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Item a chequear Importancia CheckList Informacion
1. Diseño
Experimental
El Organismo modelo bajo estudio es Arabidopsis thaliana. El tejido
1.1 Definición del
E
Si
Grupo
que se recolecta son inflorencias primarias. Teniendo en cuenta que
Experimental
las plantas utilizadas corresponden a líneas estables homocigotas
y el control
se recolectó una única inflorescencia por planta. No se hicieron
pooles. El grupo experimental consiste en plantas transgenicas
conocidas como rGRF2 que disponen de una copia extra del gen
GRF2 expresada bajo el control de su propio promotor, con una
modificación en el sitio target del MicroARN396 que vuelve al
mensajero insensible a la regulación por este microARN. El grupo
control consiste en plantas del ecotipo salvaje Col0.
1.2 Número
E
Si
rGRF2 n=3 ; Col0 n=3
dentro de cada
grupo
2. Muestra
2.1 Descripción
E
Si
Se trabaja con inflorescencias primarias de líneas homocigotas
estables (Col0, r GRF2)
2.2
E
SI
Macrodisección, se toma la planta y se remueve, utilizando una
¿Microdisección
pinza, la inflorescencia primaria, teniendo en cuenta que resulta
o
importante no tomar dentro de la muestra flores que se encuentren
Macrodisección?
ya abiertas
2.3 Protocolo de
procesamiento
2.4 Si se
congelo, cómo y
que tan rápido
2.5 Si se fije, con
qué y que tan
rápido
2.6 Condiciones
y Duración del
almacenamiento
de la muestra
3. Extracción de
ácidos Nucleicos
3.1
Procedimiento
y/o instrumental
E
Si
Las muestras fueron colectadas haciendo uso de nitrógeno líquido y
a continuación almacenadas en freezer a -80º
La muestra fue congelada inmediatamente utilizando nitrógeno
líquido tal como se indica en el ítem anterior
E
SI
E
Si
No fue fijado
E
Si
Las muestras fueron almacenadas en freezers a -80º, durante la
noche y procesadas al día siguiente de la colecta del material.
E
Si
3.2 Nombre del
Kit y detalles de
alguna
modificacion
3.3 Detalle del
tratamiento con
DNAsa o RNAsa
3.4 Posibilidad
E
Si
Se lleva extracción de tipo orgánica haciendo uso del reactivo
conocido comercialmente como TriPure. Este protocolo implica:
Morterear el tejido congelado, agregando 1mL TriPure por cada
100mg de material colectado. A continuación se agregan 200uL de
cloroformo por cada mL de TriPure agregado en el paso anterior
para favorecer la separación de fases. La precipitación se lleva a
cabo utilizando isopropanol durante no menos de 20 minutos. El
lavado del pellet se realiza con etanol al 70%. Luego del secado, el
pellet se resuspende en 30uL de agua libre de RNAsas.
No se utilizaron Kits en este protocolo de extracción
E
Si
E
Si
DNAsa I (Kit DNAsa Promega),Buffer RQ1 DNAsa (Kit DNAsa
Promega) y DNAsa Stop Solution (Kit DNAsa Promega). El
protocolo fue realizado según las especificaciones del fabricante.
En caso de encontrarse contaminada la muestra, la misma
de
Contaminación
con RNA o DNA
3.5
Cuantificación de
Ácidos nucleicos
3.5 Instrumento y
método
3.6 Pureza
260/280
correspondería a DNA genómico
E
Si
Medida de absorbancia a 260nm
E
Si
El RNA de las muestras de tejido fue analizado en un
espectrofotómetro NaNoDrop 1000(ThermoScientific) permitiendo
los datos obtenidos evaluar la pureza y el rendimiento del mismo.
D
Si
E
Si
E
No
La relación A260/A280 fue de 1.80 a 2.05 en cada una de las
muestras procesadas
La integridad del RNA de las muestras procesadas fue evaluada
mediante la corrida de un gel de agarosa al 1%, a continuación la
intensidad de las bandas correspondientes a los RNA ribosomales
fue cuantificada por densitometria, obteniéndose una relación en
promedio de 2 en cada uno de los caso
La integridad del RNA no fue chequeada por el método que
requiere del equipo Agilent RNA 6000 Nano Chips con Agilent
BioAnalyzer 2100
E
Si
La curva de calibración se considera suficiente para descartar la
presencia de inhibidores en la transcripción reversa o en la qPCR,
como asi también se tiene en cuenta la muy buena calidad de RNA
que fue obtenida.
E
Si
10mM dNTP mix (Applied Biosystem), 0.5ug/ul dTV 25mers, 0.1M
DTT (Kit MMLV Invitrogen), 2U/μL RNaseOUT (Invitrogen), 5X First
Strand Buffer (Kit MMLV Invitrogen) 200U/μL MMLV (Invitrogen).
E
Si
Volumen Final de reacción: 20ul trabajando con una cantidad final
de RNA de 0.25ug
E
Si
Oligo dTV con una concentración final de 0.5ug/ul
E
Si
MMLV a una concentración final de 200U/ul
E
Si
Previamente a la síntesis de cDNA, el RNA, el oligo dTV y los
dNTPs fueron desnaturalizados en conjunto a 65º durante 5
minutos. La síntesis de cDNA se realizó a 37º durante 50 minutos.
A continuación se calentó la mezcla a 70º durante 15 minutos
inactivando la reacción por calentamiento.
E
E
Si
Si
GRF2
E
Si
3.7 Integridad del
RNA: Método o
Instrumento
3.9 RIN,/RQI o
CQ del 5´y el
3`de los
transcriptos
3.10 Prueba de
inhibción Cq de
diluciones
4. Trascripción
Reversa
4.1 Condiciones
Completas de la
reacción
(Concentraciones
iniciales)
4.2 Cantidad de
RNA y volumen
de la reacción
4.3
Oligonucleótido y
concentración
4.4 Transcriptasa
reversa y
Concentración
4.5 Temperatura
y tiempo
5. Información
del gen target de
la qPCR
5.1 Simbolo del
Gen
5.2 Número de
acceso a la
secuencia
5.3 Tamaño del
NM_119936.4
346pb
amplicon
5.4 Screening
especifico in
Silico (BLAST)
5.5 Ubicación de
cada primer
dentro de Exones
o Intrones
5.6 Variante de
Splicing que fue
medida
6.
Oligonucléotidos
utilizados en la
qPCR
6.1 Secuencia de
los Oligos
E
Si
La especificad de todos los primers fue chequeada utilizando el
programa NCBI Primer-BLAST.
Los oligos fueron diseñados sobre secuencias correspondientes a
exones
E
Si
E
Si
En el caso del GRF2 no se describen variantes generadas por
splicing
E
Si
Gen target : Oligo reverso: CTTACAACCCAAGGAATCTCCGGTT
Oligo Foward: CACATCAACAGAGGCCGTCATcg
Gen utilizado como referencia PP2A
Oligo Foward: CCTGCGGTAATAACTGCATCT
Oligo Reverso: CATCACTTAGCTCCACCAAGCA
Tamaño del amplicon: 355pb
6.2 Ubicación e
identidad de
alguna
modificación
7. Protocolo de la
qPCR
7.1 Condiciones
Completas de la
reacción
7.2 Volumen de
la reacción y
cantidad de
cDNA
E
Si
No se realizaron modificaciones sobre los mismos
E
Si
La mezcla real utilizada contiene los componentes detallados a
continuación. No se utiliza una mezcla de Kit.
E
Si
Volumen Final de Reacción 20uL, se pipetean 5uL de cDNAde una
dilución 1/10 del cDNA Original
7.3
Concentraciones
de: Primers,
Magnesio y
dNTPs (Iniciales)
7.4 Polimerasa y
Concentración
7.5 Buffers o Kit
(Fabricante)
7.6 Aditivos
(SYBR GREEN,
DMSO)
7.7 Parámetros
del termociclador
E
Si
MgCl2 50mM (Kit Taq Platinum), dNTPs 10mM (Applied
Biosystem), Oligo Mix 10uM (Invitrogen)
E
Si
Platinum Taq DNA polimerasa 5U/ul (Invitrogen)
E
Si
10x PCR Buffer (Taq Platinum)
E
Si
SYBR Green I 10X (Invitrogen)
E
Si
7.8 Fabricante
del equipo
E
Si
2´a 95ºC un único ciclo para activación de la enzima y eliminación
de contaminaciones procedentes de la reaccion de
retrotranscripción. 15´´ a 95, 30`` 58º y 40´´ a 72º durante 40 ciclos,
la fluorescencia fue evaluada durante la etapa de elongación, y
también se realizaron curvas de disociación
GE
8. Validación de
la qPCR
8.1 Especificidad
(Curvas de
Melting)
E
Si
8.2 SYBR green,
Cq del NTC
E
Si
8.3 Curvas de
Calibración:
Ecuación
8.4 Eficiencia de
amplificación
calculada de la
curva
8.5 r2 de la curva
de calibración
8.6 Linealidad del
rango dinámico
E
Si
La especificidad de la reacción fue verificada mediante el análisis
de las curvas de melting. Tanto para los controles positivos como
para las muestras experimentales se observa un único pico
correspondiente al producto deseado, en el NTC si bien se observa
un pico el mismo aparece a una menor temperatura y puede
asociarse a la formación de dimeros de primers
Las curvas de amplificación observadas para el NTC presentan un
Cq que se separa de la última curva de amplificación de las
muestras en un número mayor a 8 ciclos (Cq promedio 33)
Y=-3.412X + 35.20
E
Si
La eficiencia de amplificación fue de 1.92
E
Si
r2=0.96
E
Si
8.7 Variación del
Cq en el rango
de detección
8.8 Evidencia del
límite de
detección
8.9 Si se realizó
una multiplex,
eficiencia y LOD
de cada ensayo
9. Análisis de
Datos
9.1 Programa de
análisis de la
qPCR (Versión)
9.2 Método de
determinación
del Cq
E
Si
En promedio, el rango dinámico lineal fue considerado teniendo en
cuenta la linealidad obtenida en las curvas de calibración, de
diluciones 1/40 a 1/320
El limite de detección de la técnicas (LOD) no es necesario para
cuantificación relativa
E
Si
El limite de detección de la técnicas (LOD) no es necesario para
cuantificación relativa
E
Si
No fue realizada una Multiplex
E
Si
MxPro3000P
E
Si
E
Si
E
Si
E
Si
La cuantificación relativa de la expresión del gen target fue llevada
a cabo utilizando el método comparativo del Cq (ΔΔCq), teniendo
en cuenta las eficiencias de amplificación específicas.
A través del análisis de los datos obtenidos en la real time utilizando
el software provisto por el equipo (MxPro3000) setteando en forma
correcta la línea de base, la línea de cuantificación, los outliers
fueron facilmente identificados y a continuación eliminados.
Si bien en algunos de los NTC se observa amplificación, la misma
resulta ser tardía (Cq elevados) y correspondiente a la formación de
dímeros de primers
En este trabajo se utilizó un único gen de referencia, PP2A
(Fosfatasa), que es justamente el normalizador que se utiliza con
frecuencia en el caso de medidas de expresión génica en el modelo
Arabidopsis Thaliana
E
Si
9.3 Identificación
y Disposición de
outliers
9.4 Resultados
de los NTC
9.5 Justificación
del número y de
la elección de los
genes de
referencia
9.6 Descripción
del método de
normalización
Los niveles del RNA target fueron normalizados a los niveles del
gen de referencia PP2A utilizando el método comparativo
CT(ΔΔCT)
9.7 Número y
Etapa de las
réplicas técnicas
9.8
Repetitibilidad
9.9 Métodos
estadísticos
empleados para
la significancia
de resultados
9.10 Software
estadistico
E
Si
Se hicieron réplicas ténicas en la etapa de la qPCR, dos por cada
réplica biológica
E
Si
E
Si
El SD (Desvio estándar) entre réplicas técnicas de cada réplica
biológica fue menor a 0.3
Los resultados fueron evaluados a través de un test estadístico de
inferencia de dos variables (t student), habiendose verificado los
supuestos de normalidad en la distribución de los valores de las
variables medidas
E
Si
Info Stat