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Etiología y diagnóstico de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles de los animales Laboratorio de Referencia para EET de los Animales Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agrícolas - INTA Castelar “Cursos de capacitación y actualización para la prevención y vigilancia de EETs” Origen de la EEB Hipótesis sobre el origen • Scrapie • Garrapatas, organoclorados???? •Enfermedad espontánea???? • Origen exótico???? • Origen humano???? (Colchester & Colchester Lancet. 366, 856; 2005). • Scrapie ? Scrapie: enfermedad genética? Ovino: gen Sip sA/sA sA/pA 150-200 días 300 días pA/pA PRNP 1936: Transmisión experimental de Scrapie Agente etiológico Características del agente de EET -Hay cepas (tiempo de incubación, lesiones SNC) -Barrera de la especie -Tamaño similar a virus -No hay respuesta de anticuerpos -Resistencia (calor, radiaciones, nucleasas) -Sensibilidad parcial a proteasas -Ácido nucleico? Modelo de agente de TSE Debe explicar -Falta de respuesta de anticuerpos -Existencia de cepas (tiempo de incubación, lesiones) -Barrera de la especie (transmisión estocástica) Inactivación del agente de EEB Calor húmedo 121 ºC, 1 atm, 20 min Incompleta 133 ºC, 3 bar, 20 min Calor seco 138 ªC Métodos químicos Hidróxido de Sodio 1N, 24 hs Hidróxido de Sodio 2N, 2 hs Hipoclorito de Sodio 12 hs Incompleta Agentes hipotéticos de "Scrapie" • Virus Lentos No convencionales • "Virino“ Hipotéticos • Agentes no convencionales PRIONES Alper et al., BBRC 22: 278 (1966) Pattison & Jones, Vet Rec 80: 2 (1967) Griffith, Nature 215: 1043 (1967) Merz et al., Acta Neuropathol 54: 63 (1981) SAF: Scrapie Associated Fibrils Priones “Pequeñas partículas proteináceas que resisten la inactivación por métodos que modifican ácidos nucleicos” PrP PrPC: proteína normal del huesped PrPSc: proteína patogénica de Scrapie Stanley B. Prusiner. Science 216: 136-144, 1982 Isoformas de PrP Normal PrPC (33-35 kD) Proteinasa K Detergente - + - Asociada a enfermedad PrPSc (33-35 kD) PrP27-30 (27-30 kD) + Isoformas PrPC y PrPSc PrP C PrP Sc Detergentes soluble insoluble Proteasas sensible resistente (PrP27-30) 42 30 3 43 -hélice (%) hoja (%) Modelo de nucleación-polimerización (Equilibrio entre las dos isoformas) PrPC Nucleación (muy lenta) PrPSc Incorporación de monóméros PrPSc (rápida) Núcleo infeccioso Estructura amiloide Fragmentación en núcleos infecciosos Encefalopatías Espongiformes Transmisibles Tiempo de incubación Diagnóstico preclínico Prevención Signos clínicos Tratamiento Cura Evolución Desenlace Diagnóstico definitivo PrP Años No No Neurológicos No No Rápida Fatal Post mortem NH COOH Prusiner, Science 278: 245 (1997) Polimorfismos en PrP animales Scrapie: 95% QQ171 86 Ovino 108 Octapéptidos L F Bovino ELW/00 Caprino 136 142 154 A V I M Murino H R 171189 Q R H T V Esquema del gen PRNP de los ovinos Polimorfismo del gen PRNP 136 141 154 171 Valina (V) Fenilalanina (F) Alanina (A) Leucina (L) Arginina (R) Histidina (H) Arginina (R) Glutamina (Q) Histidina (H) Alelos y genotipos más frecuentes del gen PRNP Nivel de Riesgo Polimorfismo RAZAS R1 ARR / ARR Charollais, Bleu de Maine, Bluefaced Leicester, Hampshire, Suffolk, Blackface, Cheviot, Texel R2 AHQ / AHQ ARR / AHQ Bluefaced Leicester, Blackface, Cheviot, Texel AHQ / ARQ Bluefaced Leicester, Blackface, Cheviot, Texel AHQ / ARH ARR / ARH Texel ARR / ARQ* Charollais, Bleu de Maine, Bluefaced Leicester, Texel Blackface, Cheviot, Hampshire , Suffolk VRQ / ARR Blackface, Cheviot, Texel VRQ / ARH Charollais, Bleu de Maine, Texel VRQ / AHQ Blackface, Cheviot, Texel ARQ / ARQ Charollais, Bleu de Maine, Blackface, Cheviot ARQ / ARH ARH / ARH Texel VRQ / VRQ VRQ / ARQ Charollais, Bleu de Maine, Blackface, Cheviot,Texel R3 R4 R5 Grupos de riesgo de adquisición de Scrapie por resistencia / susceptibilidad genética Genotipo Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad ARR / ARR 1 Ninguna restricción para su reproducción ARR / AHQ ARR / ARH ARR / ARQ 2 Ninguna restricción para su reproducción 3 Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso limitado para su reproducción en campos asociados a NSP 4 Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino 5 Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino AHQ / AHQ ARH / ARH AHQ / ARH ARQ / ARH ARQ / AHQ ARQ / ARQ ARR / VRQ ARQ / VRQ ARH / VRQ AHQ / VRQ VRQ / VRQ P C R Determinación de genotipos PCR - ELISA Secuenciación Manual o Automática PCR - RFLP Determinación de las frecuencias de genotipos Frecuencias genotipicas absolutas de la población 90 80 70 Nro. absoluto 60 50 40 30 20 10 0 1 Genotipos ALRQ / ALRQ ALRR / ALRQ ALRR / ALRR ALHQ / ALRQ VLRQ / ALRQ ALHQ / ALHQ ALRH / ALRQ AFRQ / ALRQ ALRH / ALRR ALRH / ALRH AFRQ / ALRR VLRQ / ALRR VLRQ / VLRQ ALHQ / ALRR ALHQ / ALHR VLRQ / ALHQ AFRQ / AFRQ AFRQ / ALHQ VLRQ / ALRH VLRQ / AFRQ VLRH / ALRH VLRH / ALRR AFRR / ALRR ALHR / ALHR ALHQ / ALRH Determinación de las frecuencias de los diferentes alelos 29.00% 0.17% 0.33% 0.83% 3.67% 4.50% 47.33% 9.50% 4.67% Frecuencias Alélicas de la población bajo estudio ALRQ ALRR ALHQ ALRH VLRQ AFRQ ALHR VLRH AFRR Determinación de las frecuencias de los grupos de riesgo Genotipo Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad Porcentaje ARR / ARR 1 Ninguna restricción para su reproducción 16,38 ARR / AHQ ARR / ARH ARR / ARQ 2 Ninguna restricción para su reproducción 25,25 AHQ / AHQ ARH / ARH AHQ / ARH ARQ / ARH ARQ / AHQ ARQ / ARQ 3 Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso limitado para su reproducción en campos asociados a NSP 50,51 4 Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino 1,36 5 Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino 6,48 ARR / VRQ ARQ / VRQ ARH / VRQ AHQ / VRQ VRQ / VRQ Cepas de Scrapie -20 definidas por pasaje en ratón - Nor 98: aislada de casos de campo: Definida por: - Clínica - Histopatología - “R” en 171: susceptible Cepas de BSE 1: Italia BASE: Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy Casalone et al. Proc Natl Acad Sci 101:3065, 2004 2) Francia: 3) Japón?? Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004 “Molecular analysis of ovine prion protein identifies similarities between BSE and an experimental isolate of natural scrapie, CH1641”. Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999 “Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases” Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004 Diagnóstico de EET •Solamente en el post mortem •“Test del tercer párpado” (in vivo) para “scrapie” -Histopatología -Detección de PrP: Inmunohistoquímica SAF Western Blot ELISA Histopatología (Lesión espongiforme) Inmunohistoquímica (Depósitos de PrP) En ovinos SAF: Scrapie Associated Fibrils Medula Oblongata (Región del Obex) 1) Médula espinal 2) Cerebro 3) Región del Obex 4) Area utilizada para WB/ELISA 5) Muestra de elección Tests rápidos BSE -Prionics Check Western -Prionics LIA -TeSeE (BioRad) -CDI InPro - CediTect BSE Test - Enfer TSE Kit version 2.0, automated sample preparation - IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA - Institut Pourquier Speed´it BSE - Prionics Check PrioSTRIP - Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit - Roche Applied Science PrionScreen Scrapie - IDEXX Herdchek - InPro CDI-5 Métodos utilizados en el Programa de Vigilancia de Argentina Métodos de referencia: -Histopatología -Inmunohistoquímica -Western blot Test rápidos: -Western blot (Prionics) - Enfer TSE (ensayo piloto-2003) Algunos métodos en estudio (in vivo) Detección de PrPSc en sangre (Scherr et al., J. Chromat 697: 223, 1997) Unión de PrPSc a plasminógeno en soporte sólido (Fischer et al., Nature 408: 479, 2000) Detección de PrPSc en orina (Shaked et al., J Biol Chem 276: 31479, 2001) “Protein misfolding cyclic amplification” (Saborio et al. Nature 411: 810, 2001) Detección de secuencias cortas de ADN asociadas a EET en sangre ( Schütz et al, Clin Diagn Lab Inmunol. 12 (7): 814-820, 2005) Laboratorio de referencia para el diagnóstico de EET de animales Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas Castelar B. J. Carrillo F.J. Blanco Viera E. L. Weber M. Alegre F. Capellino F. Delgado S. Duffy D. Funes L. Jiménez E. León A. Marcos S. Martínez G. Pinto C. Soto C. Vallejos C.Hirschvogel A. Marcos G. Figueroa S. Carceller A. Elisei GRACIAS