Download Identificación varietal en vid por técnicas de Biología Molecular

Identificación varietal y
Detección de
enfermedades en vid
por técnicas de
Biología Molecular.
Lic. Luciana Garcia
Lic. Carolina Chiconofri
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
OBJETIVOS
• Utilizar como herramienta los marcadores moleculares
(microsatélites) de la vid para desarrollar un banco de datos
a partir de plantas de origen indudable que puedan ser
utilizados para la identificación de variedades de alta calidad
enológica y de gran importancia en la vitivinicultura
argentina. Ello permitirá a viveros y productores locales
asegurar la identidad genética de sus materiales.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
OBJETIVOS
•
•
Ser laboratorio oficial que trabaje en conjunto con INASE
(Instituto Nacional de la semilla), para introducir nuevo
material vegetal y controlar el material ya existente dentro
del sistema de fiscalización.
Res. SAGPYA Nº 742/2001 (en proceso de modificación).
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
¿Qué es la Biología Molecular?
Estudia las interacciones de los
diferentes sistemas de la célula,
incluyendo las relaciones entre el
Ácido desoxirribonucleico (ADN),
el Ácido ribonucleico (ARN), la
síntesis de proteínas y el
metabolismo; y cómo todas esas
interacciones son reguladas para
conseguir
un
correcto
funcionamiento de la célula.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
El dogma central de la biología
molecular describe el proceso
en dos pasos (transcripción y
traducción) por el cual la
información genética lleva a
la producción de proteínas:
DNA → RNA → proteína.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
•Ácido desoxirribonucleico (ADN)
El ADN tiene como papel principal el
almacenamiento de la información genética
de cada ser vivo.
Desde el punto de vista químico, el ADN está
formado por nucleótidos, y cada nucleótido,
a su vez, está formado por un azúcar (la
desoxirribosa), una base nitrogenada (que
puede
ser
adenina→A,
timina→T,
citosina→C o guanina→G) y un grupo
fosfato que actúa como puente de cada
nucleótido.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble
cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas
entre sí por unas conexiones denominadas puentes de
hidrógeno.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
•Replicación del ADN
Es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (sintetizar
una copia idéntica). De esta manera, de una molécula de ADN
única, se obtienen dos o más "clones" de la primera. Esta
duplicación del material genético se produce de acuerdo con
un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos
cadenas complementarias del ADN original, al separarse,
sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva
cadena complementaria de la cadena molde, de forma que
cada nueva doble hélice contiene una de las cadenas del
ADN original.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Gracias a la complementación entre las bases que forman la
secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la
importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que
permite que la información genética se transmita de una
célula madre a las células hijas y es la base de la herencia del
material genético.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
•Propiedades y función de las ADN polimerasas
Son enzimas que intervienen en el proceso de replicación del ADN.
Llevan a cabo la síntesis de la nueva cadena de ADN emparejando
los
desoxirribonucleótidos
trifosfato
(dNTP)
con
los
desoxirribonucleótidos complementarios correspondientes del ADN
molde. El crecimiento de la cadena se produce en dirección 5' →
3‘.
Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el
proceso de replicación. Además de participar en la elongación,
desempeñan una función correctora y reparadora. Es importante
que existan estos mecanismos de corrección ya que de lo contrario
los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a
mutaciones.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
•DIFERENCIACIÓN VARIETAL EN VID
Existen diversos métodos para diferenciar
variedades de vid. El primero en utilizarse, para la
identificación de cultivares de vid fue la
ampelografía, basada en la descripción de
elementos morfológicos de la planta, tales como
brote, baya, racimo, y fundamentalmente, hoja. La
ventaja que tiene esta técnica es su rapidez, siendo
su limitante la influencia que pueden ejercer
factores externos (eventos climáticos, plagas,
enfermedades) sobre estos marcadores alterando
su morfología normal, y su falta de precisión en
casos de individuos genéticamente similares.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Otro método es el basado en
el uso de marcadores
bioquímicos (proteínas por
ej.), pero presentan el
inconveniente
de
ser
afectados también por el
ambiente y disponer de
escasa cantidad de sistemas
isoenzimáticos capaces de
diferenciar la gran cantidad
de variedades de vid que
existen.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Las técnicas de Biología Molecular utilizan
marcadores
moleculares,
los
cuales
detectan polimorfismo a nivel del ADN,
permitiendo la identificación varietal en
forma precisa. Tienen además la ventaja de
no ser afectados por el ambiente, siendo
entonces la mejor alternativa para
diferenciar
variedades
genéticamente
similares. Los microsatélites (SSR) son los
marcadores moleculares más comunes en
plantas y por lo tanto los más utilizados
para identificar variedades de vid.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
•Características de los microsatélites
Los microsatélites son secuencias de ADN en las que un
fragmento (cuyo tamaño va desde dos hasta seis pares de
bases) se repite de manera consecutiva. Partiendo de esta
hipótesis se diseñan primers o iniciadores (fragmentos de
ADN que tienen la misma secuencia que los extremos de los
microsatélites) para producir un alto número de copias de un
microsatélite a través de una PCR (Reacción en Cadena de la
Polimerasa).
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
•ENFERMEDADES VIRALES DE LA VID
La vid (Vitis vinifera L.) es una de las especies más
cultivada en el mundo y al mismo tiempo hospedante de
numerosos patógenos, entre los que destacan los virus,
cuya peligrosidad es acentuada por la existencia de
eficientes métodos de transmisión, principalmente
vectores tales como nemátodos e insectos. Sin
embargo, la principal causa de la diseminación a
grandes distancias de los virus se debe a la
propagación y comercialización de variedades y
portainjertos infectados.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Actualmente ha sido posible identificar a más de 60 virus que
infectan a la vid, aunque solo algunas especies son
importantes por el daño económico que generan, tanto por su
intrínseca agresividad como por su amplia diseminación en los
viñedos.
Se han diseñado primers específicos que reconocen alguna
secuencia en particular del genoma de los virus mas
importantes que infectan vid para poder ser analizados con
RT-PCR tradicional y RT-PCR en tiempo real.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Los virus que se encuentran con mayor frecuencia en los
viñedos del mundo son GLRaV-1, GLRaV-2 y GLRaV-3
(leafroll). Los síntomas en las hojas consisten en un
enrrollamiento de la hoja, con leve amarillez de la lámina foliar
en variedades de uva blanca y enrojecimiento en la de uva
tinta, en la cual normalmente la modificación del color no
incluye a las nervaduras. Este síntoma comienza a aparecer al
final del verano y tiende a acentuarse en otoño. También hay
corrimiento de racimos, sobre todo en los más pequeños, con
bajo contenido en azúcares y mayor acidez. En variedades
tintas es muy frecuente la decoloración parcial o total de las
bayas al acercarse el periodo de cosecha.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Los métodos que se utilizan para la detección
de los virus de vid pueden ser:
Test biológicos (basado en la propiedad de
que esta enfermedad es trasmisible mediante
injertos).
Test serológicos (ELISA).
Test moleculares.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Identificación varietal en vid por técnicas de
Biología Molecular
1. Extracción del ADN
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
2. PCR
La propiedad de las enzimas ADN
polimerasas para replicar hebras de
ADN se utiliza para la reacción en
cadena de la polimerasa, conocida
como PCR, para obtener un gran
número de copias de un fragmento
de ADN particular, amplificándolo
para propósitos de investigación.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
En los procesos de PCR se
requiere la utilización de enzimas
polimerasas termoestables, como
la polimerasa Taq, debido a que
es
necesario
aplicar
altas
temperaturas para desnaturalizar
la molécula de ADN.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
3. Análisis de las amplificaciones
Separación de fragmentos de ADN por electroforesis
La molécula de ADN tiene carga eléctrica, los fosfatos
proveen una carga neta negativa al ADN y esta carga es
homogénea a lo largo de toda la molécula.
En un campo eléctrico, el ADN migra hacia el polo positivo.
Si la migración se realiza en un medio semi-sólido (por
ejemplo agar, una especie de gel) ésta se dificulta, dado que
el ADN debe pasar a través de poros en el gel.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Como consecuencia de la necesidad de atravesar estos
poros, las moléculas de ADN más grandes verán retrasada
su movilidad, mientras que las más pequeñas migrarán una
mayor distancia en el mismo tiempo.
En un mismo “gel” es posible evaluar distintas mezclas de
fragmentos (muestras).
El ADN no es visible a simple vista, por lo que utilizando
colorantes como el bromuro de etidio (se intercala entre las
bases del ADN), es posible lograr que el ADN emita
fluorescencia cuando es iluminado con luz ultravioleta.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Sistema de electroforesis con microchip y capilar
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
PROYECTO DE TRABAJO
Poner a punto las distintas técnicas.
Realizar un banco de datos a partir de distintas
variedades de plantas de vitis vinífera de origen
indudable.
Analizar a lo largo de un año las distintas partes de
la planta, para determinar cuales son las más
adecuadas para realizar la extracción del ADN.
Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por
técnicas de Biología Molecular
Complementar a las técnicas ya realizadas por el
INV (Identificación varietal en vid por ampelografía y
caracterización varietal).
Desarrollar los métodos para determinar las
enfermedades más comunes en vid por técnicas de
biología molecular.
MUCHAS GRACIAS
Subgerencia de
Investigación para la
Fiscalización