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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA
AMAZONIA PERUANA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
INSTITUTO DE
INVESTIGACIONES DE LA
AMAZONIA PERUANA
Inducción de Embriogenesis Somática
para la producción de semilla no
convencional de Mauritia flexuosa L. f
Bach. Blga Gabyluz Marjorie Vela Panduro
Iquitos - Perú
2005
Introducción
- La región amazónica
cuenta con una gran
biodiversidad de
recursos naturales
de excelente
potencial productivo.
- Problemática: tala de
palmeras hembras.
Soluciones:
- Ensayos de
propagación
empleando semillas
botánicas.
- El carácter dioico del
aguaje limita este tipo
de propagación.
potencial económico
- Búsqueda de técnicas
biotecnológicas:
micropropagación in
vitro vía embriogenesis
somática.
OBJETIVOS
General:
Estandarizar la técnica de embriogenesis
somática a partir de explantes de Mauritia
flexuosa L. f. para la producción de semillas
no convencional.
Especifico:
• Determinar un medio de transporte ideal para
Neumatoforos y Hojas Jóvenes de Mauritia
flexuosa L. f.
• Determinar la concentración optima de
hipoclorito de sodio para la desinfestación
de explantes (neumatoforos y hojas jóvenes)
de Mauritia flexuosa L. f.
• Determinar concentraciones optimas de
fitohormonas para la inducción de
embriogenesis Somática.
UBICACIÓN DE LA ZONA DE COLECTA
La zona de colecta
se
encuentra
ubicado en el km
17.5 de la carretera
Iquitos – Nauta.
MÉTODO:
Ubicación del Laboratorio:
• Se realizo en las
instalaciones del
Instituto Nacional
de Investigación y
Extensión Agraria
(Laboratorio de
cultivo de tejidos)
ubicado en el
asentamiento
Humano San
Roque Nº 209.
PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Colecta:
Planta madre
Neumatoforos
Vela
Extracción de
Neumatoforos
Solución de
transporte
Solución de
transporte
(Hojas)
SOLUCIÓN DE TRANSPORTE:
Tratamientos para determinar la concentración
de la solución de transporte:
Trat
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
Antioxidantes
Ac. Ascórbico+ Ac. Citrico
Ac. Ascórbico + Ac. Citrico
PVP
PVP + sulfato de Adenina
Cisteina.
Ac. Ascor + Ac. Citrico + cisteina.
PVP + cisteina
CC
(mg/l)
100 : 150
600 : 150
600
600 : 160
200
100 : 150 : 200
600 : 200
Limpieza de Neumatoforos y hojas jóvenes de
Mauritia flexuosa L . f.
1º lavado 2 º lavado
Cortes 5-6 cm
Explantes en
agua
destilada
1 lavado
Solución de
transporte
Cortes 5-6 cm
Solución
de
transporte
Desinfestación de Neumatoforos y Hojas
jóvenes de Mauritia flexuosa L . f.
Esterilización de
pinza
3 Enjuagues
Cámara de
flujo laminar
Alcohol al 70 º
NaOCl
Alcohol al 70 º
NaOCl
Esterilización
de pinzas
Explant
en
antioxid
PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
B
C
D
Cl2Ca.2H2O
H3BO3
MnSO4.2H2O
IK
Na2MoO4.2H20
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
ZnSO4.4H2O
FeSO4.7H2O
EDTA
A
10 ml
NH4NO3
KNO3
MgSO4.7H2O
KH2PO4
40 ml
10 ml
10 ml
E
Glicina
Tiamina - HCl
Piridoxina - HCl
Ácido nicotínico
10 ml
Fuente de Carbono
Sacarosa (30 g/l)
Gelificante
Fitagel (3 g/l)
pH: 5.7-5.8
Fitohormonas
* Murashige, T. and Skoog, F., Physiol. Plant., 1962, 15, 473
14
•Tratamientos de fitohormonas para neumatoforos y
hojas jóvenes de Mauritia flexuosa L . f.
TRATAMIENTO
FITOHORMONA
DOSIS (MG/L)
T1
2,4-D
2
T2
2,4-D + k
2 :0.5
T3
2,4-D + K
3:1
T4
2,4-D + K
3.5 : 2
T5
2,4-D + BAP
15 : 5
T6
2,4-D + BAP
30 : 5
T7
2,4-D +AIA +ANA
2 : 4 :1
T8
Picloram
2
T9
Picloram + 2ip
2 : 0.5
T10
ANA + K
2 : 0.5
T11
ANA + K
2.5 : 1
T12
ANA + K
3:1
T13
ANA + BAP+ K
2 : 0.5 : 0.5
T14
2,4,5 T + Floroglucinol
0.5 : 1
T15
2,4,5 T + Floroglucinol
1 : 1.5
T16
AIA + K
2 : 0.5
T17
BAP + K
1 : 0.25
T18
BAP + K
2 : 0.5
Tratamiento de fitohormonas para neumatoforos y
hojas jóvenes de Mauritia flexuosa L . f.
Tratamiento
Fitohormonas
Dosis (mg/l)
T19
BAP + K
3 : 0.75
T20
BAP + K
4:1
Disección y siembra de Neumatoforos de
Mauritia flexuosa L . f.
rodajas
Cámara de
flujo
Cortes transversales
Sellado del tubo
Extracción de
zona suberificada
Neumatoforo dentro del tubo
de ensayo
Disección y siembra de hojas jóvenes de
Mauritia flexuosa L . f.
Hojas en antioxidante
Cortes de 1cm2
Sellado de
tubos
CÁMARA DE INCUBACIÓN
• Los tubos tapados y
sellados
fueron
trasladados
a
la
cámara de incubación
a condiciones de
oscuridad con una
temperatura promedio
de 24°C ± 2 y una
humedad relativa de
70 %
Resultados:
Cuadro N° 1: Tiempo de oxidación en explantes de
Mauritia flexuosa L . f.
Tta.
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
Antioxidante
Agua
Ac. Asco+Ac. Cítrico
PVP
PVP+Sul. de Adenina
Cisteina
Ac. Asc+Ac. Citr+Cist
PVP+Cisteina
C.C.
100:150
600
600:160
200
100:150:200
600:200
Tiempo de
oxidación
(h)
2
72
24
24
6
24
24
Contaminación en Neumatoforos de Mauritia
flexuosa L . f
70
60
60
50
45
40
30
30
20
10
0
T1
T2
T3
Figura Nº 1: Porcentaje de Contaminación en
Neumatoforos de Mauritia flexuosa L . f
Donde:
T1 .= Concentración de NaOCl al 5.25 % x 15 minutos
T2 = Concentración de NaOCl al 5.25 % x 20 minutos
T3 = Concentración de NaOCl al 5.25 % x 30 minutos
Contaminación en Hojas Jóvenes de Mauritia Flexuosa L . f
25
20
20
15
10
10
5
5
0
T1
T2
T3
Figura Nº 2: Porcentaje de Contaminación en
Hojas Jovenes de Mauritia flexuosa L . f
Donde:
T1 = Concentración de NaOCl 1 % x 15 minutos
T2 = Concentración de NaOCl 2 % x 10 minutos
T3 = Concentración de NaOCl 3 % x 5 minutos
Oxidación en Neumatoforos de Mauritia flexuosa L . f
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
84.9
85.78
62.3
T1
T2
T3
Figura Nº 3: Porcentaje de Oxidación en
Neumatoforos de Mauritia flexuosa L . f
Donde:
T1 .= Concentración de NaOCl al 5.25 % x 15 minutos
T2 = Concentración de NaOCl al 5.25 % x 20 minutos
T3 = Concentración de NaOCl al 5.25 % x 30 minutos
Oxidación en Hojas Jóvenes de Mauritia flexuosa L . f
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
79.86
84.66
49.23
T1
T2
T3
Figura Nº 4: Porcentaje de Oxidación en Hojas
Jovenes de Mauritia flexuosa L . f
Donde:
T1 .= Concentración de NaOCl al 1% x 15 minutos + antioxidante
T2 = Concentración de NaOCl al 2% x 10 minutos + antioxidante
T3 = Concentración de NaOCl al 3% x 5 minutos + antioxidante.
Formación de callos en Neumatoforos de Mauritia
flexuosa L . f
BAP + K (2:0.5 mg/l)
BAP + K (2:0.5 mg/l)
BAP + K (2:0.5 mg/l)
BAP + K (2:0.5 mg/l)
BAP + K (3:0.75 mg/l)
BAP + K (3:0.75 mg/l)
BAP + K (4:1mg/l)
BAP + K (4:1mg/l)
Pruebas de contraste para formación de Callos
de Mauritia flexuosa L . f
Cuadro Nº 1: ANVA para la producción de callos
Fuente de
Variación
Grados Suma de Cuadrados Valor de
de
cuadrados
Medios
F cal
Libertad
Factor A
Factor B
AB
Error
1
19
19
760
0.017
0.122
0.122
1.236
Total
799
1.496
0.017
0.006
0.006
0.002
Coeficiente de Variación: 4.01 %
*
***
= Significativo.
= Muy Significativo.
10.4694
3.9388
3.9388
Prob
Sig
0.0013
0.0000
0.0000
*
***
***
Prueba de Duncan
Nº de Tt
Promedio
Sig
T18
T19
T20
T2
1.110
1.050
1.050
1.000
A
B
B
C
T1
T6
T7
T3
T4
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
C
C
C
C
C
Ensayos para diferenciación de callos en
Neumatoforos de Mauritia flexuosa L . f.
Tratamiento
Fitohormonas
Dosis (mg/l)
T1
ANA+BAP+K
2 : 2 : 0.5
T2
ANA+BAP+K
2 : 3 : 0.75
T3
ANA+ BAP+K
2:4:1
T4
2,4-D+BAP+K
2 : 2 : 0.5
T5
2,4-D+BAP+K
2 : 3 : 0.75
T6
2,4-D+BAP+K
2:4:1
Conclusiones:
• Para transportar los explantes (Hojas Jóvenes y
Neumatoforos), del campo al laboratorio se utilizo
Acido Ascórbico + Acido Cítrico 600 : 150 mg/l y un
antifungico ( vitavax 2 g/l).
• Para
controlar
la
contaminación
de
los
neumatoforos se utilizó NaOCl 5.25 % a 30 minutos y
para Hojas Jóvenes 1 % por un tiempo de 15
minutos.
• A mayor tiempo de exposición de los explantes en
NaOCl mayor será el incremento de la oxidación,
sobre todo en Hojas Jóvenes.
• Para la producción de callos se obtuvo mejor
resultado
con
Bencilaminopurina
+
6
furfurilaminopurina (2 : 0.5 mg/l).
• El tiempo de viabilidad de los callos es de
aproximadamente un mes.
• Los células comienzan a proliferar en neumatoforos
a partir 12 a 15 días después haber sido sembrado
en el medio de cultivo.
Recomendaciones:
• En el momento de realizar la
colecta de
neumatoforos tener en cuenta la textura del mismo,
la cual tiene que ser de consistencia dura mas no
blanda.
• Una vez obtenido los callos probar, exponiéndolos a
la luz para ver si hay formación de embrioides.
• Probar medios de cultivos líquidos.
• No utilizar explantes de Hojas para la producción de
callos.
Gracias