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Efectos hormonales y genéticos en el desarrollo vegetal del
humus líquido de “Eisenia foetida"
Alvarado Alva Mayra Guadalupe, Instituto Tecnológico de Roque, Juan Gabriel
Ramírez Pimentel, Instituto Tecnológico de Roque.
RESUMEN
Existen antecedentes del uso de
humus de lombriz para favorecer el
desarrollo y productividad de las
plantas, como una práctica sustentable.
En el presente trabajo de investigación
se demostró el efecto del humus líquido
en
el
incremento
de
auxinas
endógenas, con el uso de la línea de
Arabidiopsis thaliana DR5-gfp que
permite observar la presencia de
auxinas dentro del tejido en un tono
verde fosforescente al ser sometida a
luz ultravioleta.
Se demostró que el uso del humus
líquido induce la producción de auxinas
internas y no respondió como en la
aplicación externa, se mantuvo el
patrón de expresión, pero aumentó la
intensidad.
INTRODUCCIÓN
En investigaciones previas se ha
demostrado que el humus de E. foetida
contiene bacterias promotoras de
crecimiento, ácidos húmicos y fúlvicos,
además de diversos compuestos que
se asumen como benéficos para las
plantas, se ha inferido que pueden
tener actividad como reguladores de
crecimiento por los
efectos en el
desarrollo (Atiyeh y col.,2001), sin
embargo, no se había reportado la
comparación directa sobre la respuesta
genética, o a qué nivel actúan estos
compuestos.
Se tiene el precedente de los
elementos de respuesta a auxinas,
localizados en los promotores de genes
importantes para el desarrollo; de
manera artificial se crearon las
construcciones de estos elementos
fusionados a genes reporteros (DR5GUS y DR5-gfp) con ellas ha sido
posible detectar, en tejido, los sitios
donde existe producción o contacto con
auxinas activas (Muday & De Long,
2001).
En este trabajo de investigación se
comprobó el efecto positivo en el
desarrollo de la planta inducido por el
uso del humus líquido, confirmando la
que fisiológicamente el humus actúa
como sustituto hormonal, por su
respuesta fisiológica, además se
verificaron cambios en la expresión del
gen reportero en respuesta a la
presencia de los componentes del
humus líquido para corroborar si actúa
como
auxina
o
incrementa
la
producción de las auxinas endógenas.
OBJETIVO
Analizar el efecto del humus líquido en
la percepción hormonal de Arabidopsis
thaliana
L. y la correspondiente
modificación en expresión de genes
relacionados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizó como modelo de estudio una
línea de Arabidopsis thaliana L. Ecotipo
Columbia
transformada
con
la
construcción DR5-gfp, donada por el
Dr. Lenin Sanchez de la UAZ.
El humus líquido utilizado fue de la
marca “Rancho Las Potrancas”,
comercializado en Celaya, Gto.
Se prepararon dos tipos de medio de
cultivo: MS (Murashige-Skoog) al 0.1X
de dilución con agar al 1%, y MS 1x
con agar al 1%. Se esterilizó en
autoclave, se agregó 1% de humus
líquido esterilizado por filtración a
través de membrana de 0.25m y se
vertió en cajas petri.
Esterilización
de
semillas:
se
sumergieron 100 semillas en 500L de
etanol por 10min, se trataron con
hipoclorito de sodio al 1.2% por 5min,
se enjuagó 4 veces agua destilada
estéril y con ayuda de una micropipeta
se distribuyeron las semillas en las
cajas petri con el medio, formando 2
hileras para la germinación, como
control se utilizaron cajas petri sin
humus. Las cajas fueron selladas y se
incubaron a 4ºC por 48h antes de
colocarse en el cuarto de crecimiento a
25ºC con luz continua.
Se determinó la longitud de radícula y
se registró para comparar el desarrollo
con y sin humus. A los 5, 8, 11, 14,19 y
26 días se compararon de forma física
las plantas de los medios MS con y sin
humus, y MS 0.1x con y sin humus
A los mismos intervalos se tomaron
muestras de plántulas crecidas en
ambas condiciones y se observó al
microscopio con óptica de Contraste
interferencial (DIC) y con fluorescencia,
se tomó evidencia fotográfica utilizando
un microscopio invertido Olympus,
equipado con DIC y fluorescencia,
para verificar los cambios en la
expresión de la proteína verde
frourescente.
RESULTADOS
Las plántulas brotaron a los 2 días de
ser
transferidas
al
cuarto
de
crecimiento.
En el desarrollo de las plántulas se
observaron los siguientes cambios:
Día 5 MS: En el medio con humus se
notó un mayor crecimiento de los pelos
radiculares y una planta con mayor
concentración de clorofila.
Día 5 MS 0.1x: En el medio con humus
se presentaron plantas ligeramente
más altas y con una mayor
concentración de clorofila.
Día 8 MS: Las plantas lucieron con el
mismo tamaño y aparentemente la
misma concentración de clorofila.
Día 8 MSx10: Las plantas con humus
presentaron un crecimiento de raíz
ligeramente más acelerado por 0.5mm.
Día 11 MS: Las plantas con humus
presentaron un crecimiento de raíz
ligeramente más acelerado por 1.5mm.
Día 11 MSx10: Las plantas con humus
presentaron un crecimiento de raíz
ligeramente más acelerado por 0.5mm.
Día 14 MS: Las plantas con humus
presentaron un crecimiento de raíz más
acelerado por 1.5mm, el tallo de las
que contienen humus presenta un
mayor crecimiento por 2mm.
Día 14 MSx10: Las plantas con humus
presentaron un crecimiento de raíz
ligeramente más acelerado, mostrando
0.5mm más que el control, los tallos
presentan un mayor crecimiento que
los contenidos en el medio no diluido,
siendo el que contiene humus el más
largo por 4mm.
Día 19 MS: Ambos encogieron sus
raíces 0.2mm, siendo la del humus la
que mantiene sus raíces más largas
por 1.4mm y el largo del tallo por 2mm.
Este
efecto
pudo
deberse
al
agotamiento de los nutrimentos en el
medio.
Día 19 MSx10: En este medio la raíz
mantuvo su crecimiento, siendo la que
contiene humus la más larga por
0.9mm.
Día 26 MS: Las raíces presentaron
nuevamente crecimiento, siendo la que
contiene humus más largo por 0.1mm
Día 26 MSx10: Las plantas con humus
presentan un crecimiento de raíz
ligeramente más acelerado por 1.9mm.
Para el día 26 las plantas de ambos
medios agotaron los nutrientes y
comenzaron a perder el pigmento
verde y a tornarse blancas, siendo las
que tienen humus las que permanecen
con mayor concentración de clorofila y
con un mayor tamaño en raíces y tallos
(Figura 1).
8
MS
6
MS + humus
4
MS 0.1x
2
0
Día Día Día Día Día
8 11 14 19 26
MS 0.1x +
humus
Figura 1. Longitud de radícula en
respuesta a humus. En todos los casos, la
presencia de humus líquido en el medio
indujo un mayor crecimiento.
En el análisis microscópico de la
expresión de la construcción DR5-gfp
se observó que las plántulas crecidas
en presencia de humus no perciben
auxinas exógenas; se mantiene la
misma distribución en los tejidos de la
raíz, pero es evidente un aumento en el
nivel de fluorescencia, que delata una
mayor producción de auxinas en la
zona meristemática (Fig. 2).
Con humus
Con humus
Con humus
Sin humus (día 5, sin diluir)
Sin humus
Sin humus
Figura 3. Expresión del a construcción sintética
DR5-gfp a los 15 días después de germinación. La
raíz principal dismunuye la expresión del gen reportero
a la vez que se observa disminución en la tasa de
desarrollo de la raíz (Arriba). Las raíces laterales
recién formadas muestran mayor expresión del
reportero, pero la expresión es aún mayor en las
plantas tratadas con el humus de lombriz.
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
Con humus
Sin humus (día 5, diluido)
Figura 2. Expresión de la construcción sintética
DR5-gfp en respuesta a humus. A los cinco días
despùes de germinación, se observa el patrón
característico de producción endógena de auxinas en
el ápice de la raíz , en centro quiescente, células
iniciales y columella de la cofia. La expresión es más
intensa en las plántulas tratadas con humus líquido.
También es posible observar el gradiente polar de
auxinas, que se ha relacionado con la inhibición de la
formación de raíces laterales.
Conforme avanzó el crecimiento de la
plántula, la expresión de la proteína
verde fluorescente en la raíz principal
fue disminuyendo y tras la formación de
raíces laterales, los ápices de éstas
mostraron incremento en la intensidad
de la fluorescencia, indicando el
crecimiento preferencial de las raíces
laterales
sobre
la
principal
y
nuevamente, las plantas tratadas con
humus mostraron mayor nivel de
expresión del gen reportero (Figura 3).
Como conclusión se puede afirmar que
el humus no sustituye el trabajo
hormonal, su acción es a nivel genético
al motivar el incremento de producción
endógena de la hormona auxina,
manteniendo el patrón de expresión en
los tejidos, pero se observa un
incremento en la fluorescencia en
comparación con el control, lo que
explica el crecimiento acelerado de la
raíz y el tallo, así como la
concentración de clorofila en las hojas
de las plántulas tratadas con el humus.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
R.M. Atiyeh, S. Lee, 2002, The infuence of
humic acids derived from earthworm-processed
organic wastes on plant growth, Bioresource
Technology 84 (2002), 7-14
Muday Gloria K. and Alison DeLong. 2001.
Polar auxin transport: controlling where and how
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535-542.
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