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Tema 19. Estrategias de control de actividad enzimática
1. Regulación de la cantidad de enzima
2.1. Enzimas constitutivas y enzimas inducibles
2.2. Estudio cinético del recambio enzimatico
2. Regulación de la actividad enzimática:
2.1.Modificaciones covalentes
2.1.1. Modificaciones covalentes irreversibles
2.1.2. Modificaciones covalentes reversibles
Introducción
* En este tema consideraremos otra de las características
peculiares de las enzimas: la capacidad de regular su actividad,
es decir, la propiedad de regulación de la actividad enzimática
según convenga, especialmente “in vivo”.
1) Regulando la cantidad de enzima
2) Regulando la actividad de las enzimas
presentes
1. Regulando la cantidad de enzima.
Velocidad o la actividad es función de la cantidad
Cantidad
Balance de síntesis y degradación
Vida media Ornitina descarboxilasa 15-20 minutos
Lactato deshidrogenasa 150 horas
Este procedimiento se conoce como: Regulación a largo plazo
Gran gasto energético 3 ATP por aminoácido
Ventajas:
1. Adaptación cambios en el metabolismo celular debido a señales
químicas (hormonas, segundos mensajeros, nutrientes, etc),
físicas (energía radiante, temperatura).
2. Supresión de proteínas mutadas (mamiferos superiores, el
número diario de errores o mutaciones en la síntesis de
proteínas del orden del millón).
1.1. Enzimas constitutivas y enzimas inducibles
Desde el punto de vista de adaptación, se pueden considerar dos tipos de enzimas
Enzimas constitutivas (house keeping enzymes)
Mismo nivel Procesos de síntesis y degradación ajustados y compensados
Cantidad de proteína y mRNA permanecen inalterados
No suelen presidir pasos reguladores de vías metabólicas
Enzimas inducibles
Niveles según las diferentes circunstancias metabólicas
Inducción de la cantidad debido a estimulos
Enzimas controladoras de vías metabólicas
Estímulo :
Variar la velocidad de síntesis
(inducción o represión síntesis proteica)
Variar el proceso de degradación
Cambio cantidad total de la proteína enzimática
Actividad
Estudiar la cinética de recambio
1.2. Estudio cinético del recambio enzimático
Procesos de síntesis siguen cinética de orden 0
(independiente de la cantidad de enzima)
ks constante fenomenológica del proceso total de síntesis (M t-1)
Procesos de degradación siguen cinética de orden 1
(depende de la cantidad de enzima)
kD constante de degradación (t-1)
d E 
0
dt
Estado estacionario elemental
d E 
 ks  kD  E 
dt
ks  kDE 
Nuevo estado estacionario
ESTIMULO
d E 
 k´s  k´D  E 
dt
Cambios en las
constantes
Separando variables
Integrando la ecuación entre [Eo] y [Et] y entre 0 y t
d E 
 dt
 
k´s  k´D  E 
[Eo] enzima antes del estímulo
[Et] enzima después del estímulo en el nuevo
estado estacionario al cabo del tiempo t
t
d E 
Eo k´s  k´D  E   0 dt
Resolución de la integral, aplicando los
límites de integración
Et
k´s  k´D  Eo
k´s  k´D  Et 
Después del estímulo la Ks tiende a cero y la
ecuación queda como
Vida media de
una proteína


0,5 Eo


Et 
 e k ´D t


Eo


Et


e
k ´D t
 e k ´D t1 / 2
Ln 2
t1 / 2 
k ´D
La vida media es función de la
constante de degradación
Proteínas enzimáticas que responden rápidamente a un estímulo
externo son proteínas fácilmente degradadas
Ornitina descarboxilasa
0,3-0,5 horas
Actividad
enzimática
Triptofano dioxigenasa
2,5 horas
Piruvato quinasa
84 horas
5
Tiempo (horas)
Cambio en las actividades enzimáticas inducidas por un estímulo . A la
5 horas cesa el estímulo y comienza la degradación.
Cuanto menor es el tiempo de vida media el nuevo estado estacionaro
se alcanza más rapidamente.
Medida experimental de la velocidad de síntesis
Incorporación de aminoacidos marcados
Separación selectiva de la proteína
(Inmunoprecipitación selectiva)
2. Regulando la actividad de las enzimas: Regulación a corto
plazo.
* Este sistema de regulación permite dar respuestas mucho
más rápidas, prácticamente inmediatas, a los cambios
experimentados por la célula, y básicamente responde a algunos
de los siguientes mecanismos:
- Mecanismos varios:
 inhibidores/activadores,
variaciones de: pH, temperatura, ...,
disponibilidad de cofactores,
reacciones catalíticas no-enzimáticas,
etc.
- Mecanismos que implican cambios covalentes:
Regulación por modificación covalente.
* Entre las modificaciones covalentes cabe distinguir dos grandes
grupos:
* Irreversible
* Reversible
Frecuencia BAJA
Frecuencia ALTA
Extracelular
Intracelular
- Mecanismos que implican cambios conformacionales:
 Regulación alostérica.
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2.1 MODIFICACIÓN COVALENTE
2.1.1. Modificación Covalente Irreversible.
- Dentro del grupo de las modificaciones covalentes irreversibles,
destaca por su importancia, las modificaciones por Proteolisis
Parcial.
En la siguiente Tabla se muestran algunas enzimas que se
activan por proteolisis parcial
ENZIMA
- Tripsina
- Quimotripsina
- Elastasa
- Carboxipeptidasa
- Fosfolipasa A2*
- Pepsina
PRECURSOR
Tripsinógeno
Quimotripsinógeno
Proelastasa
Procarboxipeptidasa
Fosfolipasa A2
Pepsinógeno
-Trombina
Protrombina
Secreción pancreática
Secreción pancreática
Secreción pancreática
Secreción pancreática
Secreción pancreática
Secreción gástrica (jugo
gástrico), actividad óptima pH
1-5
Parte del sistema de
coagulación sangíneo
- Clr
Clr
Parte del primer componente
del sistema del complemento
- Quitina sintasa**
Zimógeno
Implicada en la formación del
septum durante la división
cellular en las levaduras
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------* Dijkstra et al (1981) Nature 289, 604 ** Cabib (1976) Trends Biochem Sci. 1, 275
•Veamos este tipo de regulación para el caso particular de las
proteasas pancreáticas:
- tripsina,
- quimotripsina,
- elastasa y
- carboxipeptidasa.
* Todas ellas se sintetizan en el páncreas, y se segregan a través
del conducto pancreático al duodeno del intestino delgado, en
respuesta a una señal hormonal generada cuando el alimento
sale del estómago.
* Sin embargo, estas proteasas no se sintetizan en su forma
activa. Sino que se sintetizan en forma de moléculas ligeramente
más grandes, catalíticamente inactivas, denominadas zimógenos
o proproteasas: tripsinógeno, quimotripsinógeno,
proelastasa y procarboxipeptidasa.
* Los zimógenos tras un proceso de proteolisis parcial, en el duodeno, se
transforman en las correspondientes enzimas activas. Estas enzimas tras
cumplir sus fines, se degradan completamente, por lo que no ponen en
peligro el tejido intestinal.
* La transformación de los zimógenos o proproteasas en
proteasas activas la podemos representar esquemáticamente de
la siguiente manera:
Tripsinógeno
Enteopeptidasa
Enteropeptidasa
Quimotripsinógeno
Tripsina
Proelastasa
Elastasa
Procarboxipeptidasa
Carboxipeptidasa
-Quimotripsina
-Quimotripsina
* El primer paso es la activación de la tripsina en el duodeno.
* Se elimina un hexapéptido del extremo N-terminal del
tripsinógeno gracias a la enteropeptidasa, proteasa secretada
por las células duodenales.
* Esta acción produce la tripsina activa, que a su vez activa los
demás zimógenos y proenzimas, mediante rupturas proteolíticas
específicas.
* La tripsina una vez formada actúa de manera autocatalítica,
activando más moléculas de tripsinógeno, además de activar los
demás zimógenos y proenzimas.
* La activación del quimotripsinógeno a quimotripsina es uno
de los ejemplos más complejos y mejor estudiados de la
activación por proteolisis parcial.
* En el primer paso la tripsina rompe el enlace entre la Arg15 y la
Ile16. El péptido N-terminal continua unido al resto de la molécula
a través de un punte -S-S- entre los residuos 1 y 122. El
producto resultante se denomina -quimotripsina, que ya es
una forma activa.
* La -quimotripsina no es aun la forma “terminada” o final de la
quimotripsina (-quimotripsina), para ello es necesario que se
produzcan una serie de rupturas autocatalíticas, catalizadas por
la -quimotripsina:
- Eliminación de los residuos 14 y 15, y cortando entre el
145 y 146.
* De esta manera se forma la -quimotripsina, que es la forma
activa de la enzima que se encuentra en el tracto digestivo.
* Esta batería de enzimas: tripsina, quimotripsina, elastasa y
carboxipeptidasa, junto con la pepsina del estómago, y otras
proteasas secretadas por las células de la pared intestinal, es
capaz de digerir finalmente la mayor parte de las proteínas
ingeridas en la dieta a aminoácidos libres, dipéptidos y
tripéptidos, que son absorbidos por el epitelio intestinal.
NOTA:
* Incluso los zimógenos inactivos son una posible fuente de
peligro para el páncreas.
* Dado que la activación de la tripsina puede ser autocatalítica, la
presencia de una sola molécula activa de tripsina podría poner
en marcha toda la cadena de manera prematura.
* En consecuencia el páncreas se protege a sí mismo mediante la
síntesis de una proteína denominada Inhibidor de la Tripsina
Pancreática Secretora (para distinguirlo del Inhibidor de la
Tripisina Pancreática que es una proteína intracelular que se
encuentra únicamente en los rumiantes). Este inhibidor
competitivo se une de manera tan intensa al centro activo de la
tripsina que la inactiva de manera efectiva incluso a
concentraciones muy bajas.
* Sin embargo la activación del pepsinógeno es un proceso
mucho más simple:
- El pepsinógeno es una proteína de masa molecular 40 kDa que
se autohidroliza al bajar el pH, eliminándose un un péptido de
naturaleza básica de 44 AAs del extremo N-terminal.
* La digestión ocurre espontáneamente a pH ácido y en ella
intervienen de manera activa determinados restos de Asp.
* Ahora bien, también hay procesos de activación por proteolisis
limitada o parcial mucho más complejos, como por ejemplo los
implicados en la coagulación sanguínea o en la fibrinolísis.
* Así pues, en los casos en que unas proteasas activan a otras
y/o se autoactivan lo que tiene lugar es una activación en
cascada, consiguiéndose una respuesta rápida y amplificada.
*2.1.2.Modificación covalente reversible
* Actualmente sabemos que un elevado número de enzimas
existen en dos formas (con propiedades catalíticas diferentes),
que se pueden interconvertir una en otra gracias a la acción de
otras enzimas.
* Estas enzimas sufren un cambio en la actividad debido a la
modificación covalente de algunos restos aminoacídicos de la
cadena polipeptídica.
- Las principales modificaciones covalentes que conducen a una
modificación de la actividad enzimática (activa <--> inactiva) son:
* Fosforilación <==> Desfosforilación
* Acetilación <==> Desacetilación
* Adenilación <==> Desadenilación
* Uridilación <==> Desurilación
* ADP-ribosilación
- El paso de una forma a otra, generalmente, tiene lugar gracias a una enzima
convertidora (Ec), siendo el sustrato la enzima interconvertible (Eic)
La nomenclatura aceptada, es llamar
a) a la forma activa de la enzima interconvertible y
b) a la forma inactiva:
Proteina
quinasa
ATP
a)
E-OH
ADP
E-O-P
P
Proteina
fosfatasa
H2O
b)
Ventajas de este sistema de regulación
a) Un pequeño consumo energético
b) Cambios en la enzima activa del
todo/nada
c) Permite la amplificación de una señal,
pueden depender en su actividad de
señales (segundos mensajeros)
intracelulares
d) Sistemas de enzimas
interconvertibles en cascadas
permite la amplificación de señal
más extensa
Rápido cambio en la cantidad de enzima
- Un ejemplo clásico es el de la glucógeno fosforilasa que
cataliza la siguiente reacción:
Glucógeno Fosforilasa
(Glucógeno)n + Pi == (Glucógeno)n-1 + D-Glucosa-1-P
•En una serie de reacciones conocidas como cascada
reguladora, la señal hormonal que se produce por contacto,
en la superficie celular, con el correspondiente receptor, se
amplifica para convertir muchas moléculas de Fosforilasa-b en
Fosforilasa-a.
•Los iones Ca2+, que se liberan en las células musculares
cuando se estimulan para que se contraigan, potencian este
proceso.
* Así pues, el músculo puede responder rápidamentePhosphorylation
cuando
necesita una cantidad de energía adicional. inactivates
Phosphorylation
activates
Phosphorylation
inactivates
Phosphorylation
activates
Ahora bien, la fosforilación no necesarimente implica activación.
From Meisenberg & Simmons, Fig. 17.16.
* La fosforilación-desfosforilación reversible tiene lugar sobre
restos aminoacídicos de: Ser, Thr o Tyr.
Gamma
phosphoryl
group
Las enzimas que catalizan la fosforilación se denominan:
- proteina quinasas, o quinasas, y
las que catalizan la desfosforilación.
- proteina fosfatasas o fosfatasas.
* La importancia de las proteina quinasas en la regulación de los
procesos celulares viene reflejada por el gran número de genes
presentes en los genomas eucariotas que codifican por este tipo
de enzima.
* En el hombre se calcula que hay unos 2000 genes que
codifican por proteina quinasas y unos 1000 genes que codifican
por proteina fosfatasas.
* Las proteinas quinasas actúan sobre un gran número de
proteínas diferentes (sustrato), por lo que sería inadecuado
clasificarlas de acuerdo con la siguiente reacción general:
Proteína + ATP = Fosfo-Proteína + ADP
* Inicialmente las podemos clasificar de acuerdo con el tipo de
resto aminoacídico sobre el que tiene lugar la fosforilación:
i) Ser/Thr
ii) Tyr
- Si bien también hay algunas protein quinasas que fosforilan
restos de His, Lys, Arg, Gln, o Asp.
* Mientras las fosforilaciónes sobre Ser/Thr están asociadas,
generalmente, a procesos de regulación metabólica, la
fosforilación sobre Tyr lo está con procesos de crecimiento
celular y diferenciación.
* Otra subdivisión de las protein-quinasas es la que puede
hacerse en base a la naturaleza del regulador intracelular, ya que
muchas protein-quinasas, aunque no todas, están controladas por
un sistema de transducción de señales.
* En la siguiente Tabla se muestra de manera resumida la
clasificación de las proteín-quinasas:
Resto aminoacídico
aceptor
PK cAMP-dependientes Ser/Thr
PK cGMP-dependientes Ser/Thr
Protein quinasa C
Ser/Thr
PK Ca 2+/calmodulina
Ser/Thr
Kinasa ciclinSer/Thr
dependiente
Mitogen activated
Ser/Thr
protein kinase
(MAP kinase)
Receptor tyrosin
Tyr
kinases
Cytosolic tyrosin
Tyr
kinases
Familia
Regulador
cAMP
cGMP
Diacilglicerol, Ca 2+
Ca2+
Ciclinas
Factores de crecimiento
Citoquinas
Feromonas
Factores de crecimiento
Citoquinas
Ultrasensibilidad de orden cero
Amplificación de la señal Ec (enzimas convertidoras)
[Ec] <<<<[substrato] la
Enzima interconvertible
a)
Siempre en saturación
Eca
ATP
Eci(a)
ADP
Eci(b)
P
Orden cero
Ecb
H2O
b)
ORDEN 1
1
ORDEN O
Eb/Eo
0
1
Eb/Eo
0
v`a
v
v`a
vb
va
vb
va
EE2
0
Ea/Eo
EE1
EE2
1,0
0
EE1
Ea/Eo
1,0
Las enzimas modificadoras o convertidoras deben estar a muy pequeña
concentración en comparación con las enzimas interconvertibles
Gran dificultad en el aislamiento y purificación de enzimas convertidoras
Resumen
Todas las enzimas están sujetas a un continuo recambio. La cantidad actual de una proteína es el
resultado de un proceso de síntesis y un proceso de degradación que actuan de forma simulánea.
El recambio enzimático tiene las siguientes ventajas: a) la eliminación de proteínas defectuosas;
b) la adaptación a nuevas situaciones metabólicas
Las enzimas pueden ser constituivas (sus niveles estacionarios permanecen constantes)
o inducibles (sus niveles varian de acuerdo a estímulos).
El proceso de síntesis, desde el punto de vista cinético es un proceso de orden cero, no
depende de la cantidad de proteína; la degradación, en cambio, es un proceso de orden uno
y, generalmente, más rápido que el proceso de síntesis.
El tiempo de vida media suele depender de la constante de degradación.
La regulación por modificación covalente puede ser irrevesible y reversible.
Irreversible es una proteolisis específica y controlada la sufren proteínas denominadas
zimógenos convirtiéndose en una proteína activa.
Estrategia de regulación más difundida es la modificación reversible en la estructura
covalente de la enzima. Los cambios más comunes son fosforilación-desfosorilación,
mediante la acción de enzimas convertidoras: proteínas quinasas y proteínas fosfatasas.
La forma activa puede ser bien la forma fosforilada o la forma desfosforilada. Para que pueda
darse un cambio notable de amplificación de la señal las enzimas convertidoras deben trabajar
en orden cero de reacción, lo que supone que la concentración de las enzimas convertidoras
es mucho menor que las enzimas interconvertible, sus substratos.