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En las primeras décadas de los 1900, los virus
se cultivaban en animales. El ratón y los
monos eran hospederos comunes.
Huevos embrionados inoculados con virus
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1949 Enders, Weller & Robins : Premio Nobel
1954. Cultivaron virus en monocapas de
células de tejido embrionario.
1951 Hopkins,J. : Cultiva línea celular
inmortalizada de Henrietta Lacks que sufría
de cáncer cervical. Creación de células HeLa.
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En platos petri ó frascos:
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Célula 1ria continua: tejido se segrega
Ej. Fibroblastos
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Línea celular diploide W1-38 de pulmón
Línea de epitelio humano ( HeLa)
Línea 1ria de prepucio humano
Línea de fibroblastos de ratón
!Una forma sería estudiando el efecto
citopático! (CPE)
Esto se refiere a los cambios que el virus
provoca en las células. Puede ser en el núcleo
ó en el citoplasma.
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Células redondeadas
Más espacios entre ellas
Grumos y comenzar a sufrir lisis
Formación de un *Sincicio
 * célula grande con muchos núcleos por la fusión
de células
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En Herpes: proliferación en membrana
celular , vacuolas en el citoplasma y
rompimiento de cromosomas en la célula que
infecta, redondeo de células
En Polio: Vacuolas en el citoplasma
En Picornavirus, Rhabdovirus, Adenovirus y
Herpes: Redondeo y desprendimiento de las
células
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1930 Ensayo de placas: Permite estudiar la
multiplicación de bacteriófagos
1975 Dulbecco,R. Premio Nobel:
los virus /animales forman placas de una
manera similar.
Preguntas guías:
 ¿cuántos Virus?
 ¿cómo se miden?
PFU= unidades formadoras de placas
# de placas X factor de dilución
Ej. 17 placas X 10^6
PFU= 1.7 x 10^8
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Cinética de 1 hit= 1 partícula viral es suficiente
para formar 1 placa.
# de placas es proporcional directamente a la
concentración del virus.
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Cinética de 2 hits= se necesitan 2 partículas
para hacer una placa.
NO siempre los virus forman placas…
entonces…
Se puede medir el TCID 50 : mide muerte de las
células en placas de 96 pozos.
Se hacen 10 monocapas de cultivos celulares y
se infectan con diluciones del virus para
identificar el efecto citopático en la mitad de
los cultivos. En las diluciones bajas, todos los
cultivos son infectados.
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http://www.virology.ws/2009/07/13/measureme
nt-of-viruses-by-end-point-dilution-assay/
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#de partículas virales muestra/ # de
partículas infecciosas
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Hemaaglutinación: Se mezclan eritrocitos
con ciertos virus como el de la Influenza y se
unen causando aglutinación.
Aglutinan RBC humanos:
 Influenza
 Rotavirus
Aglutinan RBC de Gansos:
 RabiesVirus
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Influenza: humano
Parainfluenza: humano
Flavivirus: ganso, paloma
Parvovirus: cobayo, humano, cerdo
Poxvirus: Pollo
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Algunos virus poseen la capacidad de
unirse a la membrana de RBC
ocasionando agregados.
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El virus de la influenza en particular es
muy propenso a esta reación.
– De hecho es por eso que su
antígeno más importante, la
Hemaglutinina (HA) se llama
así.
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https://www.google.com.pr/?gws_rd=cr&ei=
ZbYXU7fjJOiw0QHznYCADA#q=hemaglutin
aci%C3%B3n+virus+influenza
– Al dejarse reaccionar, las muestras de
suero que posean anticuerpos contra
el virus de la influenza INHIBIRAN la
aglutinación.
– Los RBC se precipitarán al fondo del
pocillo.
– De no existir anticuerpos específicos
para el virus de la influenza, los
antígenos que agregamos (la HA, en
particular) ocasionará la
AGLUTINACIÓN de los RBC.
– Los RBC aglutinados no precipitan.
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Directa: Ag viral-Abs específicos-fluorocromo
Indirecta: Es más específica porque usa un
2do anticuerpo.
Ag viral-Abs 1rios-Abs2rios-fluorocromo
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Enzyme linked-immuno sorbent assay
http://www.virology.ws/2010/09/30/detectingviral-proteins-in-infected-cells-or-tissues-byimmunostaining/
Para detectar proteínas virales en el suero ó
en la muestra clínica , se usan Abs contra la
Proteína viral .
Se acoplan a placas de 96 pozos
 Se añade la muestra clínica y si laproteína
viral está presente, al añadir Abs ésta se une
y al añadir un Ab 2rio que a su vez esta
conjugado a una enzima como la peroxidasa
de rábano y a un sustrato. Ocurre una
reacción.
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http://www.virology.ws/2010/07/16/detection
-of-antigens-or-antibodies-by-elisa/
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http://www.biology.arizona.edu/immunology
/activities/elisa/elisa1.html
Muy usado para los siguientes virus:
HIV, HTLV. Adenovirus, citomegalovirus,
Papiloma
Separa las proteínas en geles de
poliacrilamida. El sodium dodecyl
sulfate (SDS) es un detergente aniónicoque
alinea las proteínas y le imparte una carga
negativa.
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https://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G
_pC8U
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https://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G
_pC8U
http://www.youtube.com/watch?v=pnBZeL8
nFEo
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Si un virus infecta células, es posible separar
las proteínas virales acopladas a anticuerpos
específicos para esas proteínas en una gel de
poliacrilamida con electroforesis.
La gel es transferida a una membrana con
afinidad a las proteínas separadas.
La gel y la membrana son colocadas entre
papel absorbente para transferir las proteínas
a la membrana por acción capilar.
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 Se puede incubar la membrana con anticuerpos
específicos para la proteína viral conjugados a
una enzima como la peroxidasa de rábano.
 Luego se incuba con un sustrato.
 Las proteínas pueden luego visualizarse con “xrays film”
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http://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6d
BOfs
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Actividad en el salón de clases:
 Estudie el video
 Familarízate con el equipo
 Identifique los componentes y reactivos
principales usados
 Reconocer su Utilidad en la id. de proteínas Virales
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Podría usarse un anticuerpo primario para
que se una a la proteína en la membrana y
luego añadir un anticuerpo 2rio dirigido al 1er
anticuerpo.
Pase a ver diagrama disponible en el blog del
Dr. V. Racaniello
http://www.virology.ws/2010/07/07/virologytoolbox-the-western-blot/
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http://www.youtube.com/watch?v=8RBs0Gh
g_48
http://www.youtube.com/watch?v=LNVdOd
NQyCM
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Separa DNA basado en tamaño
Se transfieren fragmemtos de DNA a gel de
agarosa
Fragmentos pequeños se mueven más rápido
Técnica de Polimerasa en cadena
 Permite amplificar DNA y hacer millones de
copias de la molécula
 Ciclos:
▪ Se eleva la temperatura a 95 grados para separar
cadenas o desnaturalizarlas
▪ Se baja la temperatura a 60 grados para permitir la
unión de los “primers” de DNA.
▪ Lo s “primers”sirven de molde para que la Taq DNA
polimerasa añada nuevas secuencias al terminal 3’..
Esto a 72 grados.
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2 cadenas de DNA doble hélice
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Se repiten los pasos del ciclo 1
 Desnaturalización a 95 grados
 Unión de los primers a 65 grados
 Síntesis de la polimerasas a 72 grados
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4 cadenas de DNA
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Se vuelven a repetir los ciclos anteriores
6 cadenas de DNA dovle cadena con terminal
3’ siempre más largo y 2 cadenas “molde”.
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Repetición de pasos
Continúa el proceso de amplificación
8 moléculas de DNA y 8 primers
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Al final de 30 ciclos habrán millones de copias
del DNA “target”
http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6b
dU
Pirosecuenciación
se basa en controlar el flujo secuencial y cíclico
de nucleótidos sobre una placa en
combinación con un sistema de detección
bioluminiscente que permite convertir los
productos generados durante la
incorporación de nucleótidos (pirofosfato) en
luz (por medio de la luciferasa) que es
detectable por el dispositivo CCD.
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