Download enzximas peces pedro OCHOA

Agilent Technologies
DNA Fish ID Solution
Identificación de pescados–Impacto en el mercado
Legislación
 Métodos basados en
Proteinas o DNA
 Uso para análisis de
fraudes potenciales, mal
etiquetado o casos de
substitución
Sostenibilidad
Industria
Dirección de Cadena de
suministro
Consumidores
Valor del producto,
satisfacción del cliente
Métodos de identificación de pescados - Tradicional
• Requiere expertos para la
identificación
• Solamente aplicable a
pescado total
Morfologías
•
•
•
•
•
El Procesado puede destruir proteinas.
Polimorfismo limitado entre especies
Dificultad de interpretación
Influenciado por el medio ambiente
Normalmente requiere correr muestrar autentificadas en
paralelo
Métodos basados en
proteínas
Regulatory Fish Encyclopedia:
U.S. Food and Drug Administration, 1993-2009
Métodos de identificación de pescados – DNA
•
•
•
•
Resultados objetivos
Más resistentes al procesado de muestras
Fácil de utilizar
Alta especificidad/sensibilidad
DNA métodos
Secuenciación
 Alta inversión incial (> 100K $)
 Alto coste de mantenimiento
 No aplicable con muestras mezcladas
 Métodos de elección para nuevas especies.
PCR-RFLP
 Discriminación entre especies
sumamente relacionadas
 Trabaja con mezclas
 Bajo coste inicial
Método de identificación de pescados– PCR RFLP
 Mitocondrias: Alto número de copias
 Comunmente empleado el gen Cytochrome B (CytB)
o Cytochrome Oxidase I (COX1)
 La secuencia del CytB aporta información para especies de pescados.
Extraer el ADN
Amplificar la región de
interés en ADN
Fragmentar el ADN para generar los
modelos especificos
PCR RFLP
Food Control 16 (7), 601-607, (2004)
 La PCR RFLP es un metódo
acreditado/aprobado en muchos países.
 Transferencia del método a 2100 Bioanalyzer
para mejorar el análisis edición 2004 y 2005 por
Stephen Garrett de Campden BRI (Reino Unido)
J Agric Food Chem 53 (9), 3388-3357 (2005)
http://www.chem.agilent.com/Library/
applications/5989-2982EN.pdf
Agilent DNA Fish ID Solution
El Agilent DNA Fish ID solution es un método simple,
rápido y preciso basado en el screening del ADN para
la identificación de diferentes especies de pescados
frescos y procesados .
 Mejorar la calidad de los productos
 Reducir el impacto medio ambiental de actividades ilegales
en la industria pesquera.
 Mantener los registros adecuados para el cumplimiento
con las regulaciones gubernamentales.
2100 Bioanalyzer
system
VS
Capillary Electrophoresis
gel
2100 Bioanalyzer
Lab-on-a-chip system electrophoresi
s tradicional
Preparación de los chips(5 - 15
min):
 Procedimiento simple para seguir el
protocolo
 Bajo volumen de muestra (1 µl)
Run y Detección (30 min):
 Alta sensiblidad (0.1 ng of DNA)
 Datos en formato digital
Preparar y correr el gel
(1 - 3 h):
Grandes volumenes de
muestra necesarios 
Ticción, desteñido y
adquisición de imagenes
(0.5 – 1 h):
Baja sensiblidad (>50 ng DNA) 
Las imagenes necesitan ser
digitaizadas
Analisis:
 Analisis automatizado (tamaño y cuantificación)
 Comparación entre muestras y runs
 Alta resolución(5 bp diferencia)
+ precisión (± 10%)
<1h
Analisis:
Resolución restringida 
Alta variabilidad de tamaño 
No precisión cuantitativa 
información
Gel
analisi
s
>2h
Agilent DNA Fish ID Solution Purificación Amplificación de secuencias
de identificación de
de la muestra
especies
<1h
~ 1.5 h
Generación de
modelos de
especies
específicos
~2.5 h
(dependiendo # muestras)
Análisis de modelos usando el
RFLP Decoder
~ 6 h de muestra al resultado
<1h
(dependiendo de # muestras)
Paso 1: Extracción de ADN de tejidos en peces
usando el Agilent DNA Fish ID Solution
1. Utilizar 40 mg – 1 g tejido
(fresco, congelado, o procesado)
Homogenización opcional
2. Digerir con Proteinasa K Digestion
Buffer
Incubar a 65oC for 10 min
Total Time: 15 min
3. Obtener el ADN de la spin column
5 min
< 1 hr del
tejido al DNA
4.
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Lavar con High Salt Buffer (1X)
Lavar con 80% Etanol (3X)
5 min
Public
August 9, 2017
Alto rendimiento de la variedad A de muestras de
pescado
Extracciones de
variedades de especies de
pescado
18
Total yield, µg
14
12
10
8
14
Total yield, µg
16
Agilent Kit
Competitor Kits
16
12
10
8
6
6
4
4
2
2
0
0
Pacific
Cod wild
Tilapia- Scallop - Trout
Dover farm
wild
Reinbow
wild
- farm
Tuna wild
Salmon farm
Basa
Swai farm
Rango de rendimiento: 2-18
µg en 40 mg tejido
Pureza: Media de 2.19
A260/A280
PCR Requerimientos: 0.5 –
500 ng
5
4
3
2
Average
260/280: 1.41
1
Snapper
Pacificwild
45
7
8
12
11
10
Average
260/280: 2.09
9
40
35
Rendimiento en diferentes muestras
alternativas
(40 mg por muestra) 43µg
30
25
20
15
10
6.6µg
5
3.7µg
0
Dry fish
Page 10
6
50
DNA Yield, ug
Atlantic Tilapia- Catfish Salmon wild
farm
wild
Canned fish
Fish fins
Public
August 9, 2017
Step 2: PCR
PCR Master Mix
Fish Primer Mix
PCR
Cycling
1.5-2 hrs
cytb
PCR
Amplicon
+ 1 µl Extracto ADN de
pescado O
Control positivo ADN
de Salmon
Public
August 9, 2017
Salmon (farm)
Atlantic salmon
Tilapia (wild)
Tuna
Trout
Snapper
scallop
Tilapia (farm)
Catfish
Swai
Dover
Pacific Cod
Validación de la amplifiación de diferentes especies de
pescado
Public
August 9, 2017
Polymerase Chain Reaction (PCR) –
Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)
SPECIES2 1
SPECIES
ELECTROFORESIS
Muestra ADN
PCR productos:
“amplicon”
Digerir con
Enzyme B
PCR:
Amplificar con
primers genéricos
para peces
Public
August 9, 2017
Step 3: Digestión con Enzimas de restricción
Digerir con
Hae III
PCR
Amplicon
(2 hr tiempo de digestión)
Inactivar Enzimas con EDTA @ 65°C x 15 min
Public
August 9, 2017
Step 4: Bioanalyzer Lab-On-A-Chip Electrophoresis
Preparar Fish ID Chip
Añadir PCR-RFLP
Correr muestra en el Agilent
Analizar
productos
2100 Bioanalyzer
resultad
os
• Seleccionar
aplicación
• Click START
• <30 min run
• Descongelar los
reactivos
• Preparar gel/dye mix
• Cargar muestra ( 1 µL)
•Agitar 1 minuto
B
A
C
C
B
A
Public
August 9, 2017
Positive Control
Tilapia (wild)
Tuna
Trout
Snapper
Tilapia (farm)
Catfish
Swai
Dover
Pacific Cod
Digestión restrictiva de los amplicons de diferentes muestras
de pescados
DdeI
Hae III
Nla
III
Public
August 9, 2017
Interpretación de Resultados – RFLP Decoder
Software
Pattern 1
(Dde I)
scoring
panel
Puntuación combinada:
Indica la mayoría de las especies
El valor de la Puntuación indica la
calidad del emparejamiento.
Pattern 2
(Hae III)
scoring
panel
Histograma:
La Separación de las principales
especies de aquellas con menor
puntuación ofrece una mayor
confianza en el resultado.
Pattern 3
(Nla III)
scoring
panel
Sample
selection
Public
August 9, 2017
Paso 5: Coincidencia de modelos con el RFLP Decoder
Software
Entrada manual o Automatica de los productos digeridos
Rangos de puntuación para cada
enzima en relación a las especies
Puntuación combinada de las 3
digestiones en relación a una
especie.
Public
August 9, 2017
Coincidencia de patrones: RFLP Report
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Public
August 9, 2017
Modelos de RFLP con mezclas de pescados
Cod
Haddock
Mixture
Limites de detección en mezclas: 5%
Public
August 9, 2017
Resumen de Agilent DNA Fish ID Solution
Fácil de usar y simple
Los Reactivos + Equipo+ software = Solución completa
Patrones de base de datos de especies específicas elimina la necesidad de
autentificado de muestra en la misma prueba
Resultados rápidos de un amplio rango de muestras
 De la muestra al resultado en un solio día de trabajo usando un protocolo simple
 Aplicable a pescados crudos, cocidos, ahumados, secos y salados
Resultados precisos y fiables
 Basados en un metodo fiable aprovado y acreditado en muchos paises.
 Base de datos ampliable por el usuario y teóricos perfiles de más de 200
especies.
Agilent DNA Fish ID Solution:
Referencias:
• Agilent DNA Fish ID Ensemble - 5500-0100
• Agilent DNA Isolation Kit - 5500-0051
• Agilent PCR-RFLP Fish ID Kit - 5500-0001
• Agilent DNA 1000 Kit - 5067-1504
• Agilent RFLP Decoder Software, Fish - G5301A
• Agilent 2100 Bioanalyzer with chip priming station and IKA vortex mixer –
G2939AA
Muchas gracias!
[email protected]
[email protected]