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Efectos hormonales y genéticos en el desarrollo vegetal del humus líquido de “Eisenia foetida" Alvarado Alva Mayra Guadalupe, Instituto Tecnológico de Roque, Juan Gabriel Ramírez Pimentel, Instituto Tecnológico de Roque. RESUMEN Existen antecedentes del uso de humus de lombriz para favorecer el desarrollo y productividad de las plantas, como una práctica sustentable. En el presente trabajo de investigación se demostró el efecto del humus líquido en el incremento de auxinas endógenas, con el uso de la línea de Arabidiopsis thaliana DR5-gfp que permite observar la presencia de auxinas dentro del tejido en un tono verde fosforescente al ser sometida a luz ultravioleta. Se demostró que el uso del humus líquido induce la producción de auxinas internas y no respondió como en la aplicación externa, se mantuvo el patrón de expresión, pero aumentó la intensidad. INTRODUCCIÓN En investigaciones previas se ha demostrado que el humus de E. foetida contiene bacterias promotoras de crecimiento, ácidos húmicos y fúlvicos, además de diversos compuestos que se asumen como benéficos para las plantas, se ha inferido que pueden tener actividad como reguladores de crecimiento por los efectos en el desarrollo (Atiyeh y col.,2001), sin embargo, no se había reportado la comparación directa sobre la respuesta genética, o a qué nivel actúan estos compuestos. Se tiene el precedente de los elementos de respuesta a auxinas, localizados en los promotores de genes importantes para el desarrollo; de manera artificial se crearon las construcciones de estos elementos fusionados a genes reporteros (DR5GUS y DR5-gfp) con ellas ha sido posible detectar, en tejido, los sitios donde existe producción o contacto con auxinas activas (Muday & De Long, 2001). En este trabajo de investigación se comprobó el efecto positivo en el desarrollo de la planta inducido por el uso del humus líquido, confirmando la que fisiológicamente el humus actúa como sustituto hormonal, por su respuesta fisiológica, además se verificaron cambios en la expresión del gen reportero en respuesta a la presencia de los componentes del humus líquido para corroborar si actúa como auxina o incrementa la producción de las auxinas endógenas. OBJETIVO Analizar el efecto del humus líquido en la percepción hormonal de Arabidopsis thaliana L. y la correspondiente modificación en expresión de genes relacionados. MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizó como modelo de estudio una línea de Arabidopsis thaliana L. Ecotipo Columbia transformada con la construcción DR5-gfp, donada por el Dr. Lenin Sanchez de la UAZ. El humus líquido utilizado fue de la marca “Rancho Las Potrancas”, comercializado en Celaya, Gto. Se prepararon dos tipos de medio de cultivo: MS (Murashige-Skoog) al 0.1X de dilución con agar al 1%, y MS 1x con agar al 1%. Se esterilizó en autoclave, se agregó 1% de humus líquido esterilizado por filtración a través de membrana de 0.25m y se vertió en cajas petri. Esterilización de semillas: se sumergieron 100 semillas en 500L de etanol por 10min, se trataron con hipoclorito de sodio al 1.2% por 5min, se enjuagó 4 veces agua destilada estéril y con ayuda de una micropipeta se distribuyeron las semillas en las cajas petri con el medio, formando 2 hileras para la germinación, como control se utilizaron cajas petri sin humus. Las cajas fueron selladas y se incubaron a 4ºC por 48h antes de colocarse en el cuarto de crecimiento a 25ºC con luz continua. Se determinó la longitud de radícula y se registró para comparar el desarrollo con y sin humus. A los 5, 8, 11, 14,19 y 26 días se compararon de forma física las plantas de los medios MS con y sin humus, y MS 0.1x con y sin humus A los mismos intervalos se tomaron muestras de plántulas crecidas en ambas condiciones y se observó al microscopio con óptica de Contraste interferencial (DIC) y con fluorescencia, se tomó evidencia fotográfica utilizando un microscopio invertido Olympus, equipado con DIC y fluorescencia, para verificar los cambios en la expresión de la proteína verde frourescente. RESULTADOS Las plántulas brotaron a los 2 días de ser transferidas al cuarto de crecimiento. En el desarrollo de las plántulas se observaron los siguientes cambios: Día 5 MS: En el medio con humus se notó un mayor crecimiento de los pelos radiculares y una planta con mayor concentración de clorofila. Día 5 MS 0.1x: En el medio con humus se presentaron plantas ligeramente más altas y con una mayor concentración de clorofila. Día 8 MS: Las plantas lucieron con el mismo tamaño y aparentemente la misma concentración de clorofila. Día 8 MSx10: Las plantas con humus presentaron un crecimiento de raíz ligeramente más acelerado por 0.5mm. Día 11 MS: Las plantas con humus presentaron un crecimiento de raíz ligeramente más acelerado por 1.5mm. Día 11 MSx10: Las plantas con humus presentaron un crecimiento de raíz ligeramente más acelerado por 0.5mm. Día 14 MS: Las plantas con humus presentaron un crecimiento de raíz más acelerado por 1.5mm, el tallo de las que contienen humus presenta un mayor crecimiento por 2mm. Día 14 MSx10: Las plantas con humus presentaron un crecimiento de raíz ligeramente más acelerado, mostrando 0.5mm más que el control, los tallos presentan un mayor crecimiento que los contenidos en el medio no diluido, siendo el que contiene humus el más largo por 4mm. Día 19 MS: Ambos encogieron sus raíces 0.2mm, siendo la del humus la que mantiene sus raíces más largas por 1.4mm y el largo del tallo por 2mm. Este efecto pudo deberse al agotamiento de los nutrimentos en el medio. Día 19 MSx10: En este medio la raíz mantuvo su crecimiento, siendo la que contiene humus la más larga por 0.9mm. Día 26 MS: Las raíces presentaron nuevamente crecimiento, siendo la que contiene humus más largo por 0.1mm Día 26 MSx10: Las plantas con humus presentan un crecimiento de raíz ligeramente más acelerado por 1.9mm. Para el día 26 las plantas de ambos medios agotaron los nutrientes y comenzaron a perder el pigmento verde y a tornarse blancas, siendo las que tienen humus las que permanecen con mayor concentración de clorofila y con un mayor tamaño en raíces y tallos (Figura 1). 8 MS 6 MS + humus 4 MS 0.1x 2 0 Día Día Día Día Día 8 11 14 19 26 MS 0.1x + humus Figura 1. Longitud de radícula en respuesta a humus. En todos los casos, la presencia de humus líquido en el medio indujo un mayor crecimiento. En el análisis microscópico de la expresión de la construcción DR5-gfp se observó que las plántulas crecidas en presencia de humus no perciben auxinas exógenas; se mantiene la misma distribución en los tejidos de la raíz, pero es evidente un aumento en el nivel de fluorescencia, que delata una mayor producción de auxinas en la zona meristemática (Fig. 2). Con humus Con humus Con humus Sin humus (día 5, sin diluir) Sin humus Sin humus Figura 3. Expresión del a construcción sintética DR5-gfp a los 15 días después de germinación. La raíz principal dismunuye la expresión del gen reportero a la vez que se observa disminución en la tasa de desarrollo de la raíz (Arriba). Las raíces laterales recién formadas muestran mayor expresión del reportero, pero la expresión es aún mayor en las plantas tratadas con el humus de lombriz. CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN Con humus Sin humus (día 5, diluido) Figura 2. Expresión de la construcción sintética DR5-gfp en respuesta a humus. A los cinco días despùes de germinación, se observa el patrón característico de producción endógena de auxinas en el ápice de la raíz , en centro quiescente, células iniciales y columella de la cofia. La expresión es más intensa en las plántulas tratadas con humus líquido. También es posible observar el gradiente polar de auxinas, que se ha relacionado con la inhibición de la formación de raíces laterales. Conforme avanzó el crecimiento de la plántula, la expresión de la proteína verde fluorescente en la raíz principal fue disminuyendo y tras la formación de raíces laterales, los ápices de éstas mostraron incremento en la intensidad de la fluorescencia, indicando el crecimiento preferencial de las raíces laterales sobre la principal y nuevamente, las plantas tratadas con humus mostraron mayor nivel de expresión del gen reportero (Figura 3). Como conclusión se puede afirmar que el humus no sustituye el trabajo hormonal, su acción es a nivel genético al motivar el incremento de producción endógena de la hormona auxina, manteniendo el patrón de expresión en los tejidos, pero se observa un incremento en la fluorescencia en comparación con el control, lo que explica el crecimiento acelerado de la raíz y el tallo, así como la concentración de clorofila en las hojas de las plántulas tratadas con el humus. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS R.M. Atiyeh, S. Lee, 2002, The infuence of humic acids derived from earthworm-processed organic wastes on plant growth, Bioresource Technology 84 (2002), 7-14 Muday Gloria K. and Alison DeLong. 2001. Polar auxin transport: controlling where and how much. TRENDS in Plant Science Vol.6 (11): 535-542. Akanksha S, Akansha J,Birinchi Abhilash Harikesh B. 2013. management of temple floral vermicomposting using Eisenia Management 33:1113–1118. K. Sarma P. Solid waste offerings by fetida. Waste