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Tema-14. Las enzimas en el interior celular
1.- Velocidad total para el modelo
S
P
2.- Resolución de la ecuación de velocidad en el estado
estacionario
3.-Resolución gráfica de ecuaciones cinéticas:
Método de King y Altman
4. Análisis de la ecuación
1. Velocidad total
* Hasta ahora hemos considerado cinéticas sencillas, in vitro,
descritas por el modelo:
E
S <===> P
Modelo que cumple la condiciones de partida de M&M:
Las reacciones se han estudiado en condiciones de
velocidades iniciales, que son velocidades unidireccionales
extrapoladas a tiempo cero.
La velocidad total, vt, no es la suma algebraica de dos
velocidades iniciales.
* Por otro lado, en el interior de la célula, es decir, in vivo, el
producto de reacción, P, siempre está presente, por lo que no
es posible extrapolar el comportamiento de la enzima en la
célula a las condiciones de velocidades iniciales de las
condiciones in vitro.
* Para intentar acercarnos a las condiciones de in vivo,
intentaremos estudiar la velocidad de reacción total, vt,
S <===> P
Para el que, en este caso, si se cumple:
vt = v1 - v2
Donde:
v1 es la velocidad actual de la reacción S --> P
v2 es la velocidad actual de la reacción P --> S
* Teniendo en cuenta los distintos complejos que se pueden
formar, podemos escribir el modelo, de una manera más realista,
de la siguiente manera:
k1
E+S
k3
ES
k2
k5
EP
k4
Para este modelo se cumplirá:
[Eo] = [E] + [ES] + [EP]
E+P
k6
dS dP
vt  

dt
dt
dS
vt  
 k1 E S   k 2 ES 
dt
dP
vt 
 k5 EP  k6 E P 
dt
vt = k1[E ][S] - k2[ES] = k5[EP] - k6[E][P]
Calculo vt necesitamos conocer las concentraciones siguientes:
[E] y [ES] o [E] y [EP]
Plantear las correspondientes ecuaciones diferenciales y
resolverlas asumiendo una situación de estado estacionario:
d E 
0
dt
d ES 
0
dt
d EP
0
dt
E0   E   ES   EP
[So] >>>[Eo]
[ES] despreciable frente a [S]
2.- Resolución de la ecuación de velocidad en el estado
estacionario
Cálculo del valor de las concentraciones de las diferentes formas de las
Enzimas en el estado estacionario. Plantea un sistema de ecuaciones
Empezamos por la enzima libre
k1
k3
k5
E + S <===> ES <===> EP <===> E + P
k2
k4
k6
d E 
 0  v formación  vconsumo
dt
d E 
 0  (k1S  k6 P)E   k 2 ES   k5 EP
dt
k1
k3
k5
E + S <===> ES <===> EP <===> E + P [ES]
k2
k4
k6
d ES 
 0  v formación  vconsumo
dt
d ES 
 0  k1S E   (k 2  k3 )ES   k 4 EP
dt
k1
k3
k5
E + S <===> ES <===> EP <===> E + P
k2
k4
k6
d EP
 0  v formación  vconsumo
dt
d EP
 0  k6 PE   k3 ES   (k 4  k5 )EP
dt
[EP]
d E 
 0  ( k1S  k 6 P )E   k 2 ES   k5 EP
dt
d ES 
 0  k1S E   ( k 2  k3 )ES   k 4 EP
dt
d EP
 0  k 6 PE   k3 ES   ( k 4  k5 )EP
dt
E0   E   ES   EP
Tenemos un sistema de 4 ecuaciones y tres incógnitas (E, ES, y
EP), que de acuerdo con el Teorema de Rouché tendrá solución si
una de las ecuaciones es combinación lineal de otras dos.
i) [Eo] =
[E] +
ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] [E] +
iii) 0 =
iv) 0 =
[ES] +
k2 [ES] +
[EP]
k5 [EP]
k1(S) [E] - (k2+k3) (ES) +
k4 (EP)
k6(P) [E] +
k3 [ES] - (k4+ k5) [EP]
-1[ii) + iii)] = iv)
ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] (E) +
k2 (ES) +
iii) 0 =
k1(S) (E) - (k2+k3) (ES) +
k5 (EP)
k4 (EP)
0 = - k1(S)(E) – k6(P)(E) + k1(S)(E) + k2(ES) – k2(ES) –k3(ES) + k5(EP) + k4(EP)
0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + k5(EP) + k4(EP)
0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + (k4+ k5)(EP)
Si multiplicamos por -1
0 = k6(P)(E) + k3(ES) - (k4+ k5)(EP)
Que es exactamente igual que la ec:
iv) 0 =
k6(P) (E) +
k3 (ES) - (k4+ k5) (EP)
Luego el sistema tiene solución
Por lo tanto, para calcular la velocidad total
vt,
vt = k1[E][S] - k2[ES]
Sólo necesitamos calcular [E] y [ES]
* Aplicando la regla de Cramer al sistema formado por las tres
primeras ecuaciones:
i) (Eo) =
1(E) +
ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] (E) +
iii) 0 =
1(ES) +
k2 (ES) +
1(EP)
k5 (EP)
k1(S) (E) - (k2+k3) (ES) +
k4 (EP)
Y teniendo en cuenta que la matriz de coeficientes, , viene
dada por:
1
=
-[k1(S) + k6(P)]
k1(S)
1
1
k2
k5
- (k2+k3)
k4
El cálculo de [E] y de [ES] lo podemos realizar de la siguiente
manera:
Eo
1
1
1
0
k2
k5
0
-(k2+k3)
k4
[E]=
Eo
1
-(k1(S) + k6(P)
0
k5
K1(S)
0
k4
[ES]=
1
1
-[k1(S) + k6(P)]
k1(S)
k2
- (k2+k3)
1
k5
k4
1
1
-[k1(S) + k6(P)]
k1(S)
Resolución de un determinante de orden 3
1
k2
k5
- (k2+k3)
k4
Las concentraciones en estado estacionario serán
( k 2 k 4  k 2 k 5  k 3 k 5)
E   Eo
(k 2 k 4  k 2 k 5  k 3k 5)  (k 1k 3  k 1k 4  k 1k 5) S  (k 2 k 6  k 3k 6  k 4 k 6) P
ES   Eo
(k 1k 4 S  k 4 k 6 P  k 1k 5 S )
(k 2 k 4  k 2 k 5  k 3k 5)  (k 1k 3  k 1k 4  k 1k 5) S  (k 2 k 6  k 3k 6  k 4 k 6) P
( k 2 k 4  k 2 k 5  k 3 k 5)
(k 2 k 4  k 2 k 5  k 3k 5)  (k 1k 3  k 1k 4  k 1k 5) S  (k 2 k 6  k 3k 6  k 4 k 6) P
(k 1k 4 S  k 4 k 6 P  k 1k 5 S )
ES   Eo
(k 2 k 4  k 2 k 5  k 3k 5)  (k 1k 3  k 1k 4  k 1k 5) S  (k 2 k 6  k 3k 6  k 4 k 6) P
E   Eo
Llevando a la ecuación de velocidad total
vt = k1[E][S] - k2[ES]
Reorganizando algebraicamente
(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P]
vt = Eo -----------------------------------------------------------------------------(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P]
* Esta es la ecuación de velocidad total obtenida en función de
las constantes microscópicas de velocidad
(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P]
vt = Eo -----------------------------------------------------------------------------(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P]
Es una ecuación de manejo complicado
No es fácil obtener las Constantes cinéticas
Solución transformación según el tratamiento
de Michelis-Menten
Obtención de constantes cinéticas
michaelentianas
Transformación función de las constantes cinética
características de la enzima
KmS, KmP, VmaxS y VmaxP
(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P]
vt = Eo -----------------------------------------------------------------------------(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P]
Numerador 1
num1= (k1k3k5)
Numerador 2
num2= (k2k4k6)
Constante
Cte = (k2k4+k2k5+k3k5)
Coeficiente de Substrato
coefs= (k1k3+k1k4+k1k5)
Coeficiente de Producto
coefp= (k2k6+k3k6+k4k6)
Substituimos
num1[S] – num2 [P]
vt = Eo ----------------------------------------------------cte + Coefs [S] + Coefp [P]
cte
Coef S Coef P
Multiplicando y dividiendo numerador y
denominador por
Cte  num1
Cte  num2
S  
P
Coef S Coef P
Coef S Coef P
vt  E0
CteCoefS
CteCte
CteCoefP
S  
P

Coef S Coef P Coef S Coef P
Coef S Coef P
Teniendo en cuenta las defiiniciones de las constantes cinéticas de Michaelis para
el Substrato y Producto KmS y KmP y las velocidades máximas VmS y VmP
Los valores se deducen en velocidades iniciales por lo tanto [P] = 0
K6 y k4 son iguales a 0
VmS
num1
 Eo
Coef S
VmS
k1k3k5
num1
 Eo
 Eo
 Eok3  VmS
Coef S
k1 (k3  k5 )
Coefp es cero
k3 es el paso limitante de la reacción global (despreciable como sumando
frente a k5)
VmP
num2
 Eo
Coef P
Se deduce lo mismo para el lado contrario
P
S
k 2 k 4  k 2 k5  k3 k5 k5 ( k 2  k3 )
k 2  k3
Cte
KmS 



 Kms
Coef S k1k3  k1k 4  k1k5 k1 (k3  k5 )
k1
k4 =0 y k3<<<k5
Cte
KmP 
Coef P
Esta es la ecuación de velocidad total
obtenida en función de las constantes de
velocidad de Michaelis-Mentem (Vm y Km)
y de la concentración de S y de P.
VmS KmP[S] – VmP KmS[P]
vt = ---------------------------------------------KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
3.- Resolución gráfica de ecuaciones cinéticas:
Método de King y Altman
Método esquemático para la resolución de ecuaciones con mecanismo cinético
complejo
El método gráfico, de K&A, consiste en la construcción, en primer lugar, de un
polígono de tantos vértices como especies químicas puede presentar la enzima.
Para el sistema más simple:
E + S <==> ES <==> EP <==> E + P
En el estado estacionario la
concentración total del enzima
será igual a la suma de todas las
especies químicas de esta
Eo  EXi
E
ES
EP
Se utiliza para todos los sistemas: Con más de un Substrato y Producto
E
EP
ES
E
k2
ES
P k6
k5
S k1
k3
k4
EP
* A continuación se construyen tantos polígonos abiertos como
lados tiene el polígono, dejando un lado abierto en cada uno de
ellos.
E
k2
ES
S k1
k3
k4
E
k2
EP
ES
E
k5
ES
k3
k4
P k6
EP
S k1
k5
P k6
EP
* Por otro lado, se cumple que la razón entre una determinada
especie química [EXi] y la concentración total de enzima [Eo],
[Exi]/[Eo], es igual a la suma de los términos que afectan a la
especie, partido por la suma de todos los términos que afectan a
todas las especies.
 de los términos que afectan a la especie EXi
[EXi]/[Eo] = ---------------------------------------------------------------------- de los términos que afectan a todas las especies químicas
¿Cómo calculamos el numerador y el denominador?
* Los términos que afectan a una especie se calculan en
cada polígono abierto recorriendo el camino para llegar a la
especie , multiplicando las constantes de velocidad y las
concentraciones de S y P, si hubiera lugar.
E
k2
ES
E
S k1
k3
k4
k2
EP
S k1
k5
P k6
ES
E
k5
ES
[E]
k3
k4
P k6
EP
(k2k4) + (k2k5) + k3k5)
EP
E
k2
ES
S k1
k3
k4
E
k2
EP
S k1
k5
P k6
ES
E
k5
ES
[ES]
k3
k4
P k6
EP
(k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P)
EP
E
k2
ES
E
S k1
k3
k4
k2
EP
ES
S k1
k5
P k6
EP
E
k5
ES
[EP]
k3
k4
P k6
EP
(k1k3S) + (k2k6P) + (k3k6P)
FORMAS DE LA
ENZIMA
TÉRMINOS
[E]
(k2k4)
(k2k5)
(k3k5)
[ES]
(k1k4S) (k1k5S) (k4k6P)
[EP]
(k1k3S) (k2k6P) (k3k6P)
EXi 
 EXi
Eo  E   ES   EP
Así pues,
(k2k4 + k2k5 +k3k5)
[E] = [Eo] --------------------------------------------------------------------------(k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)
(k1k4S + k1k5S + k4k6P)
[ES] = [Eo] -------------------------------------------------------------------------
(k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)
(k1k3S + k2k6P + k3k6P)
[EP] = [Eo] ------------------------------------------------------------------------(k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)
- Como vt viene dado por:
vt = k1[E][S] - k2[ES]
- Sustituyendo los valores de [E] y [ES] tendremos:
(k2k4 + k2k5 +k3k5)
(k1k4S + k1k5S + k4k6P)
vt = k1[Eo] ------------------------ [S] - k2[Eo] ------------------------------
t
t
Donde:
t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)
y operando, obtenemos:
(k1k2k4S + k1k2k5S +k1k3k5S - k1k2k4S - k1k2k5S - k2k4k6P)
vt = [Eo] [----------------------------------------------------------------]
t
-Simplificando
(k1k3k5) (S)
(k2k4k6) (P)
vt = [Eo] [------------------ - -------------------]
t
t
- Si en t ordenamos las contantes y sacamos factor común,
podemos escribir:
t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + k1(k3k4k5) (S) + k6(k2k3k4) (P)
Cte.
CoefS
CoefP
Usando estas simplificaciones, e introduciendo otras, y
operando adecuadamente.
* Expresión de la ecuación de velocidad total en presencia de
PyS
VmS KmP[S] – VmP KmS[P]
vt = ---------------------------------------------KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
Misma ecuación que la obtenida en mediante la
resolución de sistemas de ecuaciones diferenciales
en el estado estacionario
4. Análisis de la ecuación:
VmS KmP[S] – VmP KmS[P]
vt = ----------------------------------------KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
1. En condiciones de velocidad inicial [P] = 0, la ecuación se
convierte en la ecuación de M-M
VmS KmP[S] – VmP KmS[P]
vt = ----------------------------------------KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
Vms S 
v
Kms  S 
Tarea. Si consideramos velocidades iniciales, qué forma tomará la
anterior ec. general para la reacción en sentido P --> S?
2. En condiciones de velocidad iniciales y unidireccionales
si [P] ≠ 0
La ecuación tiene el siguiente valor
Vms S 
v01 


P 
  S 
Kms 1 
 KmP 
Kcat dirección S es 0
Ecuación similar a la de la Inhibición competitiva.
El producto si está presente en velocidades iniciales
se comporta como un inhibidor competitivo
VmP = 0
3. Relación de Haldane
En condiciones de equilibrio químico, vt = 0, se deduce la
siguiente relación:
VmS KmP[S] – VmP KmS[P]
vt = ---------------------------------------------= 0
KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
VmS KmP[S]eq - VmP KmS[P]eq = 0
- Donde [S]eq y [P]eq son las concentraciones en el equilibrio.
[P]eq
VmS KmP
Keq = --------- = ----------------[S]eq
VmP KmS
Relación que recibe el nombre de Relación de Haldane.
- La relación de Haldane nos permite obtener la constante de
equilibrio, Keq, de la reacción a partir de las constantes
cinéticas .
Y por extensión, podemos, también calcular el valor de G’º de la
reacción a partir de las constantes cinéticas enzimáticas, ya que:
VmSKmP
G’º = -RT ln ------------VmPKmS
Las constantes cinéticas son fáciles de calcular
experimentalmente.
Resumen
• El análisis cinético de M-M está referido a velocidades iniciales
En el interior celular in vivo el producto de la reacción está siempre presente, habrá que
tener en cuenta la velocidad total no las velocidades iniciales
Velocidad total es la suma de las velocidades unidireccionales
Las ecuaciones referidas a las velocidades totales solamente se resuelven en el estado
estacionario: Variación de las concentraciones de las diferentes especies químicas en las que
se encuentre la enzima respecto al tiempo es cero
Resolución de las ecuaciones de velocidad total se realizada con diferente aproximaciones:
Estado estacionario,se obtiene una expresión de velocidad total en función de las
constantes cinéticas Vms, Vmp, Kms Kmp y de las concentraciones de P y S.
Resolución gráfica propuesta por King y Altman método sencillo permite la
resolución de planteamientos enzimáticos complejos
VmaxS KmP(S) - VmaxP KmS(P)
vt = ------------------------------------------------KmS KmP + KmP(S) + KmS(P)
Relación de Haldane, cuando la velocidad total es cero es decir en condiciones
de equilibrio relaciona la constante de equilibrio con las constantes cinéticas de la
enzima (estudiadas de acuerdo con las condiciones de M-M).