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CLONACION Clonación: problemas a superar - bajos porcentajes de desarrollo y gestación - anormalidades físicas. - alta mortalidad perinatal. Reprogramación insuficiente Clonación por transferencia de núcleos. Manipulación mecánica del embrión: enucleación del recipiente y transferencia del núcleo activación del recipiente. Interacciones entre el citoplasma recipiente y el núcleo transferido. reprogramación del núcleo transferido. Aplicaciones de la clonación. Diferenciación celular: Pérdida de genes Modulación expresión génica Spemann (1938): experimento de transferencia de núcleos Totipotencia del núcleo Experimento propuesto por Spemann Núcleo célula somática diferenciada (adulto) Citoplasma de un zigoto Desarrollo: núcleo totipotente No desarrollo: núcleo no totipotente Experimentos con anfibios Individuos adultos fértiles Briggs y King 1952 Blástula, gástrula Gurdon 1986 Mucosa intestino de renacuajo Renacuajos (no metamorfosis) Queratinocitos, músculo, eritrocitos de adulto No se consigue desarrollo de adulto a adulto Mejores resultados al utilizar oocitos como recipientes Experimentos en mamíferos: avances metodológicos Microinyección, traumático (Briggs y King 1952) Transferencia no traumática (McGrath y Solter 1983) Visualización de los cromosomas (Tsunoda 1988) Experimentos en mamíferos: a partir de 1983 Se consigue clonar individuos adultos a partir de células embrionarias de ratón, vaca, oveja, cerdo y conejo. Se consigue desarrollo a blastocito a partir de células diferenciadas de individuos adultos (timocitos, granulosa, fibroblastos). Imprinting. Mejores resultados al usar citoplasma de oocito Conclusión: No es posible clonar individuos adultos mediante transferencia de núcleos. Barrera biológica. Es un problema metodológico Condiciones para una clonación exitosa El núcleo debe contener toda la información presente en el zigoto Esta información debe ser accesible. Debe ser posible reprogramar el núcleo transferido. Evitar daños producidos por o a consecuencia de la transferencia de núcleos. Programa de desarrollo Diferenciación Adulto + gametos Muerte Reprogramación Diferenciación Adulto Transferencia de núcleos + Reprogramación Reprogramación Silenciar genes característicos de la célula de origen Activar genes característicos del citoplasma recipiente Mantener la capacidad de progresar, silenciando y activando genes, en el desarrollo a adulto fértil “ Rebobinar” el programa de diferenciación Barrera biológica: diferenciación celular irreversible Problema metodológico: factores que afectan a la supervivencia del embrión reconstruido I Tipo de recipiente utilizado Factores de reprogramación en el oocito II Fase del ciclo celular tanto del núcleo como del citoplasma Efecto de la fase del ciclo celular M G2 G1 S Efecto de la fase del ciclo celular 45% 0 0 Efecto de la fase del ciclo celular 60% 15% 12% Efecto de la fase del ciclo celular Núcleos en fase G1 tienen ventajas, son más reprogramables. ¿ Quizás debido a que están totalmente descondensados? ¿Está el DNA “desnudo” de factores de transcripción? ¿Es este DNA más accesible a los factores de reprogramación? Es complicado sincronizar células en cultivo en G1 Es más sencillo inducir quiescencia Aplicaciones de la clonación. - Investigación - Animales de granja transgénicos - Recombinación homóloga - Xenotransplantes Aplicaciones de la clonación. Investigación Transferencia de núcleos = herramienta de investigación Reprogramación Diferenciación - control de la diferenciación celular y el desarrollo - restauración de la totipotencia - factores citoplasmáticos - significado de la quiescencia - envejecimiento celular, telómeros Aplicaciones de la clonación: animales de granja transgénicos - Proteínas de interés farmacéutico - Nutracéuticos - Modelos de enfermedades - Xenotransplantes Polly (1997) factor IX humano (hemofilia B) Aplicaciones de la clonación: animales de granja transgénicos - Reduce el coste (tiempo y dinero) de producción - Posibilita la aplicación de recombinación homóloga Aplicaciones de la clonación: animales de granja transgénicos Posibilita la aplicación de recombinación homóloga Células en cultivo (fibroblastos) Clonación (TN) Recombinación homóloga Animales knock-out Funciona: Cupido y Diana (1999) Para terminar - Dolly, un hito científico - investigación de la reprogramación - facilita la manipulación genética de los animales de granja - xenotransplantes - clonación humana