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Etiología y diagnóstico de las
Encefalopatías Espongiformes
Transmisibles de los animales
Laboratorio de Referencia para EET de los Animales
Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y
Agrícolas - INTA Castelar
“Cursos de capacitación y actualización para la prevención y vigilancia de EETs”
Origen de la EEB
Hipótesis sobre el origen
• Scrapie
• Garrapatas,
organoclorados????
•Enfermedad espontánea????
• Origen exótico????
• Origen humano???? (Colchester &
Colchester Lancet. 366, 856; 2005).
• Scrapie ?
Scrapie: enfermedad genética?
Ovino:
gen Sip
sA/sA
sA/pA
150-200 días
300 días
pA/pA
PRNP
1936: Transmisión experimental de Scrapie
Agente etiológico
Características del agente de EET
-Hay cepas (tiempo de incubación, lesiones SNC)
-Barrera de la especie
-Tamaño similar a virus
-No hay respuesta de anticuerpos
-Resistencia (calor, radiaciones, nucleasas)
-Sensibilidad parcial a proteasas
-Ácido nucleico?
Modelo de agente de TSE
Debe explicar
-Falta de respuesta de anticuerpos
-Existencia de cepas (tiempo de incubación, lesiones)
-Barrera de la especie (transmisión estocástica)
Inactivación del agente de EEB
Calor húmedo
121 ºC, 1 atm, 20 min
Incompleta
133 ºC, 3 bar, 20 min
Calor seco
138 ªC
Métodos químicos
Hidróxido de Sodio 1N, 24 hs
Hidróxido de Sodio 2N, 2 hs
Hipoclorito de Sodio 12 hs
Incompleta
Agentes hipotéticos de "Scrapie"
• Virus
Lentos
No convencionales
• "Virino“
Hipotéticos
• Agentes no convencionales
PRIONES
Alper et al., BBRC 22: 278 (1966)
Pattison & Jones, Vet Rec 80: 2 (1967)
Griffith, Nature 215: 1043 (1967)
Merz et al., Acta Neuropathol 54: 63 (1981)
SAF: Scrapie Associated Fibrils
Priones
“Pequeñas partículas proteináceas que resisten
la inactivación por métodos que modifican
ácidos nucleicos”
PrP
PrPC: proteína normal del huesped
PrPSc: proteína patogénica de Scrapie
Stanley B. Prusiner. Science 216: 136-144, 1982
Isoformas de PrP
Normal
PrPC (33-35 kD)
Proteinasa K
Detergente
-
+
-
Asociada a
enfermedad PrPSc
(33-35 kD)
PrP27-30 (27-30 kD)
+
Isoformas PrPC y PrPSc
PrP C
PrP Sc
Detergentes
soluble
insoluble
Proteasas
sensible
resistente
(PrP27-30)
42
30
3
43
 -hélice (%)
hoja  (%)
Modelo de nucleación-polimerización
(Equilibrio entre las dos isoformas)
PrPC
Nucleación
(muy lenta)
PrPSc
Incorporación
de monóméros
PrPSc (rápida)
Núcleo infeccioso
Estructura
amiloide
Fragmentación
en núcleos infecciosos
Encefalopatías Espongiformes
Transmisibles
Tiempo de incubación
Diagnóstico preclínico
Prevención
Signos clínicos
Tratamiento
Cura
Evolución
Desenlace
Diagnóstico definitivo
PrP
Años
No
No
Neurológicos
No
No
Rápida
Fatal
Post mortem
NH
COOH
Prusiner, Science 278: 245 (1997)
Polimorfismos en PrP animales
Scrapie:
95% QQ171
86
Ovino
108
Octapéptidos L
F
Bovino
ELW/00
Caprino
136 142 154
A
V
I
M
Murino
H
R
171189
Q
R
H
T
V
Esquema del gen PRNP de los ovinos
Polimorfismo del gen PRNP
136 141 154 171
Valina (V) Fenilalanina (F)
Alanina (A)
Leucina (L)
Arginina (R)
Histidina (H)
Arginina (R)
Glutamina (Q)
Histidina (H)
Alelos y genotipos más frecuentes del gen PRNP
Nivel de Riesgo
Polimorfismo
RAZAS
R1
ARR / ARR
Charollais, Bleu de Maine, Bluefaced
Leicester, Hampshire, Suffolk,
Blackface, Cheviot, Texel
R2
AHQ / AHQ
ARR / AHQ
Bluefaced Leicester, Blackface, Cheviot,
Texel
AHQ / ARQ
Bluefaced Leicester, Blackface, Cheviot,
Texel
AHQ / ARH
ARR / ARH
Texel
ARR / ARQ*
Charollais, Bleu de Maine, Bluefaced
Leicester, Texel Blackface, Cheviot,
Hampshire , Suffolk
VRQ / ARR
Blackface, Cheviot, Texel
VRQ / ARH
Charollais, Bleu de Maine, Texel
VRQ / AHQ
Blackface, Cheviot, Texel
ARQ / ARQ
Charollais, Bleu de Maine, Blackface,
Cheviot
ARQ / ARH
ARH / ARH
Texel
VRQ / VRQ
VRQ / ARQ
Charollais, Bleu de Maine, Blackface,
Cheviot,Texel
R3
R4
R5
Grupos de riesgo de adquisición de Scrapie por
resistencia / susceptibilidad genética
Genotipo
Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad
ARR / ARR
1
Ninguna restricción para su reproducción
ARR / AHQ
ARR / ARH
ARR / ARQ
2
Ninguna restricción para su reproducción
3
Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o
uso limitado para su reproducción en campos asociados
a NSP
4
Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP,
tampoco para su venta. Reglamentación de castración /
sacrificio del ovino
5
Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP,
tampoco para su venta. Reglamentación de castración /
sacrificio del ovino
AHQ / AHQ
ARH / ARH
AHQ / ARH
ARQ / ARH
ARQ / AHQ
ARQ / ARQ
ARR / VRQ
ARQ / VRQ
ARH / VRQ
AHQ / VRQ
VRQ / VRQ
P C R
Determinación de genotipos
PCR - ELISA
Secuenciación
Manual o Automática
PCR - RFLP
Determinación de las frecuencias de genotipos
Frecuencias genotipicas absolutas de la población
90
80
70
Nro. absoluto
60
50
40
30
20
10
0
1
Genotipos
ALRQ / ALRQ
ALRR / ALRQ
ALRR / ALRR
ALHQ / ALRQ
VLRQ / ALRQ
ALHQ / ALHQ
ALRH / ALRQ
AFRQ / ALRQ
ALRH / ALRR
ALRH / ALRH
AFRQ / ALRR
VLRQ / ALRR
VLRQ / VLRQ
ALHQ / ALRR
ALHQ / ALHR
VLRQ / ALHQ
AFRQ / AFRQ
AFRQ / ALHQ
VLRQ / ALRH
VLRQ / AFRQ
VLRH / ALRH
VLRH / ALRR
AFRR / ALRR
ALHR / ALHR
ALHQ / ALRH
Determinación de las frecuencias de los diferentes alelos
29.00%
0.17%
0.33%
0.83%
3.67%
4.50%
47.33%
9.50%
4.67%
Frecuencias Alélicas de la población bajo estudio
ALRQ
ALRR
ALHQ
ALRH
VLRQ
AFRQ
ALHR
VLRH
AFRR
Determinación de las frecuencias de los grupos de riesgo
Genotipo
Grupo NSP
Grado de resistencia / susceptibilidad
Porcentaje
ARR / ARR
1
Ninguna restricción para su reproducción
16,38
ARR / AHQ
ARR / ARH
ARR / ARQ
2
Ninguna restricción para su reproducción
25,25
AHQ / AHQ
ARH / ARH
AHQ / ARH
ARQ / ARH
ARQ / AHQ
ARQ / ARQ
3
Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso
limitado para su reproducción en campos asociados a NSP
50,51
4
Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP,
tampoco para su venta. Reglamentación de castración /
sacrificio del ovino
1,36
5
Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP,
tampoco para su venta. Reglamentación de castración /
sacrificio del ovino
6,48
ARR / VRQ
ARQ / VRQ
ARH / VRQ
AHQ / VRQ
VRQ / VRQ
Cepas de Scrapie
-20 definidas por pasaje en ratón
- Nor 98: aislada de casos de campo:
Definida por:
- Clínica
- Histopatología
- “R” en 171: susceptible
Cepas de BSE
1: Italia
BASE: Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy
Casalone et al. Proc Natl Acad Sci 101:3065, 2004
2) Francia:
3) Japón??
Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004
“Molecular analysis of ovine prion protein identifies similarities
between BSE and an experimental isolate of natural scrapie,
CH1641”. Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999
“Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases”
Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004
Diagnóstico de EET
•Solamente en el post mortem
•“Test del tercer párpado” (in vivo) para “scrapie”
-Histopatología
-Detección de PrP:
Inmunohistoquímica
SAF
Western Blot
ELISA
Histopatología
(Lesión espongiforme)
Inmunohistoquímica
(Depósitos de PrP)
En ovinos
SAF: Scrapie Associated Fibrils
Medula Oblongata (Región del Obex)
1) Médula espinal
2) Cerebro
3) Región del Obex
4) Area utilizada para
WB/ELISA
5) Muestra de elección
Tests rápidos
BSE
-Prionics Check Western
-Prionics LIA
-TeSeE (BioRad)
-CDI InPro
- CediTect BSE Test
- Enfer TSE Kit version 2.0, automated sample
preparation
- IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA
- Institut Pourquier Speed´it BSE
- Prionics Check PrioSTRIP
- Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit
- Roche Applied Science PrionScreen
Scrapie
- IDEXX Herdchek
- InPro CDI-5
Métodos utilizados en el Programa
de Vigilancia de Argentina
Métodos de referencia:
-Histopatología
-Inmunohistoquímica
-Western blot
Test rápidos:
-Western blot (Prionics)
- Enfer TSE (ensayo piloto-2003)
Algunos métodos en estudio (in vivo)
 Detección de PrPSc en sangre
(Scherr et al., J. Chromat 697: 223, 1997)

Unión de PrPSc a plasminógeno en soporte sólido
(Fischer et al., Nature 408: 479, 2000)
Detección de PrPSc en orina
(Shaked et al., J Biol Chem 276: 31479,
2001)
 “Protein
misfolding cyclic amplification”
(Saborio et al. Nature 411: 810, 2001)
 Detección
de secuencias cortas de ADN asociadas a
EET en sangre
( Schütz et al, Clin Diagn Lab Inmunol. 12 (7): 814-820, 2005)
Laboratorio de referencia para el
diagnóstico de EET de animales
Centro de Investigación en Ciencias
Veterinarias y Agronómicas
Castelar
B. J. Carrillo
F.J. Blanco Viera
E. L. Weber
M. Alegre
F. Capellino
F. Delgado
S. Duffy
D. Funes
L. Jiménez
E. León
A. Marcos
S. Martínez
G. Pinto
C. Soto
C. Vallejos
C.Hirschvogel
A. Marcos
G. Figueroa
S. Carceller
A. Elisei
GRACIAS