Download Esterilización y medios de cultivo

Métodos de esterilización y
desinfección.
Medios de cultivo.
Curso: Diagnóstico de enfermedades
vegetales
27 de mayo de 2011
Ing. Agr. MSc. Vivienne Gepp
Objetivo
• Que el estudiante se
familiarice con los procesos
de desinfección y
esterilización comúnmente
utilizados en un Laboratorio
de Fitopatología.
• Conocer los medios de
cultivo más usados.
Definiciones
Esterilización = proceso mediante el cual se
matan o eliminan todas las formas de vida
microbiana.
 estéril o no estéril.
Desinfección = eliminar microorganismos
patógenos total o parcialmente
 niveles de desinfección.
Asepsia = exclusión continuada de
microorganismos contaminantes.
Métodos de esterilización
• FISICOS:
– Calor
• seco (llama,
horno)
• húmedo
(autoclave)
– Radiaciones
• MECÁNICOS
– Filtración
• QUIMICOS
– Gaseosos
– No gaseosos
Calor seco
• Esterilización directa en la llama
Calor seco
alcohol 96% + mechero
Calor seco
alcohol 96% + mechero
Calor seco
Horno
Calor seco Horno
T ºC
• Se utiliza para:




vidrio seco
instrumentos quirúrgicos
objetos metálicos
aceites, vaselinas y polvos
• Temperaturas:
180 ºC ---------- 30 - 60 min.
170 ºC ---------- 60 - 120 min
horas
Calor seco
• Recipientes de metal o envolver en papel
(usar temp. menor en este caso)
• Dejar que vuelva a temp. ambiente antes de
abrir
Calor húmedo
• Con presión: autoclave, olla presión
• Para sustancias estables al calor
– ¿combinaciones reactivos a temp altas?
• Temperatura – presión – tiempo
Temp.
100
110
115
Tiempo
20 h
2,5 h
51 min.
121
125
130
15 min. 6,4 min. 2,4 min.
Autoclave
Autoclave
Presi
ón
(lb/in
.)
Temperatura interna (ºC) según % aire eliminado
100%
66%
50%
33%
0%
5
109
100
94
90
72
10
115
109
105
100
100
15
121
115
112
109
100
25
130
126
124
121
115
30
135
130
128
126
121
Calor húmedo - Autoclave
• ¿cómo optimizar eficacia?
– eliminar aire,
– contenidos similares,
– no apretados, dejar espacios verticales,
• Precauciones:
– tapas sueltas,
– recipientes con hasta 1/3 de volumen,
– vuelta a presión normal lenta.
Controles de esterilización
a. Físicos
b. Químicos
c. Biológicos
Controles de esterilización
a. Físicos
b. Químicos
c. Biológicos
Esterilización química
• Ventajas: no requiere altas temperaturas ni
aparatos costosos
• Desventajas: mayor tiempo, sustancias
inflamables y muy tóxicos y alto costo
• Ejemplos: óxido de etileno, formaldehído
Esterilización por filtrado
•
•
•
•
•
•
Elimina microorganismos >virus
Ventaja: no modifica composición
Para: cantidades pequeñas
Para: vitaminas, hormonas, antibióticos, etc.
Requiere bomba de vacío
Ejemplo membranas de ésteres de celulosa: 1 uso,
“poros” de 0,22 µm
CAMPANAS DE FLUJO LAMINAR
Radiaciones UV
Desinfección superficial
Desinfección superficial
Técnicas comunes en Fitopatología:
• Lavado previo en agua corriente
– detergente? cepillo?
• Agua corriente 2 o más horas
• Alcohol 70%
• Hipoclorito de sodio:
– 1% Cloro activo, 2 %, 0,35% etc.
– minutos
– enjuague posterior
Desinfección superficial
Selección de técnica(s) según:
• tejido: grosor, consistencia
• hongo a aislar: ej. Oomycetes,
Rhizoctonia
• dónde pensamos que está el patógeno
Medios de cultivo
• Componentes básicos
• ¿Sólido o líquido?
• Ajuste de pH
• Inhibidores de “contaminantes”:
– bacterias
– hongos no deseados
Clasificación de medios de cultivo
• Sintéticos – más complicados para
elaborar, muchos componentes
• Naturales – raíces y frutos aportan lo
necesario para hongos, ¿bacterias
necesitan más?
• Semi-sintéticos
¿Qué aportan los medios?
• Soporte - Agentes solidificantes:
– gelatina: fusión a 37ºC, solidifica 25-30ºC, se
descompone a 121ºC
– agar: fusión a 80-100ºC, solidifica a 35-50ºC
• Carbono orgánico
– Azúcares inducen crecimiento micelio, pueden inhibir
esporulación temporal- o permanentemente.
•
•
•
•
Vitaminas y otros factores de crecimiento
Inhibidores
Sustancias que permiten diferenciar spp. o biotipos
Indicadores
Medios comunes:
• Agar papa dextrosa
• Agar agua
• Nutriente agar
dextrosa
• Agar harina de maíz
• Extracto de levadura
dextrosa con
carbonato de calcio
(Yeast Dextrose
CaC03)
• Agar V8
• B de King
• Agar malta
Dispensado de medios
• Temperatura: 45-50ºC
– mayor: condensa H2O
– menor: solidificación prematura
• Placas de Petri: aprox. 20 ml c/u
• Tubos de ensayo: vertical o pico de flauta