos fundamentales del taller.
Esta guía describe las actividades a realizar en el taller de “Fecundación y
desarrollo embrionario en animales” para profesores de enseñanza media. El taller
tiene por objeto familiarizar a los profesores con el material y las actividades que se
podrán llevar a cabo con el laboratorio portátil del mismo nombre. Se procura
proveer de un marco teórico para las actividades que exponga los conceptos que
interesa transmitir, resumidos a continuación:
1. La meiosis es clave para mantener la dotación cromosómica constante
(reduciendo a la mitad la dotación cromosómica en cada gameto) y permite además
la variabilidad genética de las especies. En la fecundación, el espermio contribuye
con su material genético nuclear y otros componentes limitados. El oocito en cambio,
aporta nutrientes, proteínas, ribosomas, mitocondrias, y el grueso de los elementos
que participan en la construcción del embrión temprano.
2. La fecundación inicia el desarrollo embrionario. Se gatillan procesos
gobernados por componentes maternos, primero, y luego cigóticos. El clivaje
aumenta el número de células y prepara el embrión para la morfogénesis y la
diferenciación celular.
3. Cada especie tiene un programa determinado genéticamente, que define la
secuencia de eventos que formarán el embrión, incluyendo los clivajes y plan
corporal que dará origen a los diferentes tejidos. Mutaciones en los genes
involucrados en el desarrollo, generan defectos o malformaciones que nos revelan
cuál es la función de esos genes.
4. A medida que la embriogénesis progresa, el número de células
totipotenciales (células madre) va disminuyendo y la mayoría se diferencia en células
de tejidos específicos.
5. El desarrollo se organiza gracias a un programa genético intrínseco pero
puede modificarse externamente por factores ambientales. Existen etapas del
desarrollo embrionario muy sensibles a estas perturbaciones (físicas o químicas) y
que pueden ser muy perjudiciales para la sobrevivencia del individuo.
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Consideraciones bioéticas.
En este trabajo práctico o laboratorio portátil, se trabajará con seres vivos. Los
animales de experimentación o de enseñanza deben ser tratados con el máximo
respeto y cuidado. En los laboratorios científicos, los animales están protegidos por
rigurosas normativas bioéticas que garantizan su bienestar y el uso restringido y
limitado de ellos. Lo mismo debemos intentar cuando llevamos estas experiencias
fuera del laboratorio. Las normas para el uso de animales de experimentación
respetadas internacionalmente sugieren regirse por el concepto de las tres “R”:
replacement, reduction, refinement (reemplazo, reducción, refinamiento). La idea es
usar el menor número de animales posible, cuando sea posible, evitarlo, y minimizar
o impedir su sufrimiento. En la legislación de muchos países se hace distinción entre
animales vertebrados (como el pez cebra) e invertebrados (como Drosophila).
También se hace una diferencia según el estado de desarrollo ya que los embriones
muchas veces no son considerados “animales” en el sentido de un ente con algún
grado de consciencia (sentience). En este laboratorio portátil procuraremos evitar la
muerte o el daño innecesario a embriones y adultos de ambas especies en los
estadíos donde ya exista un sistema nervioso funcional. Es importante seguir las
instrucciones de los profesores y ayudantes en el manejo de los animales y observar
de cerca cómo se realizan las manipulaciones. Cuando sea necesario, se anestesiarán
los animales para evitarles sufrimiento. La eutanasia, será realizada sólo por personas
entrenadas en ello. No se debe desechar ningún animal vivo o muerto en basureros o
desagues; usaremos lugares especialmente designados y dedicados a ello. Por
último, el trabajo de laboratorio con animales vivos debe realizarse de manera
calmada y silenciosa para no perturbarlos.
Clairvoyance (autorretrato).
Rene Magritte, 1936.
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PROGRAMA DEL TALLER DE FECUNDACION Y
DESARROLLO EMBRIONARIO
UNIDAD 1: GAMETOGÉNESIS Y FECUNDACIÓN
Objetivo Específico 1:
Analizar el origen y características de los gametos
Contenidos:
Teórico:
Diferenciación celular durante la gametogénesis
Proceso de reducción y recombinación del material genético (meiosis)
Transcripción, organelogénesis y vitelogénesis
Objetivo Específico 2:
Analizar los tipos de reproducción
Contenidos:
Teórico:
Reproducción interna vs externa
Variabilidad genética
Objetivo Específico 3:
Conocer los eventos moleculares y celulares que ocurren durante la
fecundación
Contenidos:
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Teórico:
Requerimientos del proceso de Fecundación
Activación del huevo
Reconstitución de la dosis genética
UNIDAD 2: DESARROLLO TEMPRANO DEL PEZ CEBRA Danio rerio
Objetivo Específico 1:
Conocer el proceso de ovogénesis
Contenidos:
Teórico:
Estructura del ovario
Fases de la ovogénesis
Características morfológicas y particularidades
Síntesis y distribución de los determinantes maternos
Estructura del ovocito al momento de la fecundación
Práctico:
Disección del ovario
Observación de la diferentes etapas de la ovogénesis
Objetivo Específico 2:
Distinguir los cambios que ocurren en la activación y fecundación del huevo
Contenidos:
Teórico:
Penetración del espermio y prevención de la poliespermia
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-
Reacción cortical y formación de la envoltura vitelina (corión)
Movimientos de los organelos internos del huevo fecundado
Flujo citoplásmico y formación del disco embrionario
Práctico:
Observación del desarrollo de huevos activados y fecundados y no
fecundados
Observar los cambios de forma que acompañan el proceso de
fecundación: formación del blastodisco
Observar la formación de canales de flujo citoplasmático rápido
(”streamers”).
Objetivo Específico 3:
Analizar las características del proceso de clivaje y la blastulación, Reconocer el
momento de transición de la blástula intermedia.
Contenidos:
Teórico:
Analizar los procesos que llevan a la primera división mitótica en el
embrión
Tipo de clivaje y sus características durante los ciclos celulares 1-5 y 6 en
adelante
Características y clasificación de la blástula
Modificaciones del desarrollo durante la transición de la blástula
intermedia (TBM) y sus consecuencias
Fin de la blastulación e inicio de la gastrulación. Desplazamiento
epibólico del blastodermo
Práctico:
zigoto de D.rerio con énfasis en el crecimiento del disco embrionario y
su clivaje regular durante lasa primeras divisiones celulares
Distinguir tipos celulares los diferentes tipos de blástula hasta el 50% de
epibolía
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-
¿Cómo establecer la TMB?
Observación de mutantes de efecto materno vs cigótico
UNIDAD 3: DESARROLLO DEL INSECTO Drosophila melanogaster
Objetivo Específico 1:
Conocer el ciclo de vida y características principales
Contenidos:
Teórico:
Ciclo de vida
Embriogénesis. Gastrulación y establecimiento del plan corporal
larvario. Proceso de segmentación.
Organogénesis. Regulación de la expresión génica y la selección de la
identidad celular
Desarrollo larvario y metamorfosis. Control hormonal del desarrollo
Práctico:
Observación de cultivos de Drosophila melanogaster
Reconocer las diferentes etapas del desarrollo y sus principales
características
Observación de las estructuras larvarias internas
Objetivo Específico 2:
Reconocer cómo el genoma es determinante del desarrollo
Contenidos:
Teórico:
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Regulación génica, jerarquías de regulación, patrones de expresión y
diferenciación en el tiempo y espacio.
Genes de efecto materno
Genes controladores y selección de tipos celulares
Mutantes y transgénicos
Práctico:
Observación las etapas tempranas del desarrollo
Observar los cambios de forma que acompañan el desarrollo
Observación de mutantes y transgénicos.
Objetivo Específico 3:
Conocer los mecanismo de control hormonal del desarrollo
Contenidos:
Teórico:
Cromosomas politénicos y las diferencias con cromosomas mitóticos e
interfásicos
Señales hormonales e integración con el medio
Metamorfosis y transiciones del desarrollo
Reestructuración del plan corporal
Gametogénesis y terminación el ciclo generacional.
Práctico:
Observación las glándulas salivales
Realizar tinción de cromosomas politénicos
Observar estadios pupales
Disección de línea germinal.
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UNIDAD 4: DESARROLLO TARDIO DEL PEZ CEBRA Danio rerio
Objetivo Específico 1:
Reconocer los estadíos de la embriogénesis tardía, desde la gástrula
hasta la etapa de somitogénesis y organogénesis
Contenidos:
Teórico:
Descripción de los estadíos de desarrollo del embrión de pez cebra
Principales órganos presentes en los embriones tardíos y larvas
Práctico:
Observación de embriones de pez cebra. Desde gástrula a larva
eclosionada. Estructuras y órganos.
Objetivo Específico 2:
-
El pez cebra como modelo para visualizar la expresión génica in vivo
Contenidos:
Teórico:
Regulación génica, jerarquías de regulación, patrones de expresión y
diferenciación en el tiempo y espacio.
Mecanismos celulares y moleculares del desarrollo tardío
La transgénesis y el uso de las proteínas fluorescentes
Práctico:
Observación de embriones tardíos y larvas que expresan GFP en
distintos tejidos u órganos
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UNIDAD 5: EFECTOS DEL AMBIENTE SOBRE EL DESARROLLO ANIMAL
Objetivo Específico 1:
Los efectos de compuestos presentes en el ambiente externo al organismo
como perturbadores del desarrollo embrionario.
Contenidos:
Teórico:
Características de los compuestos químicos
Distinguir la diferencia entre teratógenos y mutágenos
Efectos somáticos vs en la línea germinal
Dominancia y recesividad
Etapas y procesos del desarrollo sensibles a agentes externos
Efectos de la nutrición sobre el desarrollo animal
Uso de modelos animales como biosensores
Práctico:
Ensayar efectos deletéreos de compuestos químicos
Ensayar efectos de la nutrición sobre el desarrollo
Utilizar transgénicos como biosensores ambientales
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Calendario del Taller
Hora
Lunes
9:00 Unidad 1.
Gametogénesis,
meiosis (SB)
10:00
Martes
Miércoles
Viernes
TP Unidad 2.
Fecundación y
desarrollo temprano
en el pez cebra (JF)
TP Unidad 3.
Desarrollo de
Drosophila (AG)
Unidad 5. Efectos del TP Unidad 5.
ambiente sobre el
Observación de
desarrollo (AG, MA)
efectos ambientales
y de otros
experimentos (AG,
MA)
TP Unidad 4.
Desarrollo tardío del
pez cebra (MA)
Almuerzo
Almuerzo
Almuerzo
Almuerzo
Unidad 3. Desarrollo
de Drosophila (AG)
Unidad 4. Desarrollo
tardío en pez cebra
(MA)
TP Unidad 5. Efectos
ambientales en el
desarrollo de pez
cebra y Drosophila
(AG, MA)
Discusión final,
encuesta y
evaluación
11:00 Unidad 1.
Ovogénesis y
fecundación (JF)
12:00
13:00 Almuerzo
Jueves
14:00
15:00 Unidad 1 y 2.
Segregación
ovoplásmica, clivaje,
16:00 blastulación (JF)
17:00 TP Unidad 1.
Disección de ovario
TP Unidad 4.
Gastrulación en pez
cebra. (MA)
18:00
Convivencia
19:00
Clase teórica
(Auditorio Niemeyer)
Trabajo práctico (TP)
(laboratorios de
docencia)
SB: Soledad Berrios
AG: Alvaro Glavic
JF: Juan Fernández
MA: Miguel Allende
1
TRABAJOPRACTICOUNIDADES1Y2
DESARROLLOTEMPRANODELPEZCEBRA
ElPezcebracomomodeloparaelestudiodeldesarrollo.Elembrióndelpezcebra
combinaunacantidadimportantederasgosbiológicosquelohanconvertidoenun
modelomuyadecuadoparaelestudiodelosmecanismosqueregulaneldesarrolloa
través de enfoques estructurales, fisiológicos, genéticos y moleculares. George
Streisinger, de la Universidad de Oregon, fue el primer investigador en utilizar el
embrión del pez cebra como modelo para el estudio del desarrollo utilizando un
enfoquegenético.Suprimertrabajosobrelamateria(1981)fuepioneroenlograrel
establecimiento de líneas homozigotas y la descripción del primer mutante. El
embrión del pez cebra es transparente y su desarrollo embrionario muy rápido. Es
fácildemanteneryreproducirylosadultospuedenserexitosamentemutagenizados
conN-etil-N-nitrosourea.Lafecundaciónesexternaycadaposturaincluyeembriones
cuyo desarrollo es razonablemente sincrónico. Cada hembra puede poner alrededor
de 100 huevos relativamente grandes (0,7 µm). Estos y los embriones pueden ser
objeto de variadas manipulaciones experimentales tales como microinyección y
transplantes. A las 24 horas post fecundación (pf) ya es posible distinguir los
principalesrasgoscorporalescaracterísticosdelosvertebradoscomoeltuboneural,
losojosysomitos.Lalarvaempiezaaalimentarsealrededordelos6-7díaspfyalos3
mesespfelpezhaalcanzadolamadurezsexualycomienzasureproducción.
Mantención de adultos. Los investigadores que utilizan el pez cebra cuentan con
bioteriosdondesepuedenmantenerdecenas,cientosomilesdeestanquesconagua
purificadayaireadaencirculaciónpermanente,Cadaacuariodebeconteneralrededor
de2pecesporlitrodeagua.Paramanteneraguaenlacondicionesseñaladassedebe
contar con series de filtros para remover sedimentos, sales, bacterias, y en especial
hipoclorito, que es muy nocivo para los peces. Además hay que remover del agua
circulante fecas, amoníaco, restos de alimento y microorganismos nocivos mediante
limpiezadiariayexposicióndelaguaaradiaciónultravioleta.ElpHdebemantenerse
alrededor de 7 y la conductividad en aproximadamente 500 µS. Los peces que
mueren por la edad u otras razones deben removerse en forma inmediata. El agua
debemantenerseaunatemperaturadealrededorde28°C(rango24-32°C.Schirone
andGross,1968).Porúltimo,sedebemantenerunritmodiariode14hdeluz/10h
de oscuridad. Los animales son alimentados con una doble dieta: por la mañana
alimentoseco,comolashojuelasdelpopularTetraAmin,yporlatardealimentovivo,
como es el caso de quistes del crustaceo Artemia salina cultivados por 24 h en
solución salina para Artemia. Este último alimento vivo mejora la efectividad de las
posturas.Hayqueevitarquelospecesengordenendemasíaporqueestoperjudicasu
reproducción.Elpezcebraesunamascotaquepuedetambiénmantenerseenforma
artesanalconlossistemassuministradosporelcomercioespecializadodeacuariosy
accesorios.Losmismoscuidadosaplicadosenlosbioteriosdebenimplementarseen
lossistemasartesanales,queusualmentenotienenaguaencirculación.Portanto,es
este caso es recomendable cuidar de la densidad de peces por volumen de agua y
reemplazaréstaalmenossemanalmente.Lospecespuedensobrevivirhasta10días
sin alimentación y cambio de agua. Por supuesto que bajo estas condiciones su
reproducciónesfuertementeafectada.Utilizartanquesde20-50litrosycuandoelpH
estábajosubirloconbicarbonatodesodio.Paralailuminaciónsepuedeutilizaruna
lámpara de bajo wataje y un timer casero y para mantener la temperatura más o
menosconstanteuncalentadorcontermostato.Sielacuarioestáenunlugarquese
usatambiénparaotrospropósitos,estepuedecubrirseconunacajadecartónopaño
negro.Estopermitirámantenerelritmoluz/oscuridad.
Cruce y postura. El día antes de colectar los huevos, los peces machos y hembras
debenmantenerseencontenedoresseparados.Losmachossereconocenporsermás
delgadosyamarillentos,mientraslashembrasgrávidastienenelvientreabultadoy
sonplateadas.Luegodequesehayaencendidolaluzlamañanasiguiente,colocardos
hembras y un macho en una cámara de apareamiento diseñada para evitar que los
progenitoressecomanloshuevos.Simultáneamentesepuedenprepararotroscruces
para obtener más huevos. La cámara de apareamiento (cámara nupcial) se puede
prepararcolocandounacapadebolitasdevidrioenelfondodeunacajadeplástico
transparente que contiene los peces o sobreponiendo dos cajas de plástico
transparente de distinto tamaño, la más pequeña de las cuales contiene los peces y
tiene como base una malla metálica con orificios de aproximadamente 2mm. En el
primer caso los huevos fecundados se extraen de entre las bolitas con un sifón,
mientras que en el segundo caso los huevos atravesarán la malla metálica y se
recogeránseparandolosdoscompartimientosdelacajadeapareamiento.Loshuevos,
colectados con un colador de te, se lavan con una pizeta que contiene agua
acondicionadafiltradadelsistema(aguadelosacuarios)ysetransfierenaplacasde
Petri de vidrio o plástico conteniendo agua acondicionada filtrada con miliporo o
medio E3. Se puede realizar fecundación in vitro colectando espermatozoides y
ovocitosdeejemplaresanestesiados.Paraestosemasajeasuavementeconundedoel
vientre de machos o hembras en la dirección anterior-posterior, con el pez “boca
abajo”. Colectar separadamente los gametos y después reunirlos en agua
acondicionada o medio E3. La fecundación in vitro asegura el desarrollo más
sincrónicodelosembriones.
Anestesia.Paraobtenergametos,extraerlasgonadasoejecutaroperacionescomola
amputacióndelaaletacaudal(queregenera),losadultossonanestesiadosporunos
minutos en Tricaína (etil 3 -aminobenzoato metanosulfonato), hasta que cesen sus
movimientos.
Preparación y observación del material embrionario. Se requiere de un
microscopiodedisecciónolupaquepermitaaumentosdehastaalmenos40X,con
unaplatinaquecombineelcolorblancodeunadesussuperficiesconelnegrodela
otra. Las observaciones pueden ser in vivo o postfijación. Para esto último los
embriones se fijan en Formaldehído/ácido acético por un tiempo corto. El material
fijado puede lavarse con agua destilada o PBS 1X , descorionarse y teñirse con un
colorantebásico.Losembrionessedescorionanconpinzasderelojerooenpronasa
(0.5 mg/ml de agua acondicionada). Para orientar la posición de los embriones
descorionadosestossepuedenmontarenunmedioviscosocomolametilcelulosa.
.
Ovogénesis.Eselprocesomedianteelcualsegenerancélulascompetentesparaser
fecundadas.EnelpezcebracorrespondenaovocitosVquecompletanlameiosiscomo
resultadodelapenetracióndelespermatozoide.Enesemomentosegeneraelzigoto.
Durante la ovogénesis ocurren tres procesos fundamentales: (1) reducción
cromosómica,(2)recombinacióngenéticaentrecromosomashomólogosy(3)intensa
transcripción. A estos procesos se agrega el ensamblaje de glóbulos de vitelo y
gránulos corticales, la proliferación de organelos y la elaboración del corion y la
micropila,estructuraalolargodelacualpenetranlosespermatozoides.Laactividad
transcriptiva es de la mayor importancia para el desarrollo porque los transcriptos
maternos acumulados en el ovocito regulan no solo el desarrollo del propio ovocito
sino también la activación del huevo y la embriogénesis temprana (Pelegri, 2003;
Lindeman and Pelegri, 2010; Dosch, 2014). La hembra tiene un par de ovarios
suspendidosdelacavidaddelcuerpoporunvascularizadomesovarioysecomunican
alexteriorporcortosgonoductos.Elovariodeanimalesmadurosocupaunvolumen
importante de la cavidad pleuroperitoneal, 10-20% del peso de la hembra cuando
estágrávida.Selmanetal.(1993)reconocen5estadioseneldesarrollodelovocito.
(a) Ovocitos del estado I (estado de crecimiento primario) son transparentes,
tienenunvoluminosonúcleocentral(vesículagerminal)ymidende7-140micrones
de diámetro. Los ovocitos más pequeños o prefoliculares (estado IA) están en el
leptotenedelaprimeradivisiónmeióticamientraslosmásvoluminosos,ofoliculares
(estado 1B), han entrado al diplotene de la primera división meiótica y están
claramente rodeados por una capa epitelial plana de células foliculares. Algunos o
numerososnucleólosestánpresentesenlosovocitos,muchoscercanosalaenvoltura
nuclear.
(b)OvocitosdelestadoII(estadoalveolarcortical)sontransparentesymiden
de140-340micronesdediámetro.Sunúcleoescentralyestádetenidoenlaprofase
de la meiosis I. El citoplasma de aspecto espumoso se debe al comienzo de las
formacióndelosgránuloscorticales.
(c) Ovocitos del estado III (estado de vitelogénesis) empiezan a opacarse
como resultado del depósito de glóbulos de vitelo que desplazan los nacientes
gránuloscorticaleshacialaperiferiacelular.Midende340-690micronesysunúcleo
empiezaamoversehacialaperiferiamanteniéndoseenlaprimeradivisiónmeiótica.
(d) Ovocitos del estado IV (estado de maduración) son muy opacos como
resultado de la acumulación de gran cantidad de vitelo. La ruptura de la vesícula
germinal marca la conclusión de la primera división meiótica y el inicio de las
segunda,ElovocitosedetieneenlametafaseII.
(e)OvocitosdelestadoV(estadodehuevo)sontransparentesymiden0,730,75 micrones de diámetro y la meiosis continua detenida en la metafase II. Son
aplanadosyflotanenlacavidaddelovario.ElovocitoVyahainiciadoelprocesode
segregación ovoplásmica mediante el cual lagunas de citoplasma ricas en organelos,
citoesqueleto y determinantes maternos que han empezado a acumularse en el
casquete animal del ovocito para formar el naciente blastodisco o preblastodisco
(Fernándezetal.,2006).Estedaráfinalmenteorigenalembrión.
Características generales del desarrollo. En verdad el desarrollo se inicia en el
ovarioycontinúaenunaseriedeprocesosquesehanordenadoenestados.LatablaI,
elaborada por Kimmel et al. (1995), resume las características de tales estados
basadoenrasgosmorfológicosdeembrionesvivosobtenidosdelamismamadreque
se han fecundado in vitro, situación que mejora la sincronía de su desarrollo
(consultar también el “Zebrafish Book” en la dirección http:/zfish.uoregon.edu o el
libro Zebrafish editado por Nüsslein Volhard and Dahm, 2002). La descripción del
desarrollobasadaenestadosesmássignificativaquelabasadaenedad.Lavelocidad
dedesarrolloaumentaodisminuyesegúnlatemperatura.Sinembargo,eldesarrollo
normal ocurre dentro de un rango de temperatura ya indicado. Con frecuencia se
habladedesarrollotempranoytardío.Elprimeroseextiendehastaelcomienzodela
gastrulaciónmientraselsegundohastaquesehayacompletadolaorganogénesisyla
especificacióndelosejescorporales.Enelpezcebrayotrosorganismosseagregaun
largo período larvario que culmina con la formación de un juvenil cuya maduración
sexualsealcanzaalos3mesespf.Unacompletadescripcióndelaanatomíadelalarva
endesarrolloseencuentraenSalgadoyal.(2012).
Fecundación y activación. La fecundación puede ocurrir en forma natural o
ejecutarseinvitro.Comienzacuandounespermatozoidepenetraporlamicropilaysu
membrana se fusiona con la del ovocito, fenómeno que ocurre 20-60 segundos
después que los gametos son descargados o combinados. En contacto con el agua
ambosgametossonactivados.Poreso,alobtenerlosgametospormasajeabdominal
hay que prevenir que tomen contacto con el agua. Esto se logra removiendo los
espermatozoidesconunamicropipeta.Losovocitosquefueronactivadosporelagua
nopodránfecundarsedespuésporquehanformadolaenvolturavitelina,ocorion,que
previene la penetración de espermatozoides. Los espermatozoides permanecen
activos por aproximadamente 1 minuto. La activación del ovocito tiene varias
manifestaciones como cambios en el potencial de membrana, explosivo aumento de
calciolibredentrodelhuevo,terminacióndelameiosisconexpulsióndelpolocitoII,
exocitosis de los gránulos corticales y levantamiento de la envoltura vitelina que
formala“membranadefecundación”ocorión.CambiosenelpHdelzigoto,aumento
delconsumodeoxígeno,síntesisdeproteínasyDNAymovimientoscitoplasmáticos,
también toman lugar (ver Gilbert, 2013). Muchos de estos fenómenos también
ocurrenenelovocitonofecundadoactivadoencontactoconelagua.
Desarrollo del zigoto y movimientos citoplasmáticos (segregación
ovoplásmica).Unavezqueelhuevocompletalameiosis,aproximadamentealos10
min pf, pasa a llamarse zigoto y consiste de un citoplasma rico en vitelo, o
viteloplasma, y un citoplasma rico en organelos, citoesqueleto y RNAm de origen
materno, llamado ovoplasma. El ovoplasma se distribuye en tres dominios
citoplasmáticos:blastodisco,endoplasmayectoplasma.Elendoplasmaformaunared
de numerosas lagunas de bordes irregulares que se conectan con el blastodisco
mediante cortos canales (“short axial streamers”), mientras el ectoplasma rodea el
zigoto y también se conecta con el blastodisco. A medida que transcurre la primera
interfase el ovoplasma fluye lentamente desde las lagunas de endoplasma y del
ectoplasmahaciaelpoloanimal,conlocualelblastodiscocrecediscretamenteenla
regiónanimaldelzigoto.Mientrastanto,lospronúcleosseacercanyformanelnucleo
delzigoto.Esteinicialamitosisaproximadamentealos30minpf,cuandoseproduce
la contracción de un anillo de actina ensamblado en el reborde del blastodisco. Este
fenómenoseacompañadeunflujorápidodeovoplasmahaciaelpoloanimal,proceso
que se manifiesta por la formación de numerosos y voluminosos canales llamados
“streamers”,queporsutrayectoriayrelacionesconelblastodiscopuedenseraxiales
o meridionales. El blastodisco crece rápidamente y cuando el anillo de contracción
empieza a relajarse se inicia la formación del primer surco de citoquinesis que da
origenalosdosprimerosblastómeros.Porlotanto,partedelaprimeramitosisocurre
durante la etapa de flujo rápido de ovoplasma. La formación de canales axiales y
meridionales menos robustos se repite en las siguientes divisiones de clivaje, junto
con la formación de anillos de contracción más débiles. Ambos procesos son
generalmente indetectables a partir de los 8-16 blastómeros . A estas alturas la
mayoríadelaslagunasdeendoplasmahandesaparecidoyensulugarlosglóbulosde
viteloseacercanentresiyformanlaboladevitelo,queenlalarvaconstituiráelsaco
vitelino.Lasegregacióndecitoplasmasepuedeseguirenembrionesvivosobservados
en la lupa o el microscopio, instrumentos que generalmente están conectados con
unacámaradevideoyuncomputadorpremunidodeunprogramacapazdeinvertirel
contraste entre ovoplasma y viteloplasma. Esto también se logra observando
embriones,colectadosadistintotiempo,quehansidosometidosaunafijaciónácida
(Fernándezetal,2006;FuentesandFernández,2010).
Divisiones de clivaje. Las 5 primeras divisiones de clivaje son meridionales, tienen
una orientación regular y ocurren desde el centro al borde del blastodisco. Cada
divisiónesortogonalalaprecedentedemaneraqueelblastodiscoessucesivamente
parceladoenhilerasdecélulas.Primerounahileradedoscélulas,segundodoshileras
dedoscélulas,tercero2hilerasde4células,cuarto4hilerasde4célulasyquinto4
hilerasde8célulasAlfinaldelestadode16célulashay4centralesy12marginales,
que permanecen conectadas con la bola de vitelo. La sexta división de clivaje es
ecuatorialygeneraunacapasuperficialyotraprofunda.Deaquíhastalatransiciónde
lablástulaintermedialamayoríadelascélulasnomarginalesclivancompletamente,
persistiendodivisionesincompletasenlascélulasmarginales.A28,5ºClasdivisiones
declivajeocurrencada15-20mindeacuerdoalasiguientesecuenciatemporal:
2células:45-50minpf
4células:1:00-1:05hpf
8células:1:15-1:20hpf
16células:1:30-1:35hpf
32células:1:45-1:50hpf
64células:2:00-2.05hpf
Blastulación (2:15-5:15h) y transición de la blástula intermedia. Las siguientes
divisionescelularessonrelativamentesincrónicas(metasincrónicas)eirregularesen
elplanoenqueseensamblanloshusosdeclivajeyportantoenladirecciónenque
ocurre la citoquinesis. A las 2:30-2:35 h pf se alcanza el ciclo celular 8 con 256
células,alas2:45-2:50helciclocelular9con512célulasy15a20minmástardeel
ciclo celular 10 con mil células (“1 kg de çélulas”) . El ciclo celular 9 corresponde al
momento en que ocurre la transición de la blástula intermedia (Kimmel and Law,
1985b).Esteesunestadodegrandescambioseneldesarrolloembrionarioporquela
divisiones celulares se hacen asincrónicas (con las células animales dividiéndose
antesdelasmarginales),loscicloscelularessealarganycomienzalatranscripcióndel
genoma zigótico. Es decir el control materno del desarrollo es reemplazado por el
control zigótico. Esto no debe entenderse como un cambio brusco de la acción de
productosgénicosmaternosazigóticos.Porelcontrarioyporuntiempo,laacciónde
los dos productos génicos se sobreponen. La progresiva acumulación de células
despuésdelciclocelular11transformaelblastodermoenuncúmulodecélulasde
distinta forma, situación que permite reconocer distintos tipos de blástulas: alta,
oblonga, esfera y cúpula. Son estereoblástulas porque carecen de una cavidad. Las
célulasmarginalessufrenuncolapso,liberanelcitoplasmaylosnúcleossereúnenen
elcitoplasmaquerodeaelviteloparaformarlacapasincicialdelvitelo.Aestasalturas
no hay puentes citoplasmáticos entre los blastómeros. La blastulación termina y la
gastrulación se inicia cuando el desplazamiento o epibolía, en la dirección animal
vegetal del blastodermo alcanza el ecuador del embrión (50% de epibolía). La
cronologíadelablastulaciónaunatemperaturade28,5°Ceslasiguiente:
128células2:15-2:20hpf
256células2:30-2:35hpf
512células2:45-2:50hpf
1000células3:00-3:05hpf
Blástulaalta3:15-3:20hpf
Blástulaoblonga:3:40-3:45hpf
Blástulaesfera4:00-4:05hpf
Blástulacúpula4:15-4:20hpf
50%deEpibolía5:15-5:20hpf.
PROTOCOLO1
DESARROLLOTEMPRANODELPEZCEBRA
Para la ejecución de este y otros protocolos del pez cebra se le suministrará
tablas del desarrollo, diagramas y fotografías que facilitarán las observaciones
programadas.
OVOGENESIS
1.-Elijahembrasgrávidas,anestésielasycolóquelassobreunportaobjetos.
Haga una escisión ventral y remueva los ovarios que aparecen repletos de ovocitos.
TransfieralosovariosaunacápsuladePetriconsoluciónsalinaoaguaacondicionada.
Esta última no es una solución fisiológica adecuada pero mantiene razonablemente
bienlaestructuradelosovocitosparasuobservacióninmediatayfijación.
2.-Observandoabajoaumentodescubriráquecadaovarioestaformadode
acúmulosoquistesdeovocitoscadaunodeloscualesesposiblementeelclondeuna
célula madre. Cada quiste tiene ovocitos de distinto tamaño que están en diferentes
estadosdelaovogénesis.Amayoraumentopodrádistinguirovocitosdelosestados
1-4deldesarrollo.
3.-Fijeuntrozodeovarioconformaldehído/ácidoacéticoporalmenos30
min,laveporelmismotiempoenvarioscambiosdePBS1Xoaguadestiladaytiñapor
unos minutos con azul de toluidina (colorante básico) en borato de sodio. Lave de
nuevoconPBSpararemoverelexcesodecolorante.MonteeltrozodeovarioconPBS
entre un porta y cubre objetos, este último con topes de plasticina en sus cuatro
ángulos.Visualizelosiguiente:
(a)OvocitoI.Sucitoplasmaapareceintensamenteteñidodecolorazul
(basofiliadebidaalaacumulaciónderibonucleoproteínas).Elnúcleocentraldeestos
ovocitospresentaunoomásacúmulosdematerialbasófiloenlaperiferiadelnúcleo
quecorrespondenanúcleolos.
(b) Ovocito II. La basofilia del citoplasma es reemplazada por la
aparicióndeuncitoplasmadeaspectoesponjosodebidoalaacumulacióndealveólos
precursores de los gránulos corticales. La silueta del núcleo de posición central es
todavíadetectable
(c) Ovocito III y IV. El citoplasma empieza a oscurecerse debido al
depósitogradualdeglóbulosdevitelo.Ladiferenciaentreunoyotroovocitosepuede
determinarporeltamañodelacélula.
(d)OvocitoV.Sepuedeobtenerdelliquidoqueseacumulaenelcentro
delovariodeunahembragrávidaprontodespuésquelaluzsehaencendido.Esuna
célulaaplanadayfrágilquesehinchaenpresenciadeaguayseactiva.Sepuedefijar
en formaldehído/ácido acético y así visualizar la distribución temprana del
ovoplasma.
FECUNDACION
Tan pronto detecte que el apareamiento de machos y hembras fue exitoso,
remueva y lave los huevos para luego transferirlos a una cápsula de Petri con agua
acondicionada. Observe la formación del corion y de la cámara perivitelina. Con
suerte podrá visualizar la micropila, que une la superficie del huevo con el corión, y
una pequeña célula adherida al zigoto o flotando en el líquido perivitelino y que
correspondealpolocito2.Tantohuevosfecundadoscomonofecundados,encontacto
con el agua, forman el corion y habrá que esperar la división de su blastodisco para
determinar si fue o no fecundado La estructura de los gametos no activados podrá
estudiarse en montajes de ovocitos V extraídos directamente del abdomen de una
hembra grávida y de espermatozoides extraídos directamente del abdomen de
machos. La observación deberá hacerse a aumentos altos de la lupa o mejor en un
microscopio.
SEGREGACIONOVOPLASMICAYPRIMERCICLOCELULAR
Desdeelmomentodelafecundaciónhastalaterminacióndelprimerciclocelular
Ud. podrá combinar la observacion de zigotos vivos con aquellos fijados cada 5-10
minmedianteformaldehido/ácidoacético.Laposicióndelzigotovivopuedeajustarse
montándolos en metil celulosa y orientando su posición con un mondadientes. La
observacionesdebendirigirsealavisualizacióndelossiguientesprocesos:
(1) Etapa de crecimiento gradual del blastodisco en la región animal del
zigoto durante la primera interfase. Asegúrese que la temperatura se mantiene
alrededordelos28,5°C.
(2)Gradualdesaparecimientodelaslagunasdeendoplasma
(3)Contraccióndelanillodeactinaenelrebordedelblastodisco
(4)Formacióndecanaleso“streamers”axialesymeridionales.Estosúltimos
sevisualizanmejorenhuevosfijadosymontadosenformaoblicua.
(5)Relajacióndelanillodeactina,desaparicióndeloscanales,yaparicióndel
primersurcodedivisióndelblastodisco.Conestosecompletaelprimerciclocelulara
los30-40minpf.
CLIVAJE
Este proceso será estudiado tanto en huevos vivos como fijados, estos últimos
procesadoshaciaelfinaldecadaciclocelular.Conunmondadientespodráorientarla
posicióndelosembrionesquemejormuestreelprogresodelprocesodeclivaje.
(1) Visualize la dirección en la cual avanza el surco de clivaje de cada
divisióndelblastodisco.
(2)Corroborelaregularidaddelasdivisionescelulares1-5ylosplanosen
queocurreestefenómeno.
(3) Verifique como la mayor parte del endoplasma ha sido trasladado al
blastodisco
(4)Identifiqueembrionesde64-1.000células,quenopodrácontar,perosi
comparar con la imágenes de la tabla de desarrollo que se le suministrará. En los
embrionesmásavanzadospodráidentificarlascélulassincisialesdelviteloporfuera
delrebordedelblastodermo
BLASTULACION
Esteprocesoenverdadseiniciamástempranoeneldesarrolloperoesapartirde
1kg de células cuando aparecen cambios sistemáticos en la forma del blastodermo
quedanorigenalosdistintostiposdeblástula.Reconozca:
(1) La blástula alta que presenta un promontorio de blastómeros que se
agudizahaciaelpoloanimaldelembrión.
(2) La blástula oblonga que presenta un aplanamiento del blastodermo
sobre la bola de vitelo. La capa sincisial del vitelo aparece formada por varias capas
concéntricas.denúcleoscelulares.
(3)Lablástulaesferatiene,comodicesunombre,formaesféricayellímite
entre el blastodermo y la bola de vitelo es una horizontal. Los núcleos de la capa
envolventedelvitelosufrenlasúltimasdivisiones.
(4)Lablástulacúpulasufreundesplazamientodelaboladevitelohaciael
polo animal mientras el blastodermo se aplana como resultado del inicio de su
desplazamiento,oepibolía,haciaelpolovegetal.Losnúcleosdelacapaenvolventedel
vitelopuedenserfácilmentevisualizados.
Laepibolíadelblastodermoalolargodelabolavitelosehaceaexpensasdeun
progresivo adelgazamiento del blastodermo que cuando alcanza el ecuador del
embrión(50%deepibolía)dainicioalprocesodegastrulación.
MUTANTESQUEAFECTANELDESARROLLOEMBRIONARIOTEMPRANO
La observación de mutantes de efecto materno brinda la oportunidad de visualizar
fenotipos en los que se han alterado procesos tempranos del desarrollo como la
gametogénesis, fecundación y activación, segregación ovoplásmica, clivaje y
blastulación. Muchos de los mutantes mueren en las primeras horas de desarrollo
mientrasotrosformangástrulasylarvasanormalesquenocompletaneldesarrollo.El
mutante emulsion/cax1 tiene alterada la estructura de una proteína que funciona
como un intercambiador de Ca+2/H+. (Fuentes et al., 2014 ). Las alteraciones más
conspicuas de este mutante tienen que ver con el retardo de los movimientos
citoplasmáticos, alteraciones en la sincronía y patrón de las divisiones celulares de
clivaje,disminucióndelaadhesividadcelularyventralizacióndelalarva(Doschetal.,
2004;Wagneretal.,2004).
MATERIALESREQUERIDOS
Medio E3: 15 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 1mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 0,15 mM KH2PO4,
0,050mMNa2HPO4,0,70mMNaHCO3(sepuedeomitir)pH7-7.5.
Tricaína:Disolver40mgdetricaínaen9,79mldeaguadestiladay0,21mldeTris1M
pH7.AlicuotarentubosEppendorfde630µlycongelara-20°C.Descongelarenel
momentodeanestesiarytransferiraunaplacadePetridondesecolocaelpez.
Pronasa:0,5mgdePronasaenaguaacondicionada.Incubarporunosminutosa28°C
PipetasPasteurdevidriooplástico
CápsulasdePetrideplásticoovidriode50x12o90x15mmdediámetroyaltura.
Pizetasde100o250ml.
PBS1X:8gdeNaCl,0,2gdeKCL,1,44gdeNa2HPO4,0,24gdeKH2PO4enunlitrode
aguadestiladapH7.4.Mantenerenelrefrigeradora4°Cyentibiarantesdeusar.
Metilcelulosa:2-3%enaguaacondicionadafiltradaomedioE3.Alicuotarymantener
enelrefrigerador(siesposiblea-20°C).Entibiarantesdeusar.Sepuedeutilizarpara
orientarlaposicióndeembrionesvivosofijados.
Portaycubreobjetos
Plasticina.
Filtrosdemiliporode0,2micrómetros.
Aguaartificialdeacuario:60mgdelamezcladesales“InstantOcean”enunlitrode
aguadesmineralizada.
SoluciónsalinaparaArtemia:300gdeNaClen1ltdeaguadestilada.Mantenerquistes
deArtemiaconaireaciónconstanteenembudodedecantación.
SoluciónsalinaRinger:116mMNaCl,2,9mMKCl,1,8mMCaCl2,5mMHepespH7,2.
SoluciónsalinaHank:137mMNaCl,5,4mMCaCl2,1,3mMCaCl2,1mMMgSO4,0,44
mMKH2PO4,0,25mMNa2HPO4,4,2mMNaHCO3.
METODOS
Fijación ácida: Preparar formaldehído al 5% fresco a partir de la solución stock al
37%, que debe considerarse como si fuese al 100%. Pipetear en la solución fijadora
10-15 embriones y acto seguido agregar 5 gotas de acético acético glacial. Tapar la
cápsulayagitarrotatoriamentehastaquelosembrionessetornanblanquizcos.Fijar
por30-120min..Elformaldehídoyácidoacéticosonmuytóxicosyportantocuando
se utilizan para la fijación de material biológico debe contarse con una buena
ventilación.
Tinción con azul de Toluidina. Preparar una solución al 0,001% de Azul de
ToluidinaenPBS1X.Partirpreparandounasoluciónstockdeazuldetoluidinaal1%
enboratodesodioal1%.Tomar15µldelasoluciónstockydiluiren10mldePBS1X.
Teñirlosovariosoembrionesenunagotadepositadasobreunportaobjetos.Después
deunosminutosdetinciónremoverelexcesodelcolorantemediantelavadosconPBS
1X. Montar un trozo pequeño del ovario o algunos embriones entre porta y cubre
objetoscontopesdeplasticina.
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Kimmelatal.,1995
Kimmeletal.,1995
Kimmeletal.,1995
Formaciónde“streamers”enembrionessometidosafijaciónácida
FuentesandFernández,2010
A:2Blastómeros
B.4Blastómeros
C:8Blastóteros
D.16Blastómeros
E:32Blastómeros
F:64Blastómeros
Kimmeletal.,1995
A.
B.
C.
D.
E.
F.
256Blastómeros
Blástulaalta
Blástulaalta/oblonga
Blástulaoblonga/esfera
Blástulacúpula
E.30%deepibolía
Kimmeletal.,1995
TRABAJO PRACTICO UNIDAD 3
APOYO TEÓRICO PARA UNIDAD 3:
DESARROLLO DEL INSECTO DROSOPHILA MELANOGASTER
Objetivo Específico 1: Conocer el ciclo de vida y característica principales
SECCIÓN TEÓRICA
INTRODUCCIÓN
La especie Drosophila melanogaster ha sido utilizada ampliamente para experimentación
en genética puesto que presenta una serie de ventajas para su manipulación y estudio, entre
las cuales se encuentra el ciclo de vida corto, la generación de un alto número de
descendientes, fácil mantención de un alto número de individuos en un laboratorio por un
bajo costo y un número de cromosomas relativamente reducido (4 pares), a lo que se suma
la existencia de un gran número de herramientas para su manipulación genética.
Fue introducido como animal de experimentación genética por Thomas Morgan a
principios del siglo XX gracias a las ventajas mencionadas, junto con características
heredables que podían ser reconocidas a simple vista. Su genoma fue completamente
secuenciado y publicado en marzo del año 2000, y hoy en día es utilizado como modelo de
estudio en un sinnúmero de laboratorios alrededor del mundo para la comprensión de
diversos procesos biológicos, como lo es el desarrollo, conducta, patologías, entre otros.
Cabe destacar que una vasta gama de dichos procesos son homologables a otras especies,
incluyendo los mamíferos. Aún más, aproximadamente el 60% de los genes asociados a
enfermedades en humanos que se han descrito a la fecha presentan un homólogo
identificable en el genoma de D. melanogaster.
Drosophila melanogaster: características principales
El insecto Drosophila melanogaster, es una especie de díptero braquícero perteneciente a la
familia Drosophilidae. Este animal se conoce también como “mosca del vinagre” o “mosca
de la fruta”, dado que se alimenta de frutas en proceso de fermentación tales como
manzanas y uvas, entre otras. D. melanogaster es una especie de insecto holometábolo, es
decir que lleva cabo un proceso de metamorfosis completa desde el estadío larvario hasta el
adulto con una fase intermedia pupal. Las distintas fases del ciclo de vida de estos animales
se muestran en la Figura 1, que incluyen huevo o embrión, larva I, II y III, pupa y adultos,
que presentan dimorfismo sexual.
El ciclo de vida de estos animales demora alrededor de 10 días a 25°C, pudiendo ser
modulado en función de la temperatura, siendo más lento a menores temperaturas y más
rápido a mayores temperaturas, por ejemplo, el ciclo demora aproximadamente 19 días a
18°C y 7 a 29°C. A su vez, existen determinadas condiciones genéticas que podrían variar
la temporalidad de desarrollo de estos animales.
Figura 1: Ciclo de vida de Drosophila melanogaster.
Ciclo de vida
El desarrollo de estos animales comienza luego del proceso de fecundación del huevo, en
que se activan una serie de eventos moleculares que promueven el correcto desarrollo
embrionario de los animales hasta su eclosión. Esto da comienzo a la segunda etapa larvaria
donde los animales se alimentan de los nutrientes disponibles y ocurre un aumento de masa.
La etapa larvaria es la única etapa en que los animales aumentan de tamaño, por lo que la
disponibilidad de nutrientes es determinante del tamaño corporal adulto. Una vez los
animales cesan de comer, estos se “escapan” de la comida, lo que promueve la liberación
de una hormona llamada ecdisoma, que provoca que las larvas comiencen el proceso de
pupación. Durante el estadío de pupa, el animal sufre un importante proceso de
metamorfosis hasta adquirir la morfología característica del animal adulto, presentando
dimorfismo sexual, es decir que es posible distinguir fácilmente la morfología de una
hembra y la de un macho.
- Fecundación y desarrollo embrionario
La fecundación del huevo es interna, y el semen queda guardado en un receptáculo seminal
de la hembra y la espermateca asociada, posterior a lo cual se activa el proceso de
desarrollo embrionario.
El huevo de Drosophila es blanco, mide alrededor de 0,5 mm de longitud y tiene una forma
ovalada, siendo más plana la cara dorsal y redondeada la cara ventral (Figura 2, panel
superior). El huevo está revestido por una envoltura delgada llamada vitelo, que a su vez
está envuelta en una membrana constituida por células hexagonales llamada corion.
Asimismo, presenta un par de filamentos que se extienden a partir del corion en la región
anterior de la cara dorsal de los embriones (Figura 2, panel inferior), que corresponden a
filamentos respiratorios que como su nombre indica, permiten el intercambio gaseoso.
Los embriones eclosionan luego de 22-24 horas a 25°C, luego de lo cual comienza el
periodo larvario.
Figura 2: Vista lateral (panel superior) y dorsal (panel inferior) de un embrión de Drosophila
melanogaster. Se observa la geometría hexagonal de las células del corion que lo recubre y los
filamentos respiratorios en la región anterior.
- Desarrollo larvario
La larva de Drosophila tiene un cuerpo suave y flexible, que está cubierto por una cutícula
no celular e internamente por una epidermis celular. La cutícula muestra en la región
anterior de cada segmento numerosos anillos con garfios quitinosos. En la región ventral
del segmento de la cabeza se puede distinguir la compleja armadura mandibular. La larva
es bastante transparente y es posible observar, bajo luz transmitida, los cuerpos grasos e
intestino (aparato digestivo), tráqueas y espiráculos (aparato respiratorio), tubos de
Malpighi (aparato excretor) y gónadas (aparato reproductor). La observación de los
testículos en el tercio posterior de la larva es utilizado para la selección de larvas por su
sexo. Además de estas estructuras puramente larvarias, la larva contiene grupos celulares
que originarán las estructuras del adulto, llamadas discos imaginales (imaginal, porque son
importantes para la formación del imago).
El estadío larvario se caracteriza por un aumento de masa a partir de nutrientes externos y
está constituido por tres etapas, comenzando el primero luego de la eclosión de los
embriones. La pequeña larva I se alimenta de la comida en la que los huevos fueron
depositados, y luego de ± 25 horas, ésta muda su cubierta, desechando completamente su
cutícula, aparato mandibular y espiráculos, convirtiéndose en una larva más grande,
comenzando así el segundo estadío larvario, en que debe reconstruir los elementos
desechados, lo cual permite la generación de estructuras nuevas. La larva II se alimenta
durante ± 24 horas más, luego de lo cual muda y se convierte en una larva aún más grande,
la larva III. Ésta última también se alimenta y crece, pudiendo alcanzar dimensiones de
hasta 4,5 mm de largo, pero a su vez, comienza a “arrancar” de la comida hacia áreas más
limpias y secas para comenzar el proceso de pupación. Esta etapa dura aproximadamente
30 horas luego de lo cual se libera un pulso de ecdisoma, hormona que provoca que la larva
se convierta en pupa. Es posible acortar esta última etapa si se retiran los animales antes de
la comida, siempre y cuando hayan alcanzado lo que se conoce como masa crítica,
concepto sobre el que se detallará en la unidad 5.
- Estadío pupal
La pupa es estacionaria (no se mueve), y es durante esta etapa que ocurre el proceso de
metamorfosis desde larva hasta la anatomía del imago. Durante dicho proceso, ocurre una
lisis masiva de las estructuras larvarias, aunque algunos de los órganos larvarios se
conservan y reestructuran, como por ejemplo, el sistema nervioso que pasa por un proceso
de reestructuración importante durante el proceso de morfogénesis. Sin embargo, la
mayoría de las estructuras presentes en los adultos se forman a partir de tejidos
indiferenciados que se replican durante el desarrollo larvario, que se llaman discos
imaginales y los histoblastos. En las etapas tempranas, las pupas presentan una coloración
entre blanca y amarilla, la cual se va oscureciendo a medida que el animal se desarrolla
(Figura 3).
Figura 3: Durante la etapa P1, la pupa tiene una coloración blancuzca, que se va volviendo amarilla
en la transición P1-P4. De P5-P12, la cutícula se oscurece, por lo que las fotos corresponden a
pupas a las que se les retiró la cutícula para una mejor ilustración. En P5 se comienza a observar la
morfología del animal en desarrollo, mientras que en P8 los ojos en formación comienzan a
desarrollar pigmento. En P12, el animal está completamente desarrollado y a punto de eclosionar.
- Estadío adulto o imago
Una vez culminado el proceso de metamorfosis durante el estadío pupal, el adulto o imago
eclosiona por el extremo anterior de la pupa. La mosca recién nacida es alargada y con alas
retraídas, que luego de unos minutos se expanden y el animal se va redondeando
gradualmente hasta adquirir la forma característica del adulto.
A su vez, las moscas jóvenes tienen un color claro, y se translucen los desechos remanentes
del proceso de pupación, que se observa como una mancha oscura en el abdomen, llamado
meconio, pero al cabo de unas pocas horas, los animales se oscurecen, por lo que es fácil
identificar a simple vista dentro de un cultivo, cuáles son las moscas jóvenes (Figura 4).
Como ya se mencionó, estos animales presentan dimorfismo sexual (Figura 4), y los
machos son sexualmente activos alrededor de 8 horas luego de su eclosión, mientras que las
hembras no poseen huevos maduros hasta 2 días posteriores a su eclosión. Por lo tanto, el
reconocimiento de moscas jóvenes es una herramienta útil para el reconocimiento de
hembras vírgenes (que no se hayan cruzado previamente con machos dentro del cultivo),
que es importante a la hora de realizar cruces experimentales pues se tendrá noción del
genotipo de la descendencia sin lugar a dudas. Una vez se realice un cruce, los machos
fecundarán a las hembras, y el ciclo se retomará nuevamente.
Figura 4: Fotografía de animales adultos revelando dimorfismo sexual de la placa anal. Izq:
machos presentan una placa anal oscurecida y un tamaño corporal menor que el de las hembras
(medio y derecha). Der: hembra virgen, presenta abdomen blancuzco y se trasluce claramente el
meconio.
Embriogénesis, Gastrulación, Establecimiento del plan corporal larvario y
Proceso de segmentación.
La embriogénesis se refiere al conjunto de procesos biológicos que conllevan a la
transformación controlada de una célula única a un individuo maduro.
Posterior al evento de fecundación, en que los gametos masculino y femenino, ambos
haploides, fusionan su material genético, generando un cigoto diploide, comienza el
proceso de embriogénesis.
- Embriogénesis temprana
El cigoto formado contiene toda la información genética del nuevo individuo a
desarrollarse, el cual comienza a sufrir una serie de divisiones sincrónicas rápidas sin la
ocurrencia de citoquinesis (sin división de citoplasma), con lo que se genera un gran
sincicio (gran célula con múltiples núcleos) y luego se establece una monocapa de núcleos
en la periferia que albergan al vitelo central, pero carecen de membranas plasmáticas que
definan a las células individualmente; esta estructura se denomina blastodermo sincicial
(típica del desarrollo de insectos).
Cabe destacar que el ciclo celular 10 (Figura 5, estadío 4) marca el inicio de la
transcripción cigótica, mientras que el ciclo celular 14 (Figura 5, estadío 5) marca el inicio
del estadío de blastodermo celular (3 horas post fecundación), y a partir de este momento,
las divisiones celulares dejan de ser sincrónicas.
Figura 5: Esquema de un embrión de Drosophila durante distintas etapas de desarrollo embrionario
temprano. Estadío 1, una célula; estadío 2, sincicio; estadío 3, núcleos se desplazan hacia la
periferia; estadío 4, blastodermo sincicial; estadío 5, blastodermo celular.
Durante el desarrollo embrionario temprano, ocurre un proceso de diferenciación de
diversos tipos celulares en un orden espacial determinado, lo cual ocurre en parte gracias a
la acción combinada de proteínas llamadas morfógenos.
Estas proteínas se sintetizan o liberan de regiones determinadas y difunden hacia el resto
del embrión, generándose gradientes de concentración. Por lo tanto, células que se
encuentren más cerca de la fuente estarán expuestas a mayores concentraciones del
morfógeno, mientras que lo opuesto ocurre para las que se encuentren más lejos. Esto es
sumamente importante, puesto que los niveles de morfógeno a las que se encuentre
sometida la célula blanco, determinarán su destino celular de manera dosis-dependiente, y
una de las formas de describir este fenómeno es mediante el modelo de la bandera francesa,
propuesto por Lewis Wolpert en 1969, cuya idea consiste básicamente en que una célula
indiferenciada adquiere un destino celular u otro si es que la concentración de morfógeno a
la que está expuesta excede un determinado umbral o no (Figura 6).
Esto se explica dado que los morfògenos activan la expresión diferencial de genes por sobre
determinados umbrales de concentración, pudiendo un mismo morfógeno activar la
expresión de varios genes, cada uno con sus propios umbrales de activación. Por
consiguiente, las células lejanas a la fuente del morfógeno solo expresarán genes con un
bajo umbral de activación, mientras que los que se encuentren cerca, expresarán tanto los
que tengan un bajo como alto umbral de activación.
Figura 6: Si una célula tiene una concentración de morfógeno por sobre el umbral 1, tiene un
destino celular “azul”. Por su parte, si el morfógeno tiene una concentración menor al umbral 2, la
célula tiene un destino “rojo”. Por último, si la concentración de morfógeno es intermedia, el
destino celular será “blanco”.
Es evidente que el modelo de la bandera francesa es una simplificación de lo que ocurre
realmente durante el desarrollo del animal, pues durante dicho proceso participa un
conjunto de morfógenos, cada uno con su propia fuente de emisión y gradiente, por lo que
cada una de las células estaría expuesta a una combinación de concentraciones de
morfógeno, existiendo un verdadero código posicional para la identidad de cada una de
ellas dentro del animal en desarrollo.
- Gastrulación
La gastrulación comienza inmediatamente luego del establecimiento del blastodermo
celular, y corresponde al proceso de reorganización de las células del embrión en desarrollo
para formar las 3 capas germinales primarias: ectodermo, mesodermo y endodermo. La
primera señal del proceso de gastrulación es la invaginación de la banda de células al centro
de la cara ventral del embrión, formando el surco ventral. Las células invaginando van a
formar el mesodermo presuntivo, mientras que las células a los bordes de la invaginación
formarán los neuroblastos que formarán parte del sistema nervioso central de los animales.
Durante la formación del mesodermo se genera un surco transversal llamado surco cefálico
que se localiza en el borde anterior al surco ventral (Figura 7). Esta es una zona de ingreso
de células que posteriormente formarán el intestino anterior, llamada la invaginación del
intestino medio anterior. En la región posterior de los animales se genera una invaginación
similar, llamada la invaginación del intestino medio posterior. Eventualmente, estas dos
invaginaciones se encuentran en el medio, para formar el intestino endodermal.
Figura 7: A) Diagramas de vista lateral de embriones durante la gastrulación, indicando regiones precursoras de
ectodermo (celeste), mesodermo (amarillo) y endodermo (rosa). Arriba hacia abajo: A1, blastodermo celular, el
primordio está en la superficie del embrión; A2, el mesodermo presuntivo ha formado el surco ventral; A3, la
parte posterior del endodermo ha invaginado y la banda germinal ha comenzado a extender hacia el lado dorsal
del embrión; A4, mesodermo completamente internalizado y ha comenzado a dispersarse para formar una capa
de célula única. B) Diagramas de visión lateral de los embriones en los mismos estadíos que en (A).
Inmediatamente posterior al proceso de gastrulación, comienza el proceso de extensión de
la banda germinal, donde aparecen los primeros signos visibles de segmentación. Nueve
horas post fecundación, la banda germinal se retrae y el cuerpo adopta un ordenamiento
antero-posterior convencional.
- Segmentación
Una de las características comunes entre muchos animales es la formación de unidades
morfológicas repetitivas llamadas segmentos o metámeros. Estos segmentos pueden ser
esencialmente indistinguibles como lo es el caso de un ciempiés o bien cumplir funciones
más especializadas, como por ejemplo, los segmentos torácicos que se asocian a funciones
locomotoras, donde se desarrollan estructuras como alas y patas.
En el caso de Drosophila melanogaster, la segmentación se cataloga de acuerdo a dos
registros: los parasegmentos embrionarios y los segmentos larvarios/adultos, los cuales se
definen durante etapas tempranas de desarrollo mediante mecanismos moleculares
sumamente regulados.
La simetría bilateral que presentan estos animales está asociada a la existencia de dos ejes
principales, ortogonales entre sí: antero-posterior (A/P) y dorso-ventral (D/V). A lo largo
del eje A/P, la larva presenta una división con 12 segmentos: cabeza en la región anterior,
seguida por una división regular de 3 segmentos torácicos y 8 segmentos abdominales, cada
uno de los cuales posee una identidad definida, tanto en su cara externa como interna
(Figura 8). En cuanto al eje D/V, éste define cuatro regiones en el cuerpo larval.
Figura 8: Segmentación, de izquierda a derecha: Cabeza, segmentos torácicos T1-T3 y segmentos
abdominales A1-A8.
Por su parte, los animales adultos presentan una segmentación análoga a las larvas: la
cabeza, 3 segmentos torácicos y 8 segmentos abdominales.
• La cabeza tiene a su vez tres segmentos, más una región no segmentada, y
lleva la boca dotada de un complejo aparato mandibular. Hay un par de
antenas y de voluminosos ojos facetados de color rojo.
• El tórax consiste de tres segmentos (protórax, mesotórax y metatórax), cada uno
de los cuales lleva un par de patas provistas de numerosas articulaciones. Presenta a
su vez un par de alas insertas en la superficie dorsal del mesotórax, y otro par de
“alas” reducidas, o halterios, que se encuentra en la región dorsal del metatórax.
• El abdomen está compuesto por 8 segmentos que superficialmente adoptan la
forma de anillos.
La determinación de segmentos y adquisición de características únicas para cada uno de
ellos ocurre gracias a la acción concertada de diversos genes.
Por su parte, existen genes cuya función no radica en la formación del patrón corporal, sino
en la asignación de identidad a cada una de los parasegmentos una vez ya establecidos.
Estos son los genes homeóticos (también conocidos como genes Hox), que corresponden a
un grupo de genes relacionados entre sí que controlan la identidad de los distintos
segmentos (antena, patas, etc).
Los genes Hox codifican factores de transcripción capaces de encender y apagar genes,
mediante un dominio de interacción con el DNA denominado “homedominio” (codificado
en la secuencia nucleotídica por un dominio llamado homeobox). Asimismo, se ha descrito
que en la mayoría de los animales, los genes Hox se encuentran ordenados en el
cromosoma de la misma manera en que su expresión se distribuye a lo largo del eje A/P del
animal (Figura 9).
Figura 9: Esquema ilustrando los segmentos determinados por los genes homeóticos lab (labial),
dfd (deformed), scr (sex combs reduced), Antp (antennapedia), Ubx (ultrabithorax), abdA
(abdominal-A) y AbdB (abdominal-B), cuyo código de colores representa los segmentos que
determina durante el estadio adulto (arriba) y larvario (abajo).
Organogénesis. Regulación de la expresión génica y la selección de la identidad
celular
La organogénesis corresponde al conjunto de procesos que permiten que células
provenientes de las tres capas germinales, ectodermo, mesodermo y endodermo se
diferencien hacia tejidos específicos para constituir los distintos órganos que forman parte
del animal completo. En el caso de Drosophila, estos son:
•
•
•
Ectodermo: Es la capa de tejido más externo de las 3 capas germinativas. Da origen
a la epidermis del embrión, larva y adulto, que a su vez son células responsables de
la secreción de cutícula en el adulto. Asociada fuertemente a la epidermis se
encuentran los discos imaginales de las larvas, que posteriormente se convertirán en
apéndices en el adulto. Esta capa germinal tambien da origen a las glándulas
salivales de la larva.
Mesodermo: Corresponde a la capa germinal intermedia. Da origen a células
musculares y cardioblastos.
Endodermo: Es la capa más interna de tejido, y dará origen al intestino.
La división del blastodermo en los primordios de dichas tres capas germinales ocurre
gracias a la acción conjunta de diversos genes. En la ausencia de dichos genes, solo se
especifican destinos ectodermales, por lo que el estado ectodermal pareciera ser el estado
por defecto.
Existen vías de señalización que guían la fina regulación temporal y espacial durante este
proceso, la cual es particular para cada uno de los tejidos. Cabe destacar que para el
establecimiento de identidad celular de los órganos internos, también participan algunos de
los genes homeóticos.
Asimismo, en etapas tempranas de desarrollo, las células se “comprometen” hacia
determinados linajes, esto quiere decir que las posibilidades de los tejidos a los que
potencialmente se podría transformar, son limitadas y a medida que la célula se
compromete, este pool de posibilidades se va acotando aún más. Una vez la célula ha
adquirido una identidad determinada, ésta expresa de manera regulada los genes requeridos
para la mantención de las características del tejido al que pertenece.
Los discos imaginales se forman a partir de células que se escinden del epitelio embrionario
y heredan características genéticas particulares (genes del complejo Hox) que los definen
en su destino adulto. Así encontramos discos de ala, halterios, pata (3 pares), ojo-antena,
genitales y labiales.
Desarrollo larvario y metamorfosis. Control hormonal del desarrollo
- Desarrollo larvario
Las larvas de Drosophila tienen principalmente dos tipos de poblaciones celulares: las
células larvarias, presentes en los tejidos utilizados para las funciones durante este estadío;
y las células presentes en el tejido imaginal, que se encuentran dentro de las larvas en un
estado indiferenciado, pero que corresponden a precursores para los tejidos presentes en el
adulto o imago, y de ahí su nombre.
Durante el desarrollo larvario de estos animales existen distintos mecanismos para el
crecimiento de los tejidos. Por ejemplo, los tejidos larvarios como el intestino, las glándulas
salivales, los cuerpos grasos y los músculos crecen principalmente por aumento del tamaño
celular mientras que el número de células permanece constante. Dichas células aumentan su
masa como consecuencia de un aumento en la carga genética de los núcleos celulares, esto
quiere decir que las células replican su DNA pero no atraviesan la fase de mitosis, lo que
lleva a la generación de núcleos de gran tamaño. Durante el proceso de metamorfosis estos
tejidos son degradados, salvo los túbulos de Malpighi (sistema excretor). Otras estructuras
necesarias en el adulto, como las glándulas salivales, se regeneran a partir de anillos
imaginales.
Por su parte, los discos imaginales y anillos imaginales crecen mediante proliferación
celular, y a diferencia de los tejidos larvarios, no se degradan durante el proceso de
metamorfosis sino que sufren un proceso importante de reestructuración.
En Drosophila existen 10 pares de discos imaginales, que se convertirán luego en órganos
adultos, y un disco genital (singular) que formará las estructuras reproductivas. A su vez, la
epidermis abdominal forma un pequeño grupo de células imaginales llamadas histoblastos
que yacen en la región del intestino de la larva.
Los discos imaginales, al comienzo de su desarrollo corresponden a grupos reducidos de
aproximadamente 30 a 40 células cada uno, las cuales proliferan rápidamente a tiempos
específicos y característicos, hasta alcanzar un número total de células al final del estadío
larvario III cuando detienen el ritmo proliferativo. El disco más grande es el de ala, que
prolifera hasta alcanzar aproximadamente 60.000 células, mientras que los de pata y
halterio alcanzan alrededor de 10.000 cada uno. Asimismo, mientras las células proliferan,
forman un epitelio tubular que se pliega en una especie de espiral compacto.
- Metamorfosis
En insectos holometábolos, el proceso de metamorfosis (transformación de larva a adulto)
ocurre adentro de la cutícula de la pupa. La mayor parte de los órganos larvarios son
sistemáticamente destruidos, mientras que nuevos órganos adultos se desarrollan a partir de
tejido precursor indiferenciado, el tejido imaginal.
Durante el proceso de metamorfosis, los discos evierten (como “dar vuelta un calcetín”) y
adquieren la forma y características particulares del apéndice en el individuo adulto.
Figura 10: Esquema del interior de una larva mostrando los discos con código de colores,
señalizando la estructura correspondiente en el animal adulto, conservando el mismo código.
Tanto los procesos de muda larvarios como el de metamorfosis de estos insectos están
regulados por hormonas efectoras, que son controladas por neurohormonas en el cerebro.
Estas son 20-hidroxiecdisona y la hormona juvenil lipídica. La ecdisona inicia y coordina
cada muda y regula los cambios en la expresión génica que ocurren durante el proceso de
metamorfosis. La hormona juvenil previene, durante las etapas juveniles, que la ecdisona
induzca cambios en la expresión génica asociados a la metamorfosis, y como consecuencia,
su presencia durante cada muda asegura que el resultado de dicha muda sea una larva más
grande y no una pupa o un adulto.
SECCIÓN PRÁCTICA
1. Observación de cultivos de Drosophila melanogaster
Se entregarán a los alumnos viales con individuos de Drosophila durante las
distintas etapas de desarrollo: embriones, larvas y adultos.
Los alumnos observarán el comportamiento de los animales, en cuanto a sus hábitos
de alimentación (larvas) y vuelo (adultos), así como la distinta coloración que
adquieren las pupas de acuerdo al estadío de desarrollo.
2. Reconocer las diferentes etapas del desarrollo y sus principales características
Los alumnos observarán bajo la lupa, animales en distintos estadíos de desarrollo para
observar y dibujar las características morfológicas principales.
2.1.Embriones
Los alumnos observarán muestras de embriones que serán entregadas por el personal del
laboratorio para observar características como el corion y filamentos respiratorios.
Para ello, se deberán aislar los embriones a partir de unas placas conteniendo
levadura (que promueve la puesta de huevos por parte de los animales, pues es
afrodisíaco para ellas) mediante lavado con agua de la llave.
Luego se pasarán los embriones por un colador fino para lavarlos completamente y
posterior a ello, se sacarán los embriones del colador con la ayuda de un pincel y se
pondrán sobre una superficie de vidrio llamada portaobjeto.
Posteriormente se procederá a remover el corion de los embriones para poder observar las
estructuras presentes bajo dicha capa de células. Para ello se deben repetir los pasos 1 y 2
del punto anterior y proseguir como se detalla a continuación.
Sumergir los embriones (dentro del colador) en una solución de cloro al 10%
(preparada previamente con una parte de cloro doméstico y una parte de agua),
procurando que los embriones no salgan del colador.
Dejar dentro del cloro durante un minuto agitando el colador hacia los lados
suavemente (como un pequeño “tiritón” de manos).
Lavar con abundante agua para retirar todo exceso de cloro y sacar los embriones
suavemente con un pincel y apoyar sobre un portaobjetos para mirar bajo la lupa.
Reconocer estructuras como el surco cefálico.
2.2.Larvas
2.2.1. Estructuras externas
Los alumnos deberán observar larvas bajo la luz de la lupa y notar detalles como los
segmentos y los órganos que se puedan traslucir bajo luz blanca.
2.2.2. Estructuras internas
Se proveerá a los alumnos de muestras preparadas de distintos órganos aislados de las
larvas para que puedan observar con mayor detalle.
2.3.Pupas
Los alumnos deberán observar pupas de distintos estadíos bajo la lupa y notar la rigidez de
la cutícula.
A su vez los alumnos deberán distinguir estructuras como los espiráculos y el animal en
desarrollo que se transluce a través de la cutícula.
A su vez se entregará a los alumnos unas muestras de pupas fijadas a las que se les retiró la
cutícula para que observen el animal que se encuentra dentro, durante distintas etapas del
proceso de metamorfosis.
• Notar definición de estructuras adultas y aparición de pigmentación en los ojos de
los animales.
2.4.Adultos
Se entregará a los alumnos viales con moscas adultas eutanasiadas para que reconozcan
bajo la lupa los distintos segmentos de los animales, así como las diferencias entre sexos e
individuos adultos y jóvenes. Para ello deberán:
Depositar entre 5 y 10 moscas en una placa de plástico y observar bajo la lupa.
Si los alumnos desean mover los animales para observar desde distintos ángulos,
podrán hacerlo suavemente con un pincel.
Observar detenidamente para discriminar las características especificadas a
continuación y dibujar las características más importantes.
2.4.1. Distinción entre moscas jóvenes y viejas
Existen características fáciles de identificar a simple vista para distinguir si un animal es
joven o viejo.
Las moscas viejas son más oscuras y rígidas que las moscas jóvenes.
Las moscas muy jóvenes (pocas horas posteriores a su eclosión de la pupa) serán
aún más claras y será posible distinguir una mancha oscura en el abdomen, llamada
“meconio”, que corresponde a desechos residuales del proceso de metamorfosis.
Si la mosca es aún más joven podría incluso visualizar que sus alas no se han
desplegado del todo, se observará una estructura plegada y poco rígida.
2.4.2. Reconocimiento de segmentos y apéndices
La mosca presenta una serie de segmentos fácilmente distinguibles, que se le solicitará al
alumno que observe y posteriormente dibuje.
Primero, el alumno deberá observar que el cuerpo de la mosca se divide en 3 segmentos
principales: la cabeza, el tórax y el abdomen, dentro de los cuales podrán observar
características con mayor detalle:
- Cabeza: ojos, antenas, aparato chupador.
- Tórax: alas, halterios, patas (1 par por segmento).
- Abdomen: bandas oscuras, placa anal.
2.4.3. Identificación del sexo
Existen varias diferencias morfológicas permiten distinguir los machos de las hembras de
Drosophila.
El extremo del abdomen es alargado en la hembra y algo redondeado en el macho.
La distribución de bandas oscuras en los segmentos abdominales permite distinguir
a ambos sexos sin necesidad de usar microscopio: El abdomen de la hembra tiene 7
segmentos y el macho 5.
Los machos poseen el denominado peine sexual, un cepillo de más o menos 10
gruesas cerdas negras ubicadas en la superficie distal de la articulación tarsal del
primer par de patas.
El disco anal de los machos es más oscuro que el de las hembras, y probablemente
ésta la característica más fácil de identificar para la distinción entre machos y
hembras.
Objetivo específico 2: Reconocer cómo el genoma es determinante del desarrollo
SECCIÓN TEÓRICA
INTRODUCCIÓN
Una de las principales preguntas de la biología es cómo a partir de una célula se origina un
individuo completo y en este mismo sentido, cómo a partir de una célula se originan los
distintos tipos celulares que poseen la misma secuencia de ADN, preguntas que los
biólogos del desarrollo tratan de responder, principalmente mediante estudios genéticos
(utilizando mutantes). El control preciso de la expresión genética tejido-específica es
central para la diferenciación celular y el desarrollo. Para controlar estos procesos, los
programas de desarrollo utilizan redes genéticas regulatorias que consisten de múltiples
componentes que ejecutan los distintos procesos involucrados en la diferenciación, donde
se requiere una regulación génica altamente dinámica, con el fin de encender y apagar
genes cuando sea necesario durante el desarrollo y para responder a señales ambientales
específicas. Todo esto se ha estudiado en diversos modelos animales, donde el más
utilizado es el uso de Drosophila melanogaster debido a las invaluables herramientas
genéticas que este organismo proporciona. Los primeros genes que participan en el
desarrollo son aquellos heredados por la madre en forma de ARN mensajeros (ARNm), por
lo que comenzaremos estudiando su producción y posterior participación durante el
desarrollo.
Desarrollo en Drosophila melanogaster.
Como se mencionó, la formación de patrones del embrión de Drosophila empieza con
señales proveídas maternalmente, las que se transforman posteriormente en gradientes de
factores de transcripción que controlan la expresión de genes blanco río abajo a lo largo de
los ejes antero-posterior y dorso-ventral. Los blancos de estas vías incluyen proteínas
regulatorias y estructurales que colaboran para definir la posición y la identidad de los
segmentos larvales y para controlar la diferenciación de las capas germinales.
Los precursores de los gametos se dividen mediante meiosis para generar células haploides
(con un solo conjuntos de cromosomas, a diferencia de las diploides que poseen dos). En
este punto cabe recordar que las células eucariontes pueden dividir sus núcleos tanto por
mitosis como por meiosis, la primera ocurre en células somáticas, precede a la división
celular y consiste en repartir de manera equitativa del material hereditario (ADN) y
finalmente produce dos células hijas idénticas, es un proceso esencial en el crecimiento,
reparación de tejidos y en la reproducción asexual. Mientras que la meiosis permite la
división de los gametos y produce células genéticamente distintas y es el fundamento de la
reproducción sexual y de la variabilidad genética. Durante la meiosis, se producen dos
divisiones sucesivas y así se generan cuatro células haploides. Ambas divisiones
comprenden las etapas profase, metafase, anafase y telofase, pero no existe replicación de
ADN entre ambas.
Oogénesis.
El sistema reproductor femenino contiene dos ovarios, cada uno con aproximadamente una
docena de ovaríolos que contienen una línea de ensamblaje de cámaras de huevo en
maduración. Cada cámara de huevo contiene un oocito y 15 células nodrizas, las que
derivan de la línea germinal y están rodeadas por una monocapa de células foliculares
somáticas (esto se analizará con más detalle en el Objetivo 3). Las células nodrizas
endoreplicadas pasan por un período de transcripción masiva y son responsables de la
síntesis de la mayoría de los productos maternos, los que son depositados en el oocito en
desarrollo a través de puentes citoplasmáticos. Durante su residencia de tres días en la
cámara de huevos, el oocito es detenido en la Profase I de la meiosis. Tres horas antes de
ser liberado, el oocito madura y progresa hacia Metafase I y ciertos ARNm maternos
latentes, se activan transcripcionalmente.
Activación del huevo.
Este fenómeno sirve para gatillar eventos celulares y moleculares adicionales que preparan
al oocito maduro para la embriogénesis temprana. En Drosophila, la activación del huevo
gatilla la completación de la Meiosis, la depolimerización de microtúbulos y cambios
postranscripcionales que incluyen poliadenilación citoplasmática, activación traduccional y
desestabilización de ARNm. Además, el huevo se hincha debido a la activación y la
membrana vitelina, que es el componente más interno de la cáscara del huevo, se hace
impermeable. La activación precisa del huevo en Drosophila ha sido difícil de estudiar
debido a que ocurre muy rápidamente y dentro de la mosca adulta.
Fertilización.
En el reino animal, los individuos se originan mediante la fusión de dos células haploides
altamente especializadas (gametos), el espermio y el oocito. Luego de la fertilización, se
forman los pronúcleos femenino y masculino y las proteínas y ARNm maternos se
depositan en el oocito fertilizado donde ejercen su función. Durante esta primera etapa el
genoma cigótico es transcripcionalmente inactivo.
Embriogénesis temprana.
La particularidad de Drosophila en este proceso es que ocurren 13 divisiones nucleares
rápidas y sincrónicas, sin citoquinesis, produciendo 5000 núcleos dentro de un mismo
citoplasma. Los eventos de la embriogénesis temprana ocurren en ausencia de la
transcripción cigótica y por lo tanto son dependientes de las moléculas proveídas
maternalmente. Las primeras siete divisiones nucleares ocurren en el interior del embrión,
pero durante los ciclos octavo y noveno, la mayoría de los núcleos migran hacia la
periferia. Los primeros núcleos en llegar al polo posterior formarán las células del polo, que
darán lugar a la futura línea germinal. Para los núcleos restantes (totipotenciales), los ciclos
10 a 13 ocurren en la superficie del embrión y corresponden al blastodermo sincicial.
Durante la interfase del ciclo 14, aproximadamente 2,5 horas después de la fertilización, la
membrana plasmática se invagina entre los núcleos para formar el blastodermo celular
(Figura 5).
Con la excepción de unos pocos genes cigóticos tempranos, es durante la interfase del ciclo
14 donde ocurre la mayoría de la transcripción cigótica (en este punto ya hay
aproximadamente 2000 núcleos), representando la Transición materna a cigótica (MZT)
en la expresión genética, proceso que incluye la degradación de los transcritos maternos
que son sustituidos por los transcritos cigóticos. Esta programación transcripcional resulta
en cambios morfológicos drásticos. La activación del genoma cigótico ocurre en dos
oleadas distintas: una menor que activa sólo una decena de genes seguida por una mayor
que activa varios cientos de genes. Unos 40 minutos después de esta transición ocurren tres
rondas más de divisiones nucleares y luego comienzan a migrar hacia la periferia, formando
un blastodermo sincicial con unos 6000 núcleos dispuestos en monocapa en la superficie.
Después de una larga interfase, durante la cual las membranas celulares invaginan para
formar el blastodermo celular, se establece el plan corporal básico y comienza la
gastrulación. La celularización marca la transición de la blástula media como el primer
evento del desarrollo que depende de productos cigóticos. Durante las siguientes horas del
desarrollo, los patrones de expresión genética especifican la identidad de segmento, las tres
capas germinales y los tipos celulares dentro de estos tejidos.
Factores maternos.
La formación de patrones en el embrión de Drosophila ocurre por la información
posicional establecida por los factores maternos, también denominados genes de polaridad
del huevo, ya que son los genes que determinan la constitución de los ejes principales de
desarrollo de Drosophila: el eje antero-posterior (A/P) y el eje dorso-ventral (D/V). La
transición inicial de las células indiferenciadas está mediada por gradientes de dos factores
de transcripción: Dorsal establece el eje dorso-ventral del embrión mientras Bicoide
determina el eje antero-posterior. bicoide es un gen materno acumulado específicamente en
la región cefálica (anterior) del oocito y es traducido después de la deposición del huevo,
resultando en una alta concentración de la proteína Bicoide en el polo anterior con niveles
progresivamente más bajos hacia el polo posterior. Esta proteína funciona como un factor
transcripcional y los altos niveles de Bicoide median la formación de las estructuras más
anteriores, los niveles intermedios de este mismo median la formación de las estructuras de
la cabeza y niveles bajos las estructuras abdominales anteriores y torácicas. Además,
Bicoide induce la expresión del gen hunchback, uniéndose a la zona promotora de éste y así
ambos se acumulan en la zona anterior del embrión (Figura 11). Cambiando los niveles de
la proteína Bicoide resulta en un cambio en la identidad posicional, lo que permite sostener
que Bicoide actúa como un morfógeno que instruye el destino celular en una manera
dependiente de su concentración. De la misma forma, Dorsal también activa genes de
manera dependiente de concentración.
Otro gen materno que se distribuye de manera opuesta a bicoide es nanos, ya que este
último se acumula especialmente en la región posterior del embrión y su concentración va
disminuyendo hacia el segmento anterior (Figura 11). Esta distribución es regulada por
otros genes como oskar, que mantiene la ubicación del ARNm de nanos antes de la
fecundación. La actividad de Nanos es inhibir la traducción del ARNm del gen hunchback.
Este último se distribuye por todo el oocito antes de la fertilización, pero luego Bicoide
promueve su expresión cigótica exclusivamente en la zona anterior, mientras nanos inhibe
su traducción en el extremo posterior. Otro de los genes de origen materno que participa en
el establecimiento del eje antero-posterior es caudal, que originalmente está distribuido en
todo el oocito, pero luego Bicoide inhibe su traducción en la región anterior.
El establecimiento del eje dorso-ventral es uno de los eventos más tempranos de la
formación de patrones en el embrión de Drosophila en desarrollo. Eventos durante la
oogénesis, incluyendo el proceso de transporte de morfógenos, resulta en una activación
localizada del receptor transmembrana Toll. Luego, diversas etapas de señalización llevan a
la localización nuclear en un gradiente dorso-ventral del factor de transcripción Dorsal, que
actuará como referencia para la formación de patrones posteriores, subdividiendo al
embrión en regiones como aquellas con altos niveles de Dorsal, que darán origen al
mesodermo y aquellas regiones con niveles intermedios darán lugar al neuroectodermo.
Respecto de Dorsal, se ha observado que al inicio de la embriogénesis esta molécula se
encuentra dispersa por todo el embrión y tras la migración de los núcleos a la periferia, esta
proteína penetra en los núcleos celulares de las regiones ventrales y laterales, pero
permanece en el citoplasma en la región dorsal. Este mecanismo de transporte dorsal está
regulado por una proteína de señalización denominada Spätzle, que presenta un gradiente
ventral a dorsal y es un ligando de los receptores Toll y como se activa dependiendo de la
abundancia de su ligando, está en plena actividad en la zona ventral del embrión y decrece
progresivamente en las regiones más laterales. Cuando Toll inicia su cascada de
señalización ocasiona la degradación de un inhibidor citoplasmático denominado Cactus, lo
que provoca su activación y así se genera el gradiente de Dorsal, especialmente en la zona
ventral y más diluido en las regiones laterales. Dorsal afecta la actividad de otras proteínas
dependiendo del umbral de sensibilidad de éstas ya que para algunas es activo como
estimulante a bajas concentraciones y para otras requiere altas concentraciones. El
gradiente generado de Dorsal repercute en la regulación de tres genes diana activados por
altas, intermedias y bajas concentraciones de Dorsal: twist, rhomboid y sog,
respectivamente.
Figura 11: Distribución diferencial de los ARNm (izquierda) y proteínas (derecha) de bicoid, nanos,
hunchback y caudal en el embrión temprano de Drosophila.
Segmentación.
Después de la acción de los genes maternos, se activan los genes cigóticos o genes de
segmentación que se expresan tras la fertilización. La segmentación a lo largo del eje
antero-posterior comienza con el establecimiento de cuatro regiones anchas por acción de
los genes gap. Después de la gastrulación se forma una serie de surcos denominados
parasegmentos y definen las áreas corporales (Figura 12). Bicoide y Hunchback activan la
expresión del gen even-skipped. La identidad de cada parasegmento está dada por la acción
de los genes pair-rule (eve y fushi tarazu) y de los genes de polaridad de segmentos, ya que
cada uno se expresa en series de siete elementos transversales al eje antero-posterior de
forma alternada (pares e impares). Finalmente, participan los genes de polaridad de
segmento, los que determinan la conversión de los parasegmentos en segmentos definitivos
(Figura 12).
Figura 12. Esquema que muestra los dominios de expresión de los genes Gap, Pair-rule y de
polaridad de segmentos en el embrión en desarrollo para el establecimiento de parasegmentos.
Luego, el grupo de genes que controlan el establecimiento de la identidad de segmento se
denominan complejos de genes homeóticos o Hox y son los últimos genes cigóticos que
actúan a lo largo del desarrollo y se activan tras el efecto de los genes de la polaridad de los
segmentos, la expresión de estos genes determina las estructuras del adulto que se formarán
en cada segmento corporal. En Drosophila, se sabe que estos genes se agrupan en dos
complejos. Uno es el Complejo Antennapedia que controla la identidad de los segmentos
de la cabeza y de los dos primeros segmentos torácicos y está compuesto de 5 genes
homeobox: labial, proboscidea, deformed, sex combs reduced y antennapedia. El segundo
es el Complejo Bithorax que controla la identidad del tercer segmento torácico y de los
segmentos abdominales y se compone de tres genes con homeobox: ultrabithorax,
abdominal-A y abdominal-B.
Morfogénesis.
Durante esta etapa, las células adquieren información posicional en un proceso que
involucra una clase particular de moléculas de señalización: los morfógenos. Los
morfógenos son ligandos que son secretados a partir de un grupo restringido de células.
Luego de su secreción, los morfógenos se mueven a partir de la fuente para formar
gradientes de concentración. La información posicional está codificada en la distribución
graduada de los morfógenos: las células son capaces de “leer” su distancia a la fuente de
sereción midiendo las concentraciones de morfógeno que las rodean. Los morfógenos se
mueven rápido desde su fuente de producción y establecen un gradiente estable que dura
varios días. Un ejemplo es Dpp, un morfógeno que provee información a lo largo del eje
antero-posterior durante el desarrollo del ala. Dpp activa directamente la expresión de
genes blanco en una manera dependiente de concentración. Los sitios de unión de los
factores de transcripción son cruciales para controlar la expresión de sus genes blanco, pero
no se sabe cómo integran la información para producir patrones de expresión genespecífico.
Durante la morfogénesis es primordial que se genere un cambio en la adhesión celular
(dado por la presencia diferencial de moléculas de adhesión, como cadherinas, por
ejemplo), lo que implica que un grupo de células presenta una adhesión selectiva respecto
de otro grupo. Esto favorece la formación de las tres capas germinales: ectodermo,
mesodermo y endodermo.
Estudio en mutantes.
Para conocer todos los procesos mencionados, los biólogos del desarrollo han utilizado
principalmente organismos (como Drosophila melanogaster) mutantes en diferentes
estadíos del desarrollo y así se ha determinado la importancia genética de las distintas
etapas del desarrollo, donde cada etapa está controlada por un grupo de genes diferente.
Debido a que los genes reguladores del patrón corporal están en una posición alta de
jerarquía, mutaciones en algunos de los componentes de estos complejos pueden provocar
grandes cambios en el fenotipo de las larvas, fenómeno denominado homeosis y
corresponde a la conversión de una parte del cuerpo en otra. El ejemplo más notorio de este
efecto son mutaciones de ganancia de función del complejo Antennapedia que convertirá
las antenas en patas.
APOYO TEÓRICO PARA PROTOCOLO
Protocolo 1: Observación de embriones en distintos estadíos
Para esta etapa, previamente se habrá realizado una “puesta” de moscas wild type (o
silvestres) para así obtener al día siguiente embriones en distintos estadíos del desarrollo.
Esta “puesta” implica dejar las moscas cruzándose toda la noche en una placa especial, que
contiene levadura para promover la obtención de un alto número de huevos.
A continuación se muestran distintas imágenes de la morfología que presentarán los
embriones en los distintos estadíos, que corresponde a lo que deberán observar los alumnos.
Blastodermo sincicial
Aparición células del polo (flecha)
Blastodermo celular
Aparición surco cefálico (flecha) y placa dorsal (punta de flecha)
Extensión de la línea germinal (línea amarilla)
Retracción de la línea germinal (línea amarilla)
A los alumnos se les entregará la placa de “puesta” ya mencionada y ellos deberán aislar los
embriones lavándola con agua de la llave.
Luego se pasarán los embriones por un colador fino para lavarlos completamente.
Posteriormente se procederá a remover el corion de los embriones para poder observar las
estructuras presentes bajo dicha capa de células, para lo cual se deben sumergir los
embriones (dentro del colador) en una solución de cloro al 10% (preparada previamente
con una parte de cloro doméstico y una parte de agua), procurando que los embriones no
salgan del colador.
Dejar dentro del cloro durante un minuto agitando el colador hacia los lados suavemente.
Lavar con abundante agua para retirar todo exceso de cloro.
Sacar los embriones suavemente con un pincel y apoyar sobre un portaobjetos.
Mirar bajo la lupa.
Indicar a los niños que observen los embriones obtenidos e identifiquen en ellos los
siguientes estadíos:
- Observar sincicio
- Observar formación células del polo
- Observar celularización
- Movimientos gastrulación
- Observar extensión y retracción de la banda germinal
Nota: Discutir con los alumnos los cambios de forma que ocurren durante el desarrollo de
Drosophila melanogaster.
Propuesta: Tinción con hematoxilina para ver proliferación en embrión (mitosis)
Protocolo 2: Observación de mutantes antennapedia
Como se mencionó al principio de esta unidad, el homeobox corresponde a un sector del
DNA genómico qua incluye una secuencia de 180 pares de nucleótidos que codifican para
un dominio proteico de 60 aminoácidos. Los genes homeóticos (como antennapedia), al
igual que los genes involucrados en el control de la segmentación de la mosca, tienen un
homeohox.
Si uno genera alteraciones en la expresión de estos genes se observarán aberraciones en el
desarrollo como errores en la identidad de órganos. El ejemplo más claro de esto es la
mutación en el gen antennapedia que genera la aparición de patas en el lugar de las antenas
(Figura 13).
Figura 13: A la izquierda se muestra una mosca silvestre y a la derecha una mosca mutante
para antennapedia.
A los estudiantes se les entregará un tubo con diversos individuos en etanol, incluyendo
moscas silvestres y mutantes para el gen antennapedia y ellos deberán distinguirlos.
Protocolo 3: observación individuos transgénicos
Sistema Gal4/UAS
El sistema de expresión GAL4-UAS es una poderosa herramienta genética desarrollada por
Andrea Brand y Norbert Perrimon en 1933 y es ampliamente utilizada en Drosophila
melanogaster para estudiar la expresión de genes, ya que permite la expresión tejidoespecífica de distintos genes de interés. Este sistema consiste de dos componentes: el
activador transcripcional de levadura Gal4, expresado en un patrón específico (dado por un
promotor particular, de interés) y el enhancer UAS (Upstream Activation Sequence) al cual
se une específicamente Gal4 para activar la transcripción génica. Por lo tanto, uno puede
utilizar este sistema para evaluar la expresión de los distintos genes necesarios durante el
desarrollo, teniendo el ADN que codifica para GFP junto a una secuencia UAS y el
activador Gal4 con el promotor del gen que nos interesa evaluar, y así veremos que las
células se verán verde exclusivamente donde se exprese nuestro gen en cuestión.
Figura 14: Esquema del funcionamiento del sistema Gal4/UAS.
En esta sección utilizaremos este sistema para observar los patrones de expresión de los
siguientes genes en Drosophila melanogaster: engrailed, nanos y ultrabithorax. Estos
genes tienen en común que actúan como factores de transcripción involucrados en el
desarrollo de este insecto, ya que actúan confiriendo una identidad específica a regiones
definidas del cuerpo y también coordinan la expresión de genes río abajo.
Se entregará a los alumnos los animales ya mencionados en estadío larvario y se observará
los patrones de expresión de los genes ya mencionados ya que expresarán una proteína
fluorescente verde (GFP), que se podrá observar al iluminar las larvas con un láser verde,
pues las larvas que expresen GFP emitirán más luz que las que no lo expresen.
1. Tomar los viales conteniendo larvas.
2. Sacar las larvas de los tubos con pincel y ponerlas sobre una placa de plástico con
agua para lavarlas.
3. Agarrar suavemente las larvas con una pinza y traspasarlas a un pocillo conteniendo
agua limpia (este paso es importante pues la presencia de comida en el agua puede
dificultar la observación de las larvas y dañar el experimento).
4. Observar las larvas a simple viste y comparar con animales silvestres.
5. Apagar las luces y apuntar las larvas con un láser verde y observar la tonalidad de
las larvas.
6. Registrar observaciones.
Objetivo específico 3: Control hormonal del desarrollo de Drosophila melanogaster.
SECCIÓN TEÓRICA
INTRODUCCIÓN.
La mosca en un excelente sistema de estudio de los mecanismos moleculares que controlan
las transiciones en el desarrollo de organismos multicelulares, principalmente, por la
presencia de etapas claramente diferenciables, como la muda de la piel y la metamorfosis.
Estos eventos de transición están controlados estrictamente por una señalización endocrina,
la cual es mediada por moléculas denominadas hormonas, que actúan en células dianas
distantes de sus órganos de síntesis.
El desarrollo de la mosca está controlado por diversas hormonas, pero el regulador maestro
es una hormona esteroidea llamada Ecdisona (E). La ecdisona es sintetizada en las
glándulas protorácicas y luego secretada a la hemolinfa, donde es convertida a 20-hidroxiecdisona (20E). La 20E es recepcionada por sus tejidos diana, donde gatilla cambios
fisiológicos, morfológicos y de comportamiento, asociados a la muda de la piel y la
metamorfosis.
Durante el ciclo de vida de la mosca, distintos peaks de ecdisona marcan importantes
transiciones del desarrollo postembrionico. La respuesta más dramática a ecdisona se
produce en el término del estadio de larva III, donde una alta concentración de esta
hormona gatilla la formación del pupario. 10 hrs más tarde, un nuevo pulso de ecdisona
induce la transición de prepupa a pupa.
Figura 15: Cambios en los niveles de Ecdisona en relación al ciclo de vida de la mosca. Las etapas
de la larva están separadas por mudas, que son controlados por pulsos de Ecdisona. Luego se
produce nuevamente un pulso de Ecdisona para marcar la transición de larva a pupa y gatillar la
metamorfosis.
Los primeros antecedentes del mecanismo de cómo la ecdisona inicia la transformación
proviene de los cromosomas politénicos presentes en las glándulas salivales de la larva. Los
cromosomas politénicos son cromosomas gigantes en interfase, en que el ADN se replica
por endomitosis, las cromátidas hermanas no se separan y se encuentran alineadas. Los
órganos que poseen este tipo de cromosomas no crecen por proliferación celular, sino por el
aumento de tamaño de las células, es decir, estas células no se dividen, produciéndose
ciclos S-G1, manteniendo por tanto un estado permanente de interfase (sólo replican su
ADN, sin división celular).
La característica más distintiva de los cromosomas politénicos es su patrón de bandas. Este
patrón puede ser descrito citológicamente como una secuencia repetitiva y aperiódica de
bandas de altas intensidades de coloración y concentración de masa, denominadas bandas o
cromómeros, conectadas por secciones con muy poca concentración de masa o coloración,
llamadas interbandas o intercromómeros.
Los cromosomas politénicos permiten el estudio de la expresión génica y de la
diferenciación celular debido a que se producen cambios estructurales de la región
cromosómica, en que ocurre una expansión denotando zonas de alta transcripción génica.
Estas zonas son denominadas “puffs”. Así, cada cromosoma politénico posee un conjunto
definidos de “puffs” en cada estadio de larval.
Figura 16: Esquema de cromosomas politénicos.
De esta forma, se pudo analizar el efecto de la ecdison sobre la expresión génica para
iniciar las transiciones de una etapa a otra en el ciclo de vida de la mosca, dada la aparición
de “puffs” característicos en regiones definidas de los cromosomas en los periodos de
aumento de esta hormona.
Como se mencionó anteriormente, la ecdisona es importante para la formación de la pupa.
Durante el estadío pupal ocurre la metamorfosis, que es la reorganización del plan corporal
de la mosca. Esta reorganización dura alrededor de 4 días y consiste en la destrucción por
histólisis de la mayoría los órganos larvales y que son reemplazados por tejidos adultos que
se desarrollan a partir de los discos imaginales. Los discos imaginales son estructuras
epiteliales que se forman a partir de un pequeño número celular, que prolifera y diferencia
para formar las estructuras adultas.
Otro aspecto importante en el desarrollo de la mosca es el estado nutricional y como este es
censado para gatillar el avance en las distintas etapas del ciclo de vida. Durante el estadío
larval III temprano la larva crece hasta alcanzar un punto importante denominado, masa
crítica, en que la larva ha adquirido suficientes nutrientes para completar el estadío larval
sin la necesidad de alimentarse nuevamente. La restricción de nutrientes antes de alcanzar
la masa crítica retrasa el desarrollo de la larva, sin embargo, cuando esta restricción ocurre
después de este punto, la larva es capaz de pupar, sin un retraso en el desarrollo.
Cuando la larva ha crecido en condiciones normales de nutrientes, el cuerpo graso, un
tejido encargado del almacenamiento de energía, señaliza al cerebro para la liberación de
insulina, esta última actúa sobre la glándula protorácica induciendo la liberación de
ecdisona, la que finalmente inicia la pupación.
En la última década se ha determinado que la ecdisona no solo actúa en el desarrollo de la
larva o en la metamorfosis, sino que también juega un importante rol en adultos, como en la
formación del ovario y la oogénesis. La ecdisona participa a la mitad de la oogénesis, como
punto de control para asegurar una correcta producción del huevo.
El ovario de la Drosophila está compuesto por 15-20 ovariolos que se encuentran en un
desarrollo continuo. Cada ovariolo se puede dividir en 14 etapas basándose en un criterio
morfológico. La etapa 14 corresponde al huevo maduro y la primera etapa es la cámara del
huevo naciente en la región anterior de los ovariolos, llamado el germario. La etapa 8 es un
importante punto de control durante la formación del huevo, debido a que se determina si la
cámara del huevo sigue desarrollándose o muere. En esta etapa los niveles de ecdisona son
relevantes, debido a que bajos niveles de esta hormona son necesarios para un correcto
desarrollo del huevo y altos niveles van a inducir la muerte.
En mayor detalle, la cámara del huevo está compuesta por un oocito, las células nodrizas y
el folículo somático. El germario se encuentra en la punta del ovaríolo y es en esta región
donde residen las células madres que se dividen de forma asimétrica, generando una nueva
célula madre y una célula denominada cistoblasto. El cistoblasto experimenta 4 divisiones
mitóticas generando 16 células que se encuentran unidas por puentes citoplasmáticos. Este
grupo de células se conoce como quiste de la línea germinativa. Una de estas células se
convertirá en el oocito y las otras 15 en las células nodrizas, que producen gran cantidad de
proteínas y ARN mensajero que será transportado al oocito. Por otra parte, las células
somáticas formaran el folículo.
Figura 17: Esquema de un ovariolo de Drosophila melanogaster.
APOYO TEÓRICO PARA PROTOCOLO
Disección de glándulas salivales
Coloque la larva en un portaobjeto con solución de PBS.
Con ayuda de sus pinzas divida la larva en dos. Inserte unas de las pinzas en la
mandíbula y de vuelta la larva como un calcetín.
Asociadas a la mandíbula encontrará las glándulas salivales que son dos tejidos
delgados y alargados que se encuentran unidos a un lóbulo de cuerpo graso.
Separe las glándulas salivales de la mandíbula y del cuerpo graso.
Dado que las células de las glándulas salivales poseen cromosomas politénicos, son
células de gran tamaño. Observe las células.
Observación de cromosomas politénicos.
Observe en el microscopio y reconozca en las preparaciones el cromocentro, bandas
e interbandas y las regiones de activa expresión o “puffs”.
Observación de Pupas.
Reconozca los distintos estadíos pupales y observe la aparición de estructuras
adultas.
Disección de ovaríolos.
El instructor le ayudará a disecar el abdomen de una hembra y a colocar su
contenido en una gota de solución salina.
Reconozca los ovaríolos que aparecen como un par de conjuntos de estructuras
filamentosas y blanquecinas que se insertan en la región más posterior del abdomen.
Con la ayuda de un par de alfileres entomológicos separe los ovaríolos, retire la
solución salina con papel filtro y adhiera el tejido al porta objetos por desecación.
Después de algunos segundos fije la preparación con formaldehido al 5%.
Después de 5-10 min lave con varios cambios de agua destilada y tiña con una
solución diluida de azul de metileno por algunos minutos.
Lave nuevamente con agua destilada y monte la preparación con un cubre objeto
premunido de topes de plasticina. Algunas preparaciones podrán observarse sin
tinción.
NOTA: Cada ovaríolo consiste de una sucesión de cámaras, cada una llamada germario
o quiste germinal, cuyo tamaño aumenta desde el extremo distal al proximal del
ovaríolo. Las más distales son las menos desarrolladas. Cada germario está revestido
por el epitelio folicular y los menos desarrollados contienen los primeros productos de
división de una ovogonia.
Examine los quistes más desarrollados y podrá distinguir las células del clon.
Detecte aquellos quistes en los cuales es posible distinguir el ovocito y las
células nodrizas. El crecimiento del ovocito se acompaña de un aumento
progresivo de su densidad óptica y de una disminución del tamaño de las células
nodrizas. Elabore los esquemas correspondientes.
BIBLIOGRAFÍA
Gilbert, Biología del Desarrollo, Séptima edición.
Wunderlich, DePace, 2011. Modeling transcriptional networks in Drosophila development at
multiple scales. Current Opinion in Genetics snd Development, 21: 711-718.
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and Developmental Biology, 35: 82-89.
Semotok, Lipshitz, 2007. Regulation and function of maternal mRNA destabilization
during early Drosophila development. Differentiation, 75: 482-506.
González-Gaitán, 2003. Endocytic trafficking during Drosophila development. Mechanisms
of Development, 120: 1265-1282.
Boija, Mannervik, 2015. A time of change: dynamics of chromatin and transcriptional
regulation during nuclear programming in early Drosophila development. Molecular
Reproduction and development, 82: 735-746.
TRABAJOPRACTICOUNIDAD4
TALLERDEFECUNDACIÓNYBIOLOGÍADELDESARROLLO
Elpezcebracomomodelodeldesarrollodevertebrados
ParteI.Dimorfismosexual,fecundaciónydesarrollotempranodelpezcebra
Identificacióndemachosyhembras
Identificar hembras y machos es una habilidad fundamental que debe ser dominada por un
investigadorquepretendeutilizaralpezcebracomosumodelodeestudio.Machosyhembrasseven
muyparecidosalojopocoentrenado.Sólolaprácticaayudaadominarestahabilidad.EnlaFigura1se
presentaunalistadecaracterísticasqueayudanasuidentificación.
Figura 1: Comparación entre peces cebra de distintos
sexos.
Hembras:
· Coloraciónmásclaraquelosmachos
· Engeneralsonmásgrandesquelosmachos
· Son más redondas que los machos en la región
ventral
· Presentan una coloración rojiza cerca de las
aletas
Machos:
· Presentan una coloración más oscura que las
hembras
· Sucoloresamarillo/café,conrayascontrastantes
Sonmásplanosensuregiónventral(abdomen)
Tienen una coloración amarilla cerca de las
aletas
Observacióndelcomportamientodeapareamiento
1. Separarmachosyhembrasutilizandocomoreferencialafigura1ylasinstruccionesdadaspor
losprofesores.
2. JuntarlospecesseparadosenuntanquededoblefondocomoseesquematizaenlaFigura2
3. Observarelcomportamientodelospeces.¿Cómosecomportaelmacho?¿Enquémomentola
hembraliberaloshuevos,quequedanseparadosdelospadres.
4. Anotarlasobservacionesmásrelevantes.
Figura2:Usodetanquededoblefondoparaapareamientodepeces
ParteII.Desarrolloembrionario
Observacióndeldesarrollotemprano:lasprimerasdivisionesdelosblastómeros
1. Luegodelapareamientodelospeces,sedeberecuperarloshuevosutilizandouncoladordel
tamañoadecuado.Seguirlasinstruccionesdelosprofesores.
2. Unavezobtenidoloshuevos,estosdebenserpreparadosparasuobservaciónmicroscópicaen
lupas.Seguirlasinstruccionesdelosprofesores.
3. Observarloshuevosenlalupaydibujarlascaracterísticasmásconspicuasdeestos.¿Hay
movimientosenelovoplasma?¿Cuántascélulaspuedesdistinguir?
4. Losprofesoresprepararánunadelaslupasdemaneradesacarfotografíasaintervalos
determinadosparaseguirloscambiosmorfológicosdeloshuevoseneltiempo.
5. Alfinaldeesteperíodoobservaremosdichoscambiosregistradosenlasucesióndeimágenes,
sedibujaráloscambiosmásllamativos.¿Cuántasdivisionesselogróobservar?¿Cuántascélulas
lograsdistinguir?
6. Discusióndelosresultadosobtenidos
Observacióndeldesarrollotemprano:gastrulación
La gastrulación corresponde a un proceso durante el cual se mueven los blastómeros,
cambiando sus interacciones y resultando en el establecimiento de las 3 capas germinales que con el
paso del tiempo darán origen a los distintos órganos del cuerpo. Estos movimientos dramáticos
empiezancuandolavelocidaddedivisióndelosblastómerosdisminuye.
Figura3:Esquemadelagastrulaciónenembrionesdepezcebra
1. La clave para observar este dramático proceso, es obtener embriones en el estadio correcto.
Estosseránprovistosporlosprofesores.
2. Conlosembrionesyaidentificados,seprocederáaobservarlosbajolalupa,talcomosehizocon
losembrionesmástempranos.Esnecesariodibujarlascaracterísticasmásllamativas.
3. Luego, se procederá a registrar la gastrulación tomando fotografías bajo la lupa de los
embrionesporuntiempodeterminado.Losprofesoresrealizaránestaparte.
4. Transcurridoeltiempocorrespondiente,pasaremosaobservarlaseriedefotografíasobtenidas.
¿Cómo se mueven las células? ¿Pueden describir la forma en que ocurren los movimientos?
Dibujeesquemas
5. Discusióndelosresultadosobtenidos
ParteIII.Identificacióndeestructurasanatómicas:usodeanimalestransgénicos
Observacióndeestructurasanatómicas.
Unadelascaracterísticasdelpezcebraquelohatransformadoenunpotenteanimalmodelode
estudio es su transparencia, la que permite una sencilla observación de estructuras anatómicas y
procesosbiológicossinelusodesofisticadossistemasópticos.
Las larvas que observaremos tienen entre 1 y 5 días de desarrollo. En especial estas últimas
nadan activamente, por lo cual necesitamos inmovilizarlas. Esto se logra agregando tricaina, un
anestésicoalmediodecultivo.
Figura4:Anatomíadeunalarvadepezcebrade5díaspost-fertilización(5dpf)
1. Agregartricainaalmediodecultivo.Esperarhastaquelaslarvasdejendemoverse.
2. Llevar las larvas a la lupa, basándose en la figura 4 y las instrucciones entregadas por los
profesoresidentificarlamayorcantidaddeestructurasanatómicasposibles.Dibujar.
Analizaranimalestransgénicosquemarcandiversasestructurasanatómicas
Utilizando lupas de fluorescencia (ubicadas en el Laboratorio de Biología del Desarrollo) se
visualizarálaexpresióndeproteínasfluorescentes(GFP,mCherry),quereportanlaexpresióndegenes
específicos en distintas estructuras anatómicas de larvas de 3 dpf. Se cuentan con distintas líneas
transgénicasquemarcandistintoscomponentescelularesenlalarva,comosemuestraenlafigura5.El
objetivoesqueelestudianteseacapazdediscriminartiposdemarcasyaquéestructuracorresponde.
Figura5:ExpresióndeGFPenelsistemacirculatorioyneuronasenlarvasdepezcebra
Enestasecciónanalizaremosdostiposdetransgénicos:
1.NeuroD: factor de transcripción basic hélix loop hélix, gen pan neuronal de diferenciación
tempranadeneuronasdelsistemanerviosocentralyperiférico,ademásdeladiferenciacióndel
páncreas, expresándose en las células beta pancreáticas y enteroendocrinas. Se expresa en
interneuronasyneuronasmotorasdelamédulaespinal,elnerviodelalínealateralposteriory
proyecciones anterior y dorsal, nervio óptico y cerebro anterior-medio-posterior, cerebro,
ganglioscraneales,etc.
2.Fli1:(proto-oncogenFli1)permiteobservarlaangiogénesisdelpezdesdeestadiostempranos.Se
observaelmesodermolateralylavasculaturacompleta,laaortaanteriorydorsal,elcorazón,
lascélulasendoteliales,elendocardio,losvasossanguíneos,lavasculaturacranial,entreotros.
Yprocedemosconlaactividad:
1. Agregartricainaalmediodecultivo.Esperarhastaquelaslarvasdejendemoverse
2. Llevar las larvas a la lupa de fluorescencia, y con la ayuda de los profesores observará
estructurasmarcadasconfluorescenciaenlaslarvas.Dibuje.
3. Segúnloobservadoenlalupadefluorescencia,¿aquécreequecorrespondenlasestructuras
queseencuentranmarcadasconfluorescenciaenlalarva?.
Discutasobrecómolaobservacióndecomponentescelularesinvivopuedeserútilenelestudiodela
biologíadeldesarrollo.
ParteIV.Elpezcebraencomomodeloparaelestudiodelosefectostóxicosdelcigarrilloyelalcohol
Muchasdelascualidadesembrionariasdelpezcebra,talescomolafecundaciónyeldesarrollo
externos,lagrancantidaddeembrionesqueseobtienenporcadacruceylatransparenciadelostejidos
delpezdurantelasetapastempranas,asícomosufácilmantenciónydebajocosto,hanpromovidosu
implementacióncomomodeloenensayosdetoxicidadambientalydeevaluaciónderiesgosdesalud.
Estosensayospermiten,porejemplo,analizarelaguaysuelodeunlugarenespecíficoenestudiosde
ecotoxicidad,evaluarlatoxicidadasociadaconproductosderivadosdelpetróleoyestudiarlosefectos
dealgunospesticidas.
El humo del cigarrillo contiene más de 4.000 compuestos conocidos, incluyendo más de 300
agentescancerígenos.Elconsumoregulardelcigarro,estádirectamenteasociadoconeldesarrollode
enfermedades cardiorrespiratorias, tales como enfermedades coronarias, enfermedad pulmonar
obstructiva crónica y cáncer de pulmón, así como riesgos de infertilidad y complicaciones durante el
embarazo. Mientras que el abuso del consumo de alcohol se relaciona con problemas de hígado,
páncreasyestómago,aligualqueretrasoyanomalíaseneldesarrollofetal.
En esta sección, embriones de pez cebra serán expuestas a distintas concentraciones de
extractodehumodecigarro(EHC)oetanolylosefectosqueestoscompuestostengaseneldesarrollo
seránevaluados.
Actividad
1.
Preparacióndedilucionesdeextractodehumodecigarro
1.1.
Instalarlabombadevacíoylabotellaespecialcondossalidas(Figura6)siguiendolas
instruccionesdelosprofesores.
1.2.
Obtenerelextractodehumodeuntotaldetrescigarrospormediodelburbujeocreado
porlasuccióndelabomba.
1.3.
Preparardilucionesdelextractoobtenidoenmediodecultivo,deacuerdoalasiguiente
tabla.
Dilución 0%
0.25%
0.5%
0.75%
1.0%
1.5%
2.0%
2.5%
EHC
0
12.5 l
25.0 l
37.5 l
50 l
75 l
100 l
125 l
Medio
5ml
5ml
5ml
5ml
5ml
5ml
5ml
5ml
Figura6:Equiponecesarioparalapreparacióndeextractoadehumodecigarro.Enlafigura
se observa la botella especial con salidas, una con cigarrillo y la otra unida a la bomba de
vacío.
Objetivo
Identificar alteraciones del desarrollo del pez cebra al ser incubado con alcohol.
Materiales
Pipetas plásticas
Microplacas de 6 pocillos
Reactivos
Solución E3
Soluciónes de Etanol al 0,5% v/v y 1,5% v/v en E3
Inicio del ensayo: día 0
Temperar cada solución de exposición a 26°C±1°C antes de comenzar el ensayo. Para comenzar la exposición tan pronto como sea posible, transferir inmediatamente cerca de
60 huevos a la solución control temperada. Posteriormente, transferir a las microplacas de 6
pocillos solo los huevos fecundados y sin ningún tipo de anomalía, de manera que cada pocillo
contenga 10 huevos en 5 ml de solución, y existan 2 réplicas para cada condición, como lo
muestra la siguiente imagen:
Figura 1
Control Negativo: Huevos en medio E3. Tratamiento 1: Huevos en Etanol 0,5% v/v.
Tratamiento 2: Huevos en Etanol 1,5% v/v.
Cubrir las microplacas con su respectiva tapa e incubar a 26 °C ± 1°C durante 48 a 96 horas.
Registre la hora de inicio del ensayo.
Desarrollo del ensayo: días 1 a 4
Temperar un volumen de muestra adecuado al número de grupos de exposición utilizado (10
ml de E3 y 10 ml para cada condición).
Cada 24 horas luego del inicio de la exposición examinar cada uno de las sub-poblaciones y
registrar las observaciones diarias según corresponda a cada día de ensayo.
Remover de cada pocillo a todos los individuos muertos y restos de corion. Después de finalizar la observación y cuantificación de los parámetros correspondientes,
diariamente realice una renovación de la solución de exposición de cada pocillo en todas las
microplacas (tanto de control como las condiciones). Para ello debe ser reemplazada al menos
3⁄4 partes del volumen inicial con solución de exposición fresca y previamente temperada a
26°C±1°C. Parámetros básicos de observación
Número de individuos muertos
Al día 1 un embrión se puede considerar muerto si se observan huevos coagulados, estos pueden ser claramente identificados, son opacos y parecen ser oscuros cuando se observan a través de un microscopio. A partir del día 2 sólo la total ausencia de latidos cardiacos es indicador inequívoco de la muerte de los embriones (ver figura 2). Figura 2
Número de individuos eclosionados
En los días 2, 3 y 4 del ensayo es necesario cuantificar el número de individuos que ha eclosionado en cada grupo. Para ello, es vital que en estos días ésta sea la primera respuesta a evaluar. Cuidadosamente, abrir cada placa multipocillo y sin tocar los pocillos contar el número de individuos que se encuentran fuera del corión. Si luego de terminar el registro diario de esta respuesta, algún embrión eclosiona al ser manipulado para el registro de las respuestas siguientes, este no debe ser contado como eclosionado dicho día, sino al día siguiente. Se considera que un individuo ha eclosionado cuando se encuentra total o parcialmente fuera de su corion. 1 dpt
2 dpt
4 dpt
Condición
Muertos
Muertos
Eclosionados
Muertos
Eclosionados
Control
Etanol 0,5%
Etanol 1,5%
Número de individuos con malformaciones generales
En los días 2 y 4 cuantificar la cantidad de individuos que presenta cualquiera de las malformaciones según Tabla 1, sin tomar en cuenta la severidad de la respuesta, sólo su presencia o ausencia. Malformación
Día 2
Día 4
Microftalmia
X
X
Microcefalia
X
X
Curvatura corporal
X
Aletas pectorales anormales
X
Vesícula ótica anormal
X
X
Saco vitelino anormal
X
X
Tabla 1
Figura7:Estadosembrionariosylarvariosdepezcebra
TRABAJO PRACTICO UNIDAD 5
UNIDAD 5: EFECTOS DEL AMBIENTE SOBRE EL DESARROLLO ANIMAL
Objetivo 1. Efecto de la nutrición sobre el desarrollo del animal
SECCIÓN TEÓRICA
En el desarrollo de los seres vivos las condiciones ambientales y nutricionales son de gran
importancia.
Como se mencionó en la unidad 3, las larvas en estadío III, se alimentan hasta alcanzar la
masa crítica. Si se produce una privación de nutrientes antes de que la larva alcanza este
punto de control, el animal pausa su desarrollo, extendiéndose el periodo de desarrollo
larval hasta reestablecerse la alimentación. En contraste, cuando la larva sufre de privación
de nutrientes luego de haber alcanzado la masa crítica, el animal continúa su desarrollo
normal.
Por otra parte, existe una interesante relación entre el tiempo de privación de nutrientes
durante el periodo larval y el tamaño final del adulto. El tamaño corporal aumenta
drásticamente durante el periodo larval, contribuyendo con la mayor parte del tamaño de la
mosca adulta, por tanto, la duración del periodo larval es un parámetro importante para la
determinación del tamaño del adulto. La privación de nutrientes antes de adquirir la masa
crítica extiende la duración de la etapa larval, sin embargo, no afecta el tamaño del adulto.
En cambio, si la falta de nutrientes se produce después del punto de masa crítica sí se
reduce el tamaño del adulto, debido a que no se extiende la duración del periodo larval.
Esto sugiere que el estímulo de privación de nutrientes disminuye la tasa de crecimiento
(incremento de la masa corporal en el tiempo) en el periodo larval, pero en el caso que la
falta de nutrientes precede la masa crítica, la extensión del periodo larval puede compensar
la disminución en la tasa de crecimiento para la obtención de un adulto de tamaño normal.
Cabe destacar, que si la larva no ha alcanzado la masa crítica no continuará el desarrollo
para la formación de la pupa.
PARTE PRÁCTICA
•
Observe las diferencias de tamaño de larvas en estadio III que han sido o no
sometidas a condiciones de privación de nutrientes.
•
Compare el tamaño de las pupas y adultos provenientes de larvas alimentadas
normalmente y de larvas sometidas a privación de nutrientes luego de alcanzar la
masa crítica.
Objetivo 2. Teratogénesis y Mutagénesis
SECCIÓN TEÓRICA.
La teratogénesis (del griego teratos, que significa monstruo), se refiere a malformaciones
anatómicas, tanto macroscópicas como sutiles, incluyendo malformaciones físicas y
deficiencias mentales o conductuales, así como también a retrasos en el desarrollo
intrauterino, que ocurren como consecuencia de la exposición a un agente teratogénico
durante el periodo gestacional. Estos agentes pueden ser de variada naturaleza, como lo
son:
•
•
•
•
•
Sustancias químicas como el alcohol, la nicotina, determinados tipos de hormonas,
ciertos antibióticos (tetraciclinas), talidomida, entre otros.
Agentes físicos como la radiación solar o la exposicón a rayos X.
Agentes infecciosos como virus o bacterias
Enfermedades maternas
Carencia nutricional de la madre
Cabe destacar que el efecto post-natal que pueda producir el agente teratogénico dependerá
de varios factores, como el tipo de agente y exposición (etapa del desarrollo embrionario y
tiempo de exposición al agente), siendo el periodo de 3-8 semanas de gestación el periodo
más susceptible, dado que en el caso de los humanos es cuando está ocurriendo el proceso
de organogénesis. Asimismo, son importantes características de la madre como hábitos y
susceptibilidad a enfermedades. Dada la naturaleza variada de estos agentes, los
mecanismos de acción también lo son, pero para ejemplificar, pensemos en la talidomida,
que es un fármaco que se utilizó en el periodo comprendido entre los años 1958 y 1963
para el control de las náuseas que ocurren durante el primer periodo del embarazo, pero que
presentaba efectos adversos terribles: tras su uso nacieron miles de niños con
malformaciones en las extremidades, siendo éstas excesivamente cortas e incluso
inexistentes.
Por su parte, la mutagénesis, se refiere al proceso en que la información genética de una
célula es alterada de manera estable. Este proceso puede ocurrir espontáneamente en la
naturaleza o bien, ser consecuencia de la exposición a agentes mutágenos. Las
consecuencias de un proceso de mutagénesis pueden ser de variada naturaleza, desde ser
neutras (sin efectos aparentes), a causar enfermedades como cáncer u otro tipo de
enfermedades heredables, pero a su vez también representa una de las causas importantes
que ha impulsado la evolución de las especies. Por su parte, el mecanismo por el cual
aparece mutagénesis dependerá fuertemente del agente causal.
Una de las causas más comunes de mutagénesis endógena corresponde a fallas en la
maquinaria de replicación del ADN, o por daños físicos en dicha molécula a causa de
especies reactivas de oxígeno (generadas normalmente mediante procesos asociadas al
metabolismo celular).
En cuanto a los agentes exógenos, éstos pueden ser de diversa naturaleza:
•
•
•
Mutágenos químicos: compuestos capaces de alterar estructura del ADN como el
ácido nitroso (agente desaminizante), brominas y derivados.
Mutágenos físicos: radiaciones que pueden alterar la secuencia y estructura del
ADN, como por ejemplo la radiación ultravioleta que pude generar dímeros de
pirimidina (tipo de nucleótidos, bloques esenciales de la molécula de ADN), y la
radiación gamma, que es ionizante. Por su parte se ha descrito que el ultrasonido,
con una frecuencia de 400.000 vibraciones/segundo, es capaz de inducir mutaciones
en Drosophila.
Mutágenos biológicos: aquellos organismos o entidades que contienen ADN propio,
capaces de alterar las secuencias del material genético de su hospedador, como por
ejemplo bacterias, virus y transposones.
Cabe destacar que el evento de mutagénesis que ocurre en las células de un individuo puede
ser transmitido a la descendencia o no, de acuerdo a las células que estén afectadas. Si las
células que mutan son somáticas (cualquier parte del cuerpo exceptuando la línea
germinal), entonces la mutación generada por el agente mutágeno no será heredable. Pero,
si la mutación ocurre en células de la línea germinal, entonces ésta formará parte de la
descendencia.
Las mutaciones somáticas podrían o no generar un efecto macroscópico evidente, que a su
vez podría ser nocivo o neutro. En el caso desafortunado de que la mutación ocurra en
genes llamados supresores de tumores, existe la posibilidad de que dicha célula adquiera
características que la vuelvan más susceptible a que ante un nuevo evento de mutagénesis,
se convierta en tumoral.
Las mutaciones que ocurran en la línea germinal en cambio, por lo general no presentan
sintomatología en el individuo que sufre la mutación, sino que esta, en el caso de no ser
neutra, generará un efecto en la descendencia, siendo el individuo completo afectado por
dicha mutación. Ahora bien, existen mutaciones en determinados genes que pueden generar
patologías graves, las cuales se encuentran en la base de datos de OMIM, del inglés Online
Mendelian Inheritance in Man (http://www.omim.org/). Estas son enfermedades heredables
de forma mendeliana, es decir que se puede predecir fácilmente su herencia pues se
encuentran ligadas a un único gen (denominadas también como enfermedades
monogénicas). Asimismo, esta mutación puede tener un carácter recesivo, dominante o
ligado al cromosoma X, que se basa en el hecho de que todos los humanos tienen dos
copias de cada gen, llamado alelo, uno proveniente de la madre y el otro del padre.
•
•
Recesividad: Los dos alelos del mismo gen deben estar mutados para que ocurra la
patología, por lo que tanto la madre como el padre deben ser portadores del gen
mutado. Ejemplo de este tipo de enfermedad es la fibrosis quística que genera
problemas graves en los pulmones.
Dominancia: Basta con que uno de los alelos se encuentre mutado para que ocurra
la patología, que puede provenir tanto de la madre como del padre. Un ejemplo de
enfermedad autosómica dominante es el Huntington, que es una enfermedad
•
neurodegenerativa progresiva, que culmina afectando habilidades tan básicas como
la capacidad de caminar, el habla y el razonamiento.
Ligado al X: Dado que la determinación del sexo en humanos está determinado de
la forma XX para la mujer y XY para el hombre. Si la mutación es dominante,
cualquier individuo, sea hombre o mujer será afectado por la enfermedad. Si la
mutación es recesiva, el hombre siempre se verá afectado (pues los hombres tienen
un solo cromosoma X), mientras que la mujer se verá afectada en el caso de que sus
dos cromosomas X estén afectados por la mutación. Ejemplo de enfermedad
recesiva ligada al cromosoma X es la Hemofilia, caracterizada por problemas en
factores de coagulación y por tanto generan procesos de sangrado excesivo y
sangrados internos espontáneos.
Dado que las patologías monogénicas ocurren producto de la mutación en un único gen, es
predecible que dicho gen cumple una función importante en los individuos, y por ende,
generalmente se encuentran evolutivamente conservados. Es así que aproximadamente el
60% de los genes asociados a enfermedades monogénicas en humanos están codificados en
el genoma de Drosophila, por lo que este modelo representa una plataforma útil para un
estudio de dichas enfermedades que permita mejor comprensión lo que a su vez posibilita la
generación de terapias específicas en el futuro.
Es evidente entonces que los agentes teratogénicos y mutagénicos pueden generar graves
consecuencias durante el desarrollo de los individuos, por lo que es menester que existan
herramientas de fácil uso que permitan determinar la presencia de dichos agentes en un
determinado medio. Es así que se han generado especies de plantas y animales como
biosensores ambientales, por ejemplo mediante el uso de promotores inducibles por la
presencia de un determinado agente (Figura 1), de manera tal que de una manera dosis
dependiente, el animal exprese una proteína reportera bajo el control de dicho promotor,
como por ejemplo del uso de proteínas fluorescentes, que en la naturaleza no son
expresadas por los animales, y la expresión ectópica puede ser fácilmente determinada
mediante el uso de microscopios de fluorescencia.
Figura 1. Panel superior: En ausencia del factor ambiental de interés, ni el promotor inducible ni el
gen reportero se expresan. Panel inferior: En presencia del factor ambiental, el promotor inducible
se enciende y activa la expresión del gen reportero, de manera tal que los individuos que porten
dicho constructo podrán ser bioindicadores de la calidad del ambiente al que se expongan.
SECCIÓN PRÁCTICA
1. Ensayar efectos deletéreos de compuestos químicos sobre la viabilidad y
morfología de las moscas.
1.1.Viabilidad
Existen compuestos químicos con una toxicidad tal que pueden afectar la sobrevida de los
animales, tanto teratogénicos como mutagénicos. En este caso se evaluará el efecto del
cobre, que en concentraciones altas genera un alto nivel de estrés oxidativo, que
eventualmente daña las células hasta generar su muerte.
Por lo tanto, se entregará a los alumnos viales con animales que fueron previamente
sometidos a concentraciones distintas de sulfato de cobre (CuSO4), y los alumnos deberán
contar el número de animales que nace, y calcular entonces el porcentaje de sobrevida ante
las distintas condiciones mencionadas.
1.2.Morfología
Se ha descrito que es posible fenocopiar (imitar el fenotipo, características visibles de un
individuo producto de lo codificado en el genoma) los efectos de mutaciones en genes
homeóticos de manera artificial con agentes químicos. Un ejemplo de ello es la exposición
de moscas sin mutaciones a altas concentraciones de éter, lo que provoca alrededor de un
30% de animales con fenotipo de animales con mutaciones en bithorax (Figura 2)
Figura 2: Izquierda: Drosophila adulta normal tiene los segmentos apropiados, con un solo par de
alas, y un par de halterios. . Derecha: Drosophila adulta mutante para el gel bithorax presenta un
cambio de identidad de segmento, lo que se traduce en el cambio del segmento T3 por T2,
provocando que los animales reemplacen el par de halterios por un segundo par de alas.
Protocolo (la parte inicial 1-4 será realizada por los miembros del laboratorio)
1.
2.
3.
4.
5.
Colectar embriones que tengan entre 2 y 3 horas de desarrollo.
Someter a un ambiente con éter saturado durante 10 minutos.
Dejar en ambiente normal y permitir que los animales se desarrollen normalmente.
Esperar que las moscas eclosionen.
Evaluar las moscas adultas y cuantificar el porcentaje de animales con fenotipo bithorax.
2. Utilizar animales transgénicos como biosensores ambientales.
Se entregará a los alumnos animales en estadío larvario que contienen una construcción
reportera de altas temperaturas, de manera tal que si los animales son expuestos al calor,
expresarán una proteína fluorescente verde (GFP), que se podrá observar al iluminar las
larvas con un láser verde, pues las larvas que expresen GFP emitirán más luz que las que no
lo expresen.
1. Tomar los viales conteniendo larvas y sumergir en agua a 37°C durante una hora.
2. Esperar 2-3 horas
3. Sacar las larvas de los tubos con espátula y ponerlas sobre una placa de plástico con
agua para lavarlas.
4. Agarrar suavemente las larvas con una pinza y traspasarlas a un pocillo conteniendo
agua limpia (este paso es importante pues la presencia de comida en el agua puede
dificultar la observación de las larvas y dañar el experimento).
5. Observar las larvas a simple viste y comparar con animales que no fueron expuestos
a las temperaturas altas como control.
6. Apagar las luces y apuntar las larvas con un láser verde y observar la tonalidad de
las larvas.
7. Registrar observaciones.