Download Transformacion de Plantas Transgenicas

Biotecnología Vegetal
Transformación génica en
plantas
Biotecnología Vegetal
• La biotecnología consiste en la
utilización de organismos vivos con
fines industriales
• Conjunto de técnicas que utilizan organismos vivos o
parte de ellos para obtener productos o modificarlos,
para mejorar plantas o animales, o para desarrollar
microorganismos con fines determinados
• Se utilizan las técnicas de ingeniería genética
y cultivo de tejidos vegetales in vitro
Planta transgénica
Sistemas de
Se introduce un DNA foráneo en el genoma de sus
transformación células, este DNA se expresa y confiere a la planta un
genética
carácter o unos caracteres nuevos
en plantas
• Sistemas de transferencia de ADN basados
en vectores biológicos
- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
y Agrobacterium rhizogenes.
- Sistemas basados en virus vegetales.
• Sistemas de transferencia directa de ADN
- Transferencia por biobalística (micropartículas de oro
o tungsteno que tiene aglomerado el DNA foráneo).
- Transferencia mediada por cationes divalentes
y/o electroporación
- Transferencia por microinyección.
¿Para qué plantas
transgénicas?
• Rendimiento y calidad nutricional
• Biorreactores
• Estudio de procesos biológicos
Rasgos introducidos
• Resistencia a:
– insectos
– herbicidas
– virus, hongos, bacterias
• Retraso de senescencia, tolerancia a estrés
• Mejora del valor biológico (proteínas,
lípidos)
• Producción de polipéptidos de uso
farmacológico.
Biotecnologías de apoyo al mejoramiento
de plantas
•Cultivo de tejidos
•Rescate de embriones
•Embriogénesis somática
•Organogénesis somática
•Producción de haploides
•Fusión de protoplastos
•Trasformación genética
•Agrobacterium tumefaciens
•Agrobacterium rhizogenes
•Métodos directos
•Métodos Indirectos
Cultivo de tejidos Factores comunes
Composición general de medios de cultivo:
• Fuente de Carbono (azúcares)
• Macronutrientes (N, K, etc)
• Micronutrientes (Fe, Cl, etc)
• Vitaminas
• Agente gelificante (para medios sólidos)
• Reguladores de crecimiento (hormonas vegetales)
• Otros compuestos
(ej: agentes quelantes)
ambientación
asepcia
cultivo
Cultivo de tejidos: Rescate de embriones
Cultivo de tejidos: Embriogénesis somática
Cultivo de tejidos: Organogénesis somática
Propagación masiva
•Flores
•Frutales
•Árboles forestales
Cultivo de meristemas
•Saneamiento de virus
•Rejuvenecimiento
Cultivo de tejidos: Producción de haploides
Cultivo de tejidos:
Fusión de protoplastos
Transformación genética Técnicas básicas
•
•
•
•
•
•
•
Enzimas de restricción
Clonación de genes
Secuenciación
Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN
Hibridación con anticuerpos (western blot)
Hibridación de ácidos nucleicos (southern, northern)
Reacción de la polimerasa en cadena (pcr)
Transformación genética Técnicas básicas
Enzimas de restricción
Clonación en plásmidos (vectores)
Transformación genética Técnicas básicas
Clonación en plásmidos (vectores)
Transformación genética Técnicas básicas
Secuenciación
A C G T
Transformación genética Técnicas básicas: Secuenciación
Transformación genética Técnicas básicas
Electroforesis (DNA, RNA,proteinas)
southern
northern
western
Transformación genética Técnicas básicas
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Métodos indirectos
• Agrobacterium tumefaciens
• Agrobacterium rhizogenes
Transformación genética:A. tumefaciens
Agrobacterium
tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Bacteria del
suelo Gram (-)
Tumor de tallo provocado
por Agrobacterium tumefaciens
Agallas en
corona
Agrobacterium tumefaciens
Bacteria Gram negativa que infecta a las plantas en lugares
donde hay heridas y produce la enfermedad de las agallas en
corona, fundamentalmente en Dicoteledóneas.
Las agallas son protuberancias formadas por
conglomerados de células indeferenciadas
El plásmido Ti (tumor-inducing) es el responsable de la
inducción de tumores, durante la infección se transfiere una
porción definida de este plásmido: T-DNA (DNA de
transferencia)
La integración y expresión de ciertos genes del T-DNA
(oncogenes) hace que las células transformadas se dividan sin
control. Codifican para la síntesis de fitohormonas (auxinas y
citoquininas) y de opinas (fuente de C y N para la bacteria).
¿Qué son los genes vir?
• Codifican factores esenciales para la
transferencia e integración del T-DNA
dentro del genoma de la planta.
• Están ubicados en una regíón de 35 kb del
plásmido Ti fuera de la región del T-DNA.
• Hay 25 genes vir distribuídos en 7
operones.
• Responden a un metabolito secundario
exudado por las plantas cuando se les
provoca una herida (acetosiringona)
Transformación genética:A. tumefaciens
Vectores derivados del
plásmido Ti
• Componentes necesarios:
– Marcador de selección (resistencia a
kanamicina)
– Origen de replicación (para que se replique en
E.coli)
– Borde derecho de la secuencia T-DNA
– Polylinker (región de multiple clonaje)
• Tipos:
– binarios
– cointegrados
Transformación genética:A. tumefaciens
Se inocula con Agrobacterium desarmada que contenga un vector de
transformación. El T-DNA contiene un módulo de expresión y el gen de
resistencia a la kanamicina
El medio además de hormonas debe contener el antibiótico cefotaxima
(para controlar el crecimiento de Agrobacterium) y kanamicina
(antibiótico de selección)
Agrobacterium
rhizogenes
En este caso se
utiliza como vector
de transformación la
bacteria con su
plásmido Ri intacto y
además se introduce
otro plásmido que
contiene los genes
quiméricos dentro del
T-DNA. Puede dar
fenotipos aberrantes
en la parte aérea de
la planta
Cultivo de raíces de tabaco transformadas
por Agrobacterium rhizogenes
Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus
Gentileza del Dr. Mark Tepfer
Métodos directos
•
•
•
•
Bombardeo de partículas (biobalistica)
Electroformación de Protoplasto
Fibras de carburo de silicio “Whiskers”
Transformación mediada por Glicol de
polietileno (PEG)
Transformación genética:Biobalística
Manipulación de la expresión
génica
• Promotores:
– constitutivos (35S del virus del mosaico del
coliflor)
– tejido específicos (FBPasa - Rubiscom)
– inducibles
• Secuencias “enhancer”
• Intrones que estabilizan el mRNA
producido
• Secuencia terminadora (nopalina sintasa)
Manipulación
posttranscripcional
• Antisentido
– Se transfiere un gen que codifica para un RNA
complementario (asRNA) al mRNA de interés.
– Al transcribirse ambos genes se forma un
híbrido asRNA-mRNA que impide la
traducción del último.
GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO EN
PLANTAS TRANSGÉNICAS
Tipo de gen utilizado en transgénesis
Caracter que confiere a la planta
Toxina de Bacillus thuringensis
Resistencia a Insectos
Proteína de la cubierta viral
Resistencia a Virus
Quitinasas, glucanasas de plantas y de
otros organismos
Resistencia a Hongos
Lisozima humana y de cerdo. Otros
péptidos bactericidas
Resistencia a Bacterias
Genes cuyos productos afectan
biosíntesis
de
aminoácidos,
o
fotosíntesis
Resistencia a Herbicidas
la
la
Genes cuyos productos afectan la
biosíntesis del etileno, o la formación de
pared celular
Retraso maduración de frutos
ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS
TRANSGÉNICAS (Birch, 1997)
Cultivo (Fecha
liberación)
Nombre
Compañía
Caraterísticas
Tomate (1994)
Flavr Savr
Calgene
Savor de madurez
en rama, largavida
Zeneca
Consistencia de
pasta de tomate
Tomate (1995)
Algodón
Papas
Maiz (1996-97)
Bollgard
NewLeaf
YieldGuard
Monsanto
Toxina deBacillus
thuringiensis para
resistencia insectos
Soya
Raps
Algodón (95-96)
Roundup Ready
Monsanto
Resistencia a
Glifosato (herbicida)
OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO
GENÉTICAMENTE MODIFICADAS
Abeto
Acelga
Alfalfa
Algodón
Alamo
Arabidopsis
Arroz
Arveja
Camote
Caña de
azucar
Cebada
Centeno
Clavel
Crisantemo
Espárrago
Eucalyptus
Frambuesa
Frutilla
Kiwi
Lechuga
Lirio
Maíz
Maní
Manzana
Maravilla
Orquidea
Papa
Papaya
Petunia
Pera
Pino
Plátano
Poroto
Poroto de soya
Remolacha
Repollo
Rosa
Sorgo
Tabaco
Tomate
Tulipán
Trigo
Vides
Zanahoria
Zapallo
MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
Transformación de Plantas
Biobalística
o
Agrobacterium
Mejoramiento
Genético
Resistencia a
Patógenos
Insectos
Hongos
Bacterias
Resistencia a
Herbicidas
Esterilidad
Sexual
Roundup
Materna
Listo
Paterna
Calidad del
Producto
Color
Postcosecha
Glifosato
Glifosato
Bromoxinil
Asignacion
• Definicion
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Rescate de embriones
Embriogénesis somática
Organogénesis somática
Producción de haploides
Fusión de protoplastos
Plasticidad
Totipotencia
Monocotiledodeas
Dicotiledoneas