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Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
Q.F.B
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
ÁREA ESPECÍFICA DE:
MICROBIOLOGÍA
NOMBRE DE LA ASIGNATURA:
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
CÓDIGO:
FAR 315L
FECHA DE ELABORACIÓN:
MARZO 2002
NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR:
FORMATIVO
TIPO DE ASIGNATURA:
DISCIPLINARIA
PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN:
M. C. Nidia Gary Pazos Salazar
M. C. Maria Susana Pérez Fernández
M. C. Oscar Pérez Toríz
M. C. Alejandro Ruíz Tagle
M. C. Carlos Téllez Osorio
M. C. Claudy Lorena Villagran Padilla
HORAS DE TEORÍA: 3
HORAS PRÁCTICA: 2
1
CRÉDITOS: 8
Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
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INDICE
NÚMERO DE LA
PRÁCTICA
PRÁCTICA No. 1
PRÁCTICA No. 2
PRÁCTICA No. 3
PRACTICA NO 4
PRÁCTICA No. 5
PRÁCTICA No. 6
PRÁCTICA No. 7
PRÁCTICA No. 8
PRÁCTICA No. 9
PRACTICA No 10
PRÁCTICA No. 11
PRÁCTICA No. 12
PRÁCTICA No. 13
PRÁCTICA No. 14
PRACTICA No 15
PRACTICA No 16
TÍTULO DE LA PRÁCTICA
PÁGINA
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
DE VIROLOGÍA.
PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN
DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y
APLICACIONES.
PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) PARA EL
DIAGNÓSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA
ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.
PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN
(IHA) PARA EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS
DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.
HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO
PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS.
ENSAYO DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO
FÉRTIL DE POLLO.
REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS
INFECCIOSA AVIAR EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO.
TITULACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS
INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FÉRTIL DE
POLLO.
CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA
REPLICACIÓN DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN,
PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO.
SEMINARIO: OBTENCIÓN DE UN CULTIVO PRIMARIO
DE FIBROBLASTOS DE EMBRIÓN DE POLLO.
PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES
MEDIANTE SUBCULTIVO O PASE 1:2
REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES:
OBSERVACIÓN DE MONOESTRATOS CELULARES
NORMALES Y CON EFECTOS CITOPÁTICOS.
REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN
ESCHERICHIA COLI.
ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL
DIAGNÓSTICO
SEROLÓGICO
DE
VIRUS:
FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES.
ENSAYOS
INMUNOENZIMÁTICOS
PARA
EL
DIAGNÓSTICO DE CITOMEGALOVIRUS, RUBÉOLA,
HEPATITIS B Y HIV.
EVALUACIÓN FINAL
3
2
7
12
16
20
24
28
28
32
37
40
43
47
52
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LABORATORIO DE VIROLOGÍA
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PRACTICA NO. 1
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
VIROLOGÍA
INTRODUCCIÓN
El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas y de la infectocontagiosidad de los viriones, permite definir las normas que en materia de
seguridad, son necesarias para no correr ningún riesgo de adquirir aún en forma
accidental, una infección por este tipo de partículas.
Con base en lo anterior, se enlistan a continuación los reglamentos y normas
que habrán de seguirse en el Laboratorio de Virología, con la finalidad de asegurar
la integridad física de los alumnos, así como para mantener una organización
adecuada para el desarrollo de las prácticas correspondientes.
ƒ
La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se
permitirá el acceso al laboratorio.
ƒ
Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada.
ƒ
Colocar todo los artículos personales en la zona lateral o en los cajones de
las mesa de trabajo.
ƒ
Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón
desinfectante.
ƒ
Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, así
como introducir algún objeto en la boca.
ƒ
La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada.
ƒ
Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de utilizarla.
ƒ
Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo.
ƒ
Comunicarse con sus compañeros solo en la medida indispensable.
ƒ
Antes de iniciar la práctica, leer y recordar la metodología a seguir de acuerdo
con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para
aclararlas.
3
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LABORATORIO DE VIROLOGÍA
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ƒ
Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material,
derramamiento de suspensiones virales, etc.).
ƒ
Todo el material que se va a incubar o desechar, deberá colocarse en el sitio
indicado por el profesor.
ƒ
Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de
desecho
no
contaminado
deberá
depositarse
en
los
contenedores
correspondientes.
ƒ
En forma previa a su lavado, siempre se deberá desinfectar el material que se
le proporcione en el laboratorio.
ƒ
Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo,
sección, equipo, nombre del alumno, así como fecha de entrada y salida.
En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma
Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para
la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y
disposición final de los Residuos Peligrosos biológico-infecciosos que se generan en
establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud.
En la NOM referida, se establecen además definiciones de interés para los
laboratorios y áreas de microbiología, tales como:
Desinfección: Destrucción de microorganismos patógenos en todos los ambientes,
materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecánicos,
físicos o químicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de
transmisión de enfermedades.
Residuo peligroso biológico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros
microorganismos con capacidad de causar infección o que contiene o puede
contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a
seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de
atención médica.
En adición, se consideran residuos
siguientes:
4
peligrosos biológico-infecciosos los
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ƒ
La sangre
ƒ
Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos
ƒ
Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación,
así como los generados en la producción de biológicos
ƒ
Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos
ƒ
Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e
histológico
ƒ
Los residuos anatómicos derivados de la atención a pacientes de los
laboratorios
ƒ
Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploración y toma
de muestras
ƒ
Los objetos punzo cortantes usados o sin usar
ƒ
Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clínicas
durante el diagnóstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas,
pipetas Pasteur, agujas hipodérmicas, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes,
cajas de Petri, cristalería entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo
y similares.
Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, deberán
ser tratados por métodos físicos o químicos, los cuales:
ƒ
Deberán garantizar la eliminación de microorganismos patógenos
ƒ
Deberán volver irreconocibles a los residuos peligrosos biológico-infecciosos
ƒ
Deberán ser cremados, si se trata de residuos patológicos.
El cumplimiento de las consideraciones señaladas con anterioridad, garantiza
la seguridad que deberá observarse tanto para alcanzar los objetivos de las
prácticas, como para su desarrollo en condiciones asépticas.
Finalmente y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en
esta primera sesión de laboratorio se hará énfasis en que a través de las diferentes
prácticas, se utilizarán únicamente suspensiones virales de tipo vacunal destinadas
para uso veterinario, con la finalidad de evitar el más mínimo riesgo de infección
hacia los estudiantes.
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CUESTIONARIO
1. Con ayuda de un esquema especifique, cuál sería el manejo que se la daría a
materiales como jeringas, portaobjetos, pipetas, tubos y material con residuos de
tejidos, desde que han sido utilizados para el análisis de virus hasta su destino final.
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PRACTICA No. 2
PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA
HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES
Desde el descubrimiento de los virus, se identifico que de acuerdo a sus
características moleculares, estos agentes requieren del empelo de modelos vivos
para su análisis; esta condición hace particularmente difícil implementar el uso de
sistemas adecuados como son el uso de animales de laboratorio o los modelos de
Células en Cultivo. De esta manera se hizo necesaria la búsqueda de alternativas
para el análisis de virus que omitieran la necesidad de modelos vivos.
PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA).
Inicialmente, la HA se aplicó para el análisis del virus Influenza, sin embargo
como explicaremos más adelante, se puede aplicar para realizar ensayos sobre
cualquier virus con proteínas estructurales con propiedades hemaglutinantes. El
nombre de Hemaglutinación se debe al hallazgo de que los virus Influenza podían
aglutinar eritrocitos, posteriormente se determinó que el origen de esta propiedad se
debía a la existencia de una glicoproteína presente en la envoltura viral a la cual se
le denominó como hemaglutinina.
Actualmente se sabe que una gran cantidad de virus poseen proteínas
externas con estas características por lo que el método tiene una amplia
aplicabilidad en el análisis de diferentes entidades virales.
También se descubrió que la hemaglutinina tiene el papel de funcionar
precisamente como el ligando viral encargado de reconocer al receptor en las
células blanco. De manera general, el receptor corresponde a las moléculas de
ácido siálico presente sobre la superficie de diversos tipos celulares, aun que
dependiendo del virus esta molécula puede estar enlazada en diferentes tipos de
enlaces químicos.
A este respecto cabe resaltar que la función de la hemaglutinina no es
entonces aglutinar eritrocitos, más bien es participar en el primer paso de la
replicación viral que es la adsorción, pero sus propiedades sirven para desarrollar la
prueba de HA que se utiliza como un ensayo in vitro.
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Para empezar a conocer la prueba de HA, se hace necesario describir las
ventajas y desventajas que ofrece.
Ventajas:
Š
Prueba sencilla de desarrollar.
Š
No requiere de una infraestructura complicada.
Š
Es económica.
Š
Ideal cuando se manejan muestras con alta carga viral.
Š
Se aplica en los ensayos para la determinación de la naturaleza química
de los receptores celulares.
Desventajas:
Š
Se emplea sólo como diagnóstico presuntivo.
Š
Existen agentes no virales que pueden causar HA.
Š
Es poco sensible.
Š
Genera falsos negativos.
El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la existencia
de virus con proteínas con capacidad hemaglutinante que reconocen receptores
celulares. De esta manera los virus se unirán a los eritrocitos de la especie que sea
siempre que contenga en su superficie moléculas de ácido siálico. La prueba se
representa en el siguiente esquema:
|
ERITROCITO
ERITROCITO
Virus con proteínas
Hemaglutinantes
HEMAGLUTINACIÓN
Para la realización de esta prueba se requiere tomar una muestra que
contenga virus, como ejemplo tenemos: stocks virales provenientes de lotes
vacunales o de cosechas obtenidas de células en cultivo; muestras de origen clínico
tomadas de acuerdo a la zona anatómica que afecta el virus, tal es el caso del virus
influenza donde la muestra a tomar corresponde a un lavado faríngeo.
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Para procesar la muestra se preparan diluciones seriadas al doble
empezando desde la dilución 1:10 hasta la dilución 1:1280 empleando como
diluyente una solución amortiguadora de fosfatos. Posteriormente a cada dilución se
le adiciona la misma cantidad de una suspensión de eritrocitos preparada al 1%.
Todo esto se realiza en tubos de fondo en U o en microplacas de fondo en U. Los
eritrocitos aglutinados sedimentarán en el fondo del pozo formando una red,
mientras los no aglutinados sedimentan por gravedad. De acuerdo a la forma del
pozo se forma una dona o un anillo en el centro. Los sedimentos se aprecian de la
siguiente manera:
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
Una prueba de HA positiva implica la sospecha de un virus presente en la
muestra, sin embargo la determinación exacta del virus involucrado en una patología
es aún incierta. Por esta razón como siguiente paso se debe aplicar una prueba que
permita la plena identificación del tipo de virus, a este respecto se cuenta con una
prueba serológica.
PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA)
Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que
demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta
está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se
conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la
hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el
receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce
como neutralización vírica.
La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera:
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Primera fase: Reconocimiento Ag-Ac.
Virus con
proteínas
hemaglutinantes
Anti-HA
Neutralización viral
Segunda fase: Interacción con eritrocitos: demostración de la IHA.
ERITROCITO
NO EXISTE
RECONOCI
MIENTO
La existencia de anticuerpos que puedan reconocer a cepas virales
específicas permite diagnosticar plenamente que un virus en particular es el
responsable de alguna patología. Esto basándose en un principio fundamental de
inmunología: La presencia de anticuerpos en un hospedero es la consecuencia de
la exposición previa al antígeno que induce entonces su producción.
Para esta prueba la muestra es el suero del hospedero sobre el que se
realizan diluciones seriadas también con factor dos como en HA pero iniciando de la
dilución 1:2 hasta alcanzar la de 1:256.
Cada dilución del suero se incuba con 4 Unidades Hemaglutinantes de un
virus conocido, durante 10min. para permitir el reconocimiento.
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Transcurrido este tiempo, se adiciona una suspensión de eritrocitos al 1 %. Al igual
que para HA la prueba se efectúa en microplacas o tubos con fondo en U. De esta
manera los patrones de sedimentación para los resultados positivos y negativos se
observan de la siguiente manera:
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
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PRACTICA No. 3
PRUEBA DE HEMAGLUTINACION (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO
PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL NEWCASTLE
INTRODUCCIÓN.
Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el
genoma viral capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar
puentes entre los glóbulos para constituir una red. Este fenómeno conocido como
Hemaglutinación fue primeramente descrito para el análisis del virus Influenza. En
este caso la proteína hemaglutinante (hemaglutinina) en la superficie del virión es
una glicoproteína que en adición de la Neuraminidasa se proyecta en la envoltura
viral. El virión se unirá a cualquier eritrocito de la especie que sea siempre que lleve
los receptores complementarios que en este caso son moléculas de Acido NAcetilNeuramínico.
El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro del grupo de los
Paramyxovirus; es un patógeno primario de aves en quienes produce infecciones
respiratorias y digestivas con trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a
parálisis y muerte; en el humano puede
ocasionalmente producir conjuntivitis
autolimitada.
Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar
aglutinación, por lo que la Hemaglutinación no es
un indicador sensible de la
presencia de pequeñas cantidaes de viriones pero por su simplicidad constituye un
ensayo conveniente si se dispone de grandes cantidades de viriones.
OBJETIVOS:
1. El alumno dominará el manejo de la técnica de la reacción de
Hemaglutinación (HA).
2. El alumno determinará la concentración de viriones presentes en una
suspensión, la cual expresará en Unidades Hemaglutinantes (UHA).
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MATERIAL
ƒ
Solución reguladora de fosfatos SRF.
ƒ
Microplacas de poliestrireno con fondo en U.
ƒ
Espejo.
ƒ
Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl.
ƒ
Puntillas para micopipeta.
ƒ
Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET)
ƒ
Suspensión de glóbulos rojos al 1%.
ƒ
Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.
ƒ
Solución de Hipoclorito de Sodio.
ƒ
Alcohol y algodón.
ƒ
Tina para recolectar desechos.
METODOLOGÍA
1. Realizar con SRF una serie de diluciones del virus a partir de una suspensión
concentrada (vacuna viral), con factor de dilución 2, desde 1:10 hasta 1:1280, de
acuerdo al esquema de la figura 1; incluir un tubo control que no contendrá virus.
El proceso se describe a continuación:
a Agregar al pozo No. 1 de la microplaca 180 µl de SRF y del 2 al 9
agregar 100 µl.
b Colocar en el pozo 1 20 µl de la suspensión viral (vacuna) y mezclar
por aspersión y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la
dilución 1:10.
c
Transferir 100 µl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente
de la misma manera que para el paso b.
d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que
corresponderá a la dilución 1:1280.
e Desechar
del
pozo 8 100 µl en el recipiente para recolección de
desechos.
f
NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución viral al pozo No. 9
que sirve como control.
2. Agregar a todos los pozos 100 µl de una suspensión de glóbulos rojos de pollo al
1%.
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3. Agitar la microplaca y dejar reposar a temperatura ambiente el sistema hasta que
los eritrocitos del pozo 9 hayan sedimentado.
PATRONES DE SEDIMENTACIÓN
1. Los glóbulos rojo normales se asientan en el fondo del pozo formando un botón,
mientras que los glóbulos rojos aglutinados forman una malla homogénea.
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
2. Determinar el título de la muestra, identificando la última dilución en que se
presenta una reacción de HA evidente, que corresponderá entonces a 1 UHA por
volumen.
3. Identificar la dilución que contiene 4 UHA.
VACUNA
CONTRA
NEWCASTLE
e) Desechar 100 µl
c y d) Transferir seriadamente 100 µl de cada
dilución al siguiente pozo
b) 20 µl
Pozo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Fig. No 1. Realización de las diluciones virales
Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones
Pozo
a)SRF (µl)
Dilución
2) Eritrocitos
al 1% (µl)
1
180
1.10
100
2
100
1:20
100
3
100
1:40
100
4
100
1:80
100
5
100
1:160
100
14
6
100
1:320
100
7
100
1:640
100
8
100
1:1280
100
9
100
Control
100
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CUESTIONARIO
1.- Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba
de HA.
2.- Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la
prueba de HA.
3.- Porqué es importante determinar la dilución que contiene 4 UHA.
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PRACTICA No. 4
PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA
EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD
DEL NEWCASTLE
INTRODUCCIÓN
La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no
específico de infección por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva
no nos permite asegurar que este virus sea el agente causal.
Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que
demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta
está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se
conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la
hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el
receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce
como neutralización vírica.
OBJETIVOS
1. El alumno desarrollará la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación para
determinar el título de un suero problema.
2. El alumno será capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar la
prueba de IHA.
MATERIAL
ƒ Solución reguladora de fosfatos SRF.
ƒ
Microplaca de poliestireno con fondo en U.
ƒ
Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl.
ƒ
Puntillas para micopipeta.
ƒ
Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET),
preparada en una suspensión con 4 UHA.
ƒ
Suspensión de glóbulos rojos al 1%.
ƒ
Suero problema.
ƒ
Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.
ƒ
Solución de Hipoclorito de Sodio.
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ƒ
Alcohol y algodón.
ƒ
Tina para recolectar desechos.
METODOLOGÍA
Con base en los resultados de la práctica anterior, preparar en un tubo una
dilución del virus del Newcastle que contenga 4 UHA en un volumen suficiente para
realizar la prueba de IHA.
Ejemplo:
a Resultado de la práctica de HA:
Dilución 1:20 de la vacuna viral = 4 UHA
b Volúmen suficiente para realizar IHA= 2ml
Entonces.....
100 µl
+
1900 µl
_________
2000 µl de dilución con 4 UHA
Vacuna viral concentrada
SSI
Volúmen final
1. Hacer diluciones al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo
al esquema de la figura 2; incluir un pozo control que no contendrá antisuero ni
virus. El proceso se describe a continuación:
a Agregar 75 µl de SSI a los pozos del 1 al 9 de la microplaca.
b Colocar en el pozo 1 75 µl del suero problema y mezclar por aspersión
y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:2.
c Transferir 75 µl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente
de la misma manera que para el paso b.
d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que
corresponderá a la dilución 1:256.
e Desechar
del
pozo 8 75 µl en el recipiente para recolección de
desechos.
f
NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución del suero al pozo
No. 9 que sirve como control.
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2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del antígeno viral
en un volumen de 75 µl.
3. Agitar la microplaca para que reaccionen los sutratos y dejar en reposo durante 10
min.
4. Agregar 75 µl de la suspensión de glóbulos rojos a todos y cada uno de los pozos,
agitar y colocar la microplaca a temperatura ambiente hasta que los glóbulos rojos
del pozo que no contiene antisuero y sirve como control haya sedimentado.
5. Determinar el título del antisuero identificando la última dilución que presenta IHA.
PATRONES DE SEDIMENTACIÓN:
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
Fig. No. 2 Diluciones seriadas del suero problema
e) Desechar 75 µl
SUERO
PROBLEMA
c y d) Transferir seriadamente 75 µl de cada dilución al
siguiente pozo
b) 75 µl
Pozo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones
Pozo
a)SSI (µl)
Dilución
2) 4 UHA
1
75
1.2
75
4) Eritrocitos
al 1% (µl)
75
2
75
1:4
75
3
75
1:8
75
4
75
1.16
75
5
75
1:32
75
6
75
1:64
75
7
75
1:128
75
8
75
1.256
75
9
75
Control
-----
75
75
3) INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 10 MIN
75
75
75
75
18
75
75
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LABORATORIO DE VIROLOGÍA
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CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado negativa en la prueba
de IHA?
2. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado positivo en la prueba
de IHA?
3. Conjuntando las pruebas de HA e IHA, ¿Cómo explica un resultado negativo
en la prueba de HA con uno positivo en la prueba de IHA? y ¿Cuál es el
diagnóstico final que daría después de analizar ambas pruebas?
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PRACTICA No. 5
HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO PARA EL
CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS. (1ª. Parte)
INTRODUCCIÓN
.
Los embriones se han utilizado como el huésped natural para el crecimiento
de los virus, propagación y caracterización de los virus aviares y para la producción
de vacunas virales.
El embrión y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de células
necesarias para el cultivo de diferentes tipos de virus, depende sobre todo de varias
condiciones:
1.- Vía de inoculación
2.- Edad del embrión
3.- Periodo de tiempo de incubación
4.- Volumen y dilución del inóculo utilizado
5.- Temperatura de incubación
6.- El estado inmune de la parvada por el cual los embriones son obtenidos
Manejos preliminares.
La utilización de huevo fértil en el laboratorio, no debe ser obtenida de
parvadas infectadas con agentes virales conocidos u otros agentes microbianos.
Después de 4 a 5 días de incubación cuando el embrión puede ser observado
fácilmente, estos son ovoscopeados para determinar cuales son fértiles. La
incubación es alrededor de 37° C y una humedad de 60 a 70% (un alto exceso de
humedad permite un subdesarrollo de la cámara de aire, por lo tanto una baja de
humedad permitirá que halla un desarrollo menor). Los embriones deben estar en
movimiento varias veces al día, ya sea automáticamente o manualmente, el periodo
de incubación antes de la inoculación depende sobre todo de la vía de inoculación.
Ovoscopeo.
El ovoscopeo consiste en revisar los huevos embrionados contra una fuente
de luz intensa
en un ovoscopio, de esta manera mostrara el embrión, las
membranas asociadas y las cavidades del embrión se observan fácilmente.
20
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LABORATORIO DE VIROLOGÍA
Q.F.B
1.- En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el
movimiento, las condiciones de las venas de sangre y el estado del embrión. Notar
las diferencias con los embriones de diferentes edades.
2.-Con un lápiz, marcar la posición del embrión y la cámara de aire (esta área es
mantenida arriba en el ovoscopio).
3.- Comparar los embriones fértiles y los embriones muertos de varias edades,
descartar los embriones infértiles y muertos.
Estructura del huevo embrionado.
Justo bajo el cascarón se encuentra una membrana fibrosa que se disemina a
través de la superficie interna del embrión y forma la cámara de aire en el extremo
ancho del huevo. Esta membrana en conjunto con el cascarón ayudan al intercambio
de gases en el huevo. Esta distribución de gases se facilita por la membrana
corioalantoidea altamente vascularizada que sirve como órgano respiratorio del
embrión. Esta membrana se forma de manera adyacente a la membrana del
cascarón y forma una cavidad conocida como saco alantoideo que contiene entre 5
a 10 ml de fluido alantoideo. El embrión se encuentra envuelto por la membrana
amniótica formando el saco amniótico que contiene entre 1 y 2 ml de fluido
amniótico. El embrión se encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de
nutrientes y se encuentra localizado aproximadamente al centro del huevo.
Técnicas y/o vías de inoculación.
Las cuatro vías más comunes para la inoculación del huevo embrionado fértil son:
La vía de saco alantoideo
La vía de saco vitelino
La vía de membrana corioalantoidea (MCA)
La vía de saco amniótico.
En situaciones de diagnóstico donde hay un agente no especifico que es
sospechoso, es conveniente utilizar muchas vías como sean posibles. Si una
elección ha sido hecha, la vía MCA es preferida a causa de su sensibilidad a un gran
numero de virus y porque es menos probable para afectarse por contaminación
bacteriana.
Saco vitelino.
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La inoculación en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y propagación
del virus de encefalomielitis aviar. Los embriones inoculados por esta vía, son
generalmente incubados de 10 a 13 días postinoculación.
Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones al término del periodo
de incubación es parálisis de patas. Si los embriones se dejan nacer, a partir del
tercer día de nacidos se pueden observar pollos que se sientan en las patas, no se
mueven bien y algunos caen hacia los lados. Aparece un ligero pero rápido temblor
del cuello y de la cabeza, que especialmente se nota cuando los pollitos afectados
se mantienen en la mano.
Cavidad alantoidea.
La inoculación de embriones en saco alantoideo es utilizada para el
aislamiento y propagación de los Paramyxovirus, Myxovirus y Coronavirus. Los
embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días
postinoculación.
Las lesiones que se presentan en los embriones por los Paramyxovirus y los
Myxovirus es que pueden llegar a causar la muerte de los embriones, siempre y
cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero tanto los Paramyxovirus como
los Myxovirus normalmente se evalua a través de fluido alantoideo de los embriones
y no tanto por las lesiones. En el fluido alantoideo lo que se tiene que hacer es una
prueba de hemoaglutinación con glóbulos rojos de ave al 5 % para determinar la
presencia de hemoaglutininas en dicho fluido, que no es otra cosa más que la
formación de grumos de color rojo rodeados por espacios transparentes fácilmente
visible.
Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones por los Coronavirus
son enanismo, encorvamiento, desarrollo anormal de la pluma y depósitos de uratos
en riñones.
Membrana corioalantoidea (MCA).
La inoculación de embriones en MCA es utilizada para el aislamiento y pases
de Poxvirus y virus Herpes. Los embriones inoculados por esta vía son incubados
durante 7 días postinoculación.
Las lesiones que presentan los embriones por los virus Herpes y Poxvirus es
principalmente en la membrana. Presencia de áreas focales (pústulas) engrosadas
con necrosis o un engrosamiento generalizado de la membrana.
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LABORATORIO DE VIROLOGÍA
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Saco amniótico.
La inoculación de embriones en saco amniótico es utilizada para el
aislamiento inicial de los Myxovirus. Los embriones inoculados por esta vía, son
generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación.
Las lesiones que se presentan en los embriones por los Myxovirus son hemorragias
generalizadas en todo el embrión y pueden llegar a causar la muerte, siempre y
cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero también se evalúa por la
presencia de hemoaglutininas que se encuentran en el fluido alantoideo del embrión.
Intravenosa
La inoculación por esta vía no tiene aplicación amplia para el estudio de
infecciones
experimentales
en
embriones
de
pollo.
El
procedimiento
es
generalmente empleado para estudios hematológicos. Embriones de 10 a 15 días de
edad son los mas adecuados para esta vía. La cantidad de inóculo puede variar de
0.2 a 0.5 ml.
Intracerebral.
La inoculación puede ser realizada con embriones de 8 a 14 días de edad y el
inóculo es de 0.1.a 0.2 ml. Esta vía puede ser empleada en estudios de alteraciones
patológicas del cerebro. Los virus de herpes simple y rabia pueden ser cultivados
por esta vía.
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PRACTICA NO. 6
ENSAYOS DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO FÉRTIL DE
POLLO
INTRODUCCIÓN
El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema
sensible para el cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con los
animales de laboratorio empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo fértil
ofrece diversas ventajas tales como:
ƒ
Son estériles.
ƒ
No tienen funciones inmunológicas desarrolladas.
ƒ
No son costosos.
ƒ
Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica
en
comparación
con
otros
sistemas
biológicos,
tales
como
el
mantenimiento y reproducción de Cultivos Celulares.
El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves
sanas ALPES, aves libres de patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés,
para de esta manera eliminar la presencia de virus que comúnmente afectan a las
aves como Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc.
Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar
la viabilidad del embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de
inoculación debido a la especificidad que presentan algunos viriones por
determinadas células o tejidos. En la figura 3 se presenta en esquema de las
diferentes zonas que conforman a un huevo fértil.
Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto
del huevo fértil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema
biológico empleado.
24
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4
3
1 Cavidad
Alantoidea
5
2 Saco de Aire
3 Saco Amniótico
2
4 Saco Vitelino
5 Membrana
Corioalantoidea
1
Fig.3 Vías de inoculación en huevo fértil de ave.
OBJETIVOS:
1. El alumno determinara al ovoscopio la viabilidad del embrión.
2. El alumno dominará las técnicas comúnmente utilizadas para la inoculación de
huevos fértiles de ave.
3. El alumno diferenciara las estructuras embrionarias observando la organización
de los tejidos fuera de su cutícula.
MATERIAL:
ƒ
Huevos fértiles de ave de 10 días de inoculación (+/- 1 día), calidad ALPES.
ƒ
Ovoscopio y pinzas de disección
ƒ
Recipiente para recibir desechos
ƒ
Charola porta embriones
ƒ
Perforadores, bulbos y lápiz.
ƒ
Jeringas de insulina
ƒ
Agujas de 20 x 38 mm.
ƒ
Colorantes
ƒ
Guantes
25
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DESARROLLO:
I.- CONFIRMACIÓN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIÓN
Trasluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio.
Un embrión no viable puede reconocerse a través de:
ƒ
Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna
de la cutícula.
ƒ
Falta de irrigación.
ƒ
Falta de movimiento.
ƒ
Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general
contaminación bacteriana.
II.- TÉCNICAS DE INOCULACIÓN
A
Cavidad alantoidea
a Trasluminar el huevo fértil con ayuda del ovoscopio.
b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del limite de la cámara de aire
del lado contrario al embrión y en una zona escasamente irrigada.
c
Perforar la marca señalada.
d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ángulo
de 45 grados con respecto al huevo fértil de ave.
B
Saco vitelino
a Localizar la parte más alta del embrión sobre la cámara de aire y marcar con
un punto o cruz.
b Marcar otro punto o guía que indicara la localización del embrión.
c
Perforar la marca señalada
d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinación opuesta a la
localización del embrión
C
Membrana corioalantoidea
a Localizar la parte más alta de la cámara de aire y marcar un punto o cruz (*).
b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localización del embrión en
un área con la menor irrigación posible.
c
Perforar ambas marcas.
d Succionar con un bulbo de goma a través del punto marcado en la primera
posición (*), creando así una cámara de aire falsa en la parte media del
embrión.
26
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e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina o tuberculina en el lugar
que se desarrollo la cámara de aire falsa.
En estos ensayos, se emplearan colorantes para las diferentes inoculaciones
con el objetivo de facilitar la visualización del sitio donde se pretendió depositar un
volumen determinado de colorante. Una vez realizada la técnica, se abrirán los
huevos fértiles de ave para analizar si la vía elegida fue efectivamente inoculada,
vertiendo el contenido del embrión sobre cajas de Petri.
CUESTIONARIO
1. De acuerdo con lo observado después de abrir los embriones de pollo y
según la vía de inoculación empleada; esquematice para cada vía, cuales
zonas deben quedar teñidas y cuales no, si la inoculación se realizó
correctamente.
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PRACTICAS NO. 7 y No.8
REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR
EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO (1ª Parte) TITULACIÓN DEL VIRUS
DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FÉRTIL
DE POLLO (2ª Parte).
INTRODUCCIÓN
Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros
mamíferos daños severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable
es que esta interacción induzca una protección inmunológica al individuo como
consecuencia del reconocimiento de antígenos específicos tanto en forma natural
como artificial. En el caso de medidas profilácticas, con el empleo de vacunas se
procura inducir una Inmunidad Adquirida Activa Artificial.
Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de
la vacuna. Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede
efectuar en sistemas biológicos tales como huevos fértiles de ave que pueden
responder a la infección viral dando lesiones características del virión inoculado que
afecte directamente al embrión y le produce signos tales como músculos distróficos,
enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y líquidos extraembrionarios donde
se pueden observar hemorragias, formación de placas o pústulas así como
determinar la presencia de hemaglutininas virales.
Los virus vacunales o de campo pueden titularse en conjunto de huevos
fértiles de ave cuando producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al
50% (DLEP50) o en el caso de virus hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al
50% (DIEP50) empleando la reacción de Hemaglutinación de los fluidos cosechados.
OBJETIVOS
1. El alumno dominara las técnicas para propagar y titular una cepa vacunal de
virus.
2. El alumno determinará la DLEP50 para la vacuna del Virus de la Bronquitis
Aviar (VBA), calculando sus concentración por unidad de volumen.
MATERIAL
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ƒ
Huevo fértil de ave de 10 dias de incubación (+/- 1 dia) calidad ALPES.
ƒ
Vacuna de VBA. INTERVET
ƒ
Solucion salina de Dulbecco
ƒ
Lápiz, pegamento blanco y perforadores
ƒ
Hisopos estériles, tintura de yodo.
ƒ
Estufa a 37°C.
ƒ
Ovoscopio.
ƒ
Jeringas de insulina.
ƒ
Mechero.
ƒ
Recipiente para desechos.
DESARROLLO:
1. Realizar con solucion salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna
viral desde 10-1 hasta 10-6 a partir de una suspensión concentrada.
2. Trasluminar el huevo fértil de ave y seguir la técnica de inoculación para
cavidad alantoidea
3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculación con tintura de
yodo antes y después de perforar
4. Inocular 0.1 ml de las cuatro ultimas diluciones en cada uno de 5 embriones
de 9 a 11 días de incubación (20 embriones en total), vía cavidad alantoidea.
5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforación con una gota de pegamento
blanco
6. Marcar con lápiz sobre cada embrión la dilución y vacuna inoculadas
7. Incubar a 37°C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los
embriones al ovoscopio, señalando en el primer dia los embriones que
resulten muertos por traumatismo
8. Al termino de la incubación,trasluminar los embriones al ovoscopio y realizar
un recuento de embriones vivos y muertos.
9. Anotar los resultados obtenidos y realizar los cálculos para determinar la
DLEP50 / 0.1 ml empleando el metodo de Reed & Muench, con base en el
siguiente ejemplo
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RESULTADOS DEL RECUENTO DE EMBRIONES VIVOS Y MUERTOS
DILUCION
EMBRIONES
MUERTOS
VIVOS
INOCULADOS
-3
5
4
1
-4
5
3
2
-5
5
2
3
-6
5
1
4
1) ACUMULADOS
2) ACUMULADOS
3) RADIO DE
4) PORCENTAJE
MUERTOS
VIVOS
MORTALIDAD
10
1
10 / 11
90.9
6
3
6/9
66.6
3
6
3/9
33.3
1
10
1 / 11
9.09
10
10
10
10
CALCULOS
Para una mejor explicación, se desgloza a continuación la realización de los cálculos
para cada columna:
1) Realizar la suma acumulada de embriones muertos desde la dilución mas alta
hasta la mas baja.
2) Realizar la suma acumulada de embriones vivos desde la dilución mas baja a
la mas alta.
3) Calcular el cociente dado por los acumulados muertos sobre la suma de
acumulados muertos mas acumulados vivos de cada dilución.
CALCULAR EL VALOR DE INTERPOLACIÓN (V.I.)
% Positividad > 50% - 50%
V.I. =
66.6 – 50.0
=
% Positividad > 50% - % Positividad < 50%
16.6
=
66.6 – 33.3
33.3
V.I. = 0.49
Multiplicar el logaritmo negativo del radio de dilución por el valor de interpretación
para así calcular el valor de interpolación corregido.
Para este caso:
log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49 = V.I.C.
30
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Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de mortalidad
En el ejemplo: 10-4 y 10-5
Estimar la DLEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor
al 50% de efecto.
En el ejemplo : 10-4 + (-0.49) = 10-4.49 = DLEP50
El titulo se obtiene con el inverso de la DLEP50.
Finalmente:
Titulo = 104.49
CUESTIONARIO
1. Además de la titulación viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote
vacunal antes de salir al mercado.
2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra
viral.
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PRACTICA No.9
CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA REPLICACIÓN
DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN, PROLIFERACIÓN Y
MANTENIMIENTO
En 1949 John Enders, Thomas Séller y Frederick Robbins descubrieron que
el poliovirus podía cultivarse en células de origen no neuronal, lo que les valió el
premio Nobel en Fisiología y Medicina en 1954. Desde entonces, Los cultivos
celulares reemplazaron a los animales de laboratorio convirtiéndose en el principal
método para la propagación de virus y son utilizados en prácticamente todos los
campos de la bio-medicina.
Un Cultivo Celular (CC), es entonces un modelo biológico conformado por un
grupo de células con características específicas que se mantienen adecuadamente
bajo condiciones
in vitro. En este sentido deberemos entender que las células
deben ser obtenidas a partir de un tejido vivo y para su mantenimiento y propagación
in vitro, requieren de medios de cultivo especiales que provean de los nutrientes que
cubran sus necesidades de crecimiento, tal y como se encontraban en sus
condiciones originales.
Para la preparación de un CC se puede considerar el siguiente orden.
1) El tejido se obtiene del modelo original, que puede ser en un caso, cualquier
tejido sano de algún animal, por ejemplo, células epiteliales de intestino,
embriones de rata, etc. En otro caso los CC provienen de tejido anormal que
se puede obtener directamente de tumores cancerosos o bien de tejidos que
inicialmente son normales y que por exposición a algún mutágeno se
transforman en el laboratorio.
2) Las células que se obtienen inicialmente de los tejidos se disocian en una
suspensión celular mediante métodos mecánicos, como maceración. De esta
manera, se tienen trozos de tejido, más pequeños que el original, pero sin
células individuales. Para disgregar a las células, el procedimiento continúa
con una….
3) Digestión con enzimas proteolíticas.
4) Centrifugación
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5) Las células se suspenden en un medio de cultivo y se colocan en recipientes
o placas de plástico, conforme las células se dividen van cubriendo la
superficie. Las células de fibroblastos o epiteliales se adsorben al plástico y
van formando una monocapa, mientras que células como las sanguíneas o
los linfocitos, sedimentan pero no se adhieren.
6) El medio adecuado para las células consiste de una solución isotónica de
sales, glucosa, vitaminas, coenzimas y aminoácidos mantenidos en buffers a
un pH entre 7.2 y 7.4 Y se complementan con antibióticos para inhibir el
crecimiento microbiano. Frecuentemente se adicionan diferentes tipos de
suero para proveer a las células de una fuente rica de factores de crecimiento
Existen principalmente tres tipos de cultivos celulares:
O Cultivos celulares primarios
O Cepas celulares diploides
O Líneas celulares continuas
Dado que el desarrollo de una línea celular es un proceso costoso, la gran mayoría
de líneas celulares de amplia utilización, son depositadas en y distribuidas desde
centros de reposición. Existen unos pocos de estos centros en el mundo, el principal
en EEUU es el American Type Culture Collection (ATCC). Algunos ejemplos de
líneas celulares que se distribuyen con origen y calidad certificados ATCC son: Vero
E-6, Vero C-76, BHK-21, MDCK, MDBK, HEp-2 entre otras.
Además del análisis viral, los Cultivos Celulares pueden emplearse en
diferentes áreas y aplicaciones como: Actividad y flujo intracelular, movimientos del
RNA, de proteínas etc. Ecología celular, Interacciones celulares, Inmunología,
Ingeniería de proteínas, Estudios de diferenciación y desarrollo celular, Aplicaciones
diagnósticas. Medicina, Farmacología,etc.
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RECONOCIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO DE CELULAS
INFECCION VIRAL
CAMBIO MORFOLÓGICO
EFECTO CITOPATICO
(ECP)
Sin cambio aparente:
ƒ Hemadsoción
ƒ Hemaglutinación.
ƒ Interferencia
Alargamiento
TIPOS DE EFECTO CITOPATICO
Vacuolización
Monocapa confluente de células
Redondeamiento
Cuerpos de inclusión
Lisis
Formación de sincitios
35
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HEMADSORCIÓN
Virus con HA
Eritrocitos con el
receptor adecuado
Monocapa confluente
de células
INTERFERENCIA
A
Muestra presuntiva de Rubéola
Sin efecto aparente
Línea celular
B
Infección con Rinovirus
Redondeamiento
Línea celular
C
Infección con Rinovirus
Interferencia
Línea celular, previamente
infectada con Rubéola
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PRACTICA No.11
PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE
SUBCULTIVO O PASE 1:2
INTRODUCCIÓN
El
diagnóstico
de
laboratorio
de
las
infecciones
virales
requiere
frecuentemente del aislamiento de virus en cultivos celulares. Para tal efecto,
monocapas celulares son inoculadas con un espécimen clínico adecuado y entonces
son observadas para detectar cambios citológicos inducidos por la reproducción de
virus.
El término
efecto citopático (ECP) es aplicado para indicar los cambios
celulares que inducidos por virus, son observables al microscopio óptico. Estos
cambios incluyen el redondeamiento o lisis de células, la formación de células
gigantes multinucleadas (sincitios) y la producción de inclusiones en el núcleo y
citoplasma de células infectadas.
La obtención de cultivos de células eucarióticas en el laboratorio de Virología,
es una de las mayores contribuciones históricas para toda el área de las ciencias
naturales, en especial para la Biología Celular y Molecular. La labor de los
investigadores que sentaron estas bases, ha sido reconocida con el otorgamiento de
varios premios Nobel en Fisiología y Medicina.
Con base en lo anterior, resulta conveniente conocer el procedimiento de
reproducción de cultivos celulares a través de un subcultivo o pase en relación 1:2,
ya que de esta manera, se pueden obtener monocapas de células en cultivo para la
reproducción de virus en condiciones de laboratorio.
OBJETIVO
Realizar un subcultivo in vitro de células eucarióticas para promover su
proliferación por división mitótica y obtener monoestratos celulares.
MATERIAL Y EQUIPO
ƒ
Gabinete de bioseguridad
ƒ
Incubadora con fuente de CO2
ƒ
Microscopio con circuito cerrado de televisión
ƒ
Medidor de pH
ƒ
Pipeteador automático
ƒ
Bomba de vacío
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ƒ
Equipo de esteriliación por filtración
ƒ
Etanol al 70%
ƒ
Cultivo celular MRC-5
ƒ
Frascos para cultivo celular de 25 cm2
ƒ
Medio para cultivo de células Mínimo Esencial (MEM)
ƒ
Suero fetal de ternera
ƒ
Solución de tripsina en regulador de pH de Dulbecco
ƒ
Agua desmineralizada
DESARROLLO
1. Desinfectar el área de trabajo en el interior del gabinete de bioseguridad con
etanol al 70%.
2. Introducir todo el material y equipo que se empleara en el proceso y encender
la luz ultravioleta por espacio de 30 minutos, evitando observar en forma
directa la fuente de radiación.
3. Apagar la luz ultravioleta y encender la iluminación convencional del gabinete
de bioseguridad.
4. Disolver en condiciones asépticas, el medio mínimo esencial en agua
desmineralizada y ajustar el pH a 7.0
5. Esterilizar el medio de cultivo por filtración con vacío a través de una
membrana con diámetro de poro de 0.22 micrometros.
6. Decantar el medio del frasco de cultivo original que contiene células
MRC-
5.
7. Agregar 2.0 ml de solución de tripsina y dejar interaccionar con las células
durante 30 segundos; retirar el exceso de la solución de tripsina.
8. Incubar a 37° C durante 5 a 10 minutos; observar al microscopio que las
células se hayan redondeado (disgregación celular).
9. Añadir al frasco de cultivo con las células disgregadas, 14 ml de medio para
cultivo celular adicionado de 5% de suero fetal de ternera y homogenizar por
pipeteo hasta formar una suspensión celular homogénea.
10. Dispensar 7 ml de la suspensión celular obtenida a cada uno de dos frascos
estériles para cultivo celular.
11. Incubar a 37° C en la incubadora con una concentración de 5% de CO2,
durante 24 a 48 horas.
38
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12. Observar al microscopio que en ambos frascos de cultivo se tenga una
confluencia del 100% (monoestrato celular).
13. Cambiar el medio de cultivo celular, por un medio de mantenimiento que solo
contenga 0.5 % de suero fetal de ternera, hasta el momento de emplear el
cultivo de células MRC-5 para la reproducción de virus.
CUESTIONARIO
1.
¿Que significa confluencia?
2.
¿Que función tiene el Suero de ternera adicionado al medio de cultivo para
células?
3.
¿Explique el efecto que produce la adición de tripsina a la monocapa celular?
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SESIÓN No. 12
REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIÓN
DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS
CITOPÁTICOS
INTRODUCCION.
Entre los modelos disponibles para el estudio de virus, encontramos a los
animales de laboratorio, el embrión de pollo y los cultivos celulares. Estos últimos
ofrecen ventajas como la reproducibilidad de los resultados, la diversidad de virus
que pueden ser analizados y sobre todo la posibilidad de conocer los diferentes
eventos que ocurren dentro de ese compartimiento esencial para la supervivencia
del virus, la célula. Debido a estas propiedades las células en cultivo representan el
estándar de oro para la validación de pruebas efectuadas tanto en investigación
como a nivel industrial para la producción y control de calidad de vacunas.
Su mayor limitante recae en el alto costo de la infraestructura requerida para
su implementación, situación que vuelve inaccesible su aplicación en el diagnóstico
clínico de rutina.
La técnica consiste en inocular una muestra de prueba sobre células en
monocapa, que posteriormente se incuban bajo condiciones adecuadas efectuando
un observación diaria de los cambios presentados. Los cambios que son
perceptibles
como
modificaciones
morfológicas
en
la
célula,
inducidos
y
característicos de cada virus analizado se conocen como Efecto Citopático ECP.
Existen diferentes tipos de ECP como: redondeamiento, alargamiento, formación de
Sincicios, vacuolización, cuerpos de inclusión, lisis, etc. En algunos casos el ECP
presentado es tan característico que se relaciona con un solo tipo de virus, en otros,
la diversidad de virus que inducen a un mismo ECP merece la aplicación de otras
técnicas. Sin embargo el modelo de Cultivos Celulares se requiere para el primo
aislamiento de los virus a partir de un espécimen dado.
OBJETIVOS
1.- El alumno valorará la importancia de los cultivos celulares para el aislamiento de
virus.
2.- El alumno será capaz de determinar la presencia de virus en una muestra
reconociendo el ECP inducido en células en monocapa.
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MATERIAL Y REACTIVOS
ƒ
2 Botellas de 25 cm2 con células en monocapa con un 80% de confluencia.
ƒ
Inóculo viral (Vacuna viral, muestra clínica, stock viral)
ƒ
Microscopio invertido.
ƒ
Campana de Flujo Laminar.
ƒ
Estufa de incubación con 5% de CO2
ƒ
Micro pipetas con volumen variable de 20-200 µl y de 100-1000 µl.
ƒ
Puntillas amarillas y azules estérilizadas.
ƒ
Solución Salina de Fosfatos (SSF) estéril.
ƒ
Pipetas Pasteur esterilizadas.
ƒ
Pipetas de 5 y 10 ml esterilizadas
ƒ
Plancha de agitación.
ƒ
Medio Mínimo Esencial (MME) esterilizado por filtración.
ƒ
Suero fetal de ternera esterilizado por filtración.
DESARROLLO
1. Revisar en el microscopio invertido la integridad de la monocapa celular de
las dos botellas.
2. Asignar una de las botellas como control y la otra como botella de prueba.
3. Decantar el medio de cultivo de ambas botellas.
4. Adicionar 7 ml de SSF a cada una de las botellas y lavar las células,
aspirando y dispensando por pipeteo la SSF sobre las monocapas. Desechar
la solución y repetir el procedimiento dos veces más.
5. Adicionar 500 µl de MME a la botella control y 500 µl del inóculo viral a la
botella de prueba.
6. Colocar ambas botellas en la plancha de agitación y mantener a temperatura
ambiente por una hora.
7. Adicionar a cada botella 5 ml de MME complementado con 0.5% de suero de
ternera e incubar a 37° C dentro de una estufa de CO2 en posición horizontal.
8. Observar diariamente, la botella control debe mantener la integridad de la
monocapa mientras en la botella de prueba se presentan cambios
morfológicos.
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9. Registrar los cambios especificando el tiempo en que se presentaron los
primeros cambios morfológicos y a cual de los ECP conocidos corresponde.
CUESTIONARIO
1. Cite tres ejemplos de ECP, los virus que los producen y el tipo de cultivo
celular en que se presentan.
2. Además del ECP, de que otra manera se puede mostrar la infección de un
virus empleando como modelo las células en cultivo.
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PRACTICA No. 13
REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN
ESCHERICHIA COLI.
Introducción
Las bacterias son huéspedes de un grupo particular de virus denominados
bacteriófagos o simplemente fagos. Los fagos constituyen modelos ideales para
estudios sobre la infección a nivel celular, la relación huésped parásito, la
multiplicación viral y estudios de ingeniería genética. Por otro lado, también son muy
útiles en la tipificación de cepas bacterianas.
En los bacteriófagos lisogénicos, también denominados temperados, el genoma del
fago se replica sincrónicamente con el genóforo bacteriano, pasando a la progenie
cada vez que la bacteria se divide por fisión binaria. En este estado lisógenico, los
fagos integrados al genóforo bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su
separación. Estos genes permiten a la bacteria lisógenica expresar nuevas
actividades y producir diferentes proteínas.
El genoma del fago lisógenico puede modificar la estructura del polisacárido
bacteriano y su antigenicidad, así como codificar la producción de toxinas
bacterianas que causan enfermedades tales como la difteria, la escarlatina, el
botulismo y el síndrome urémico hemolítico.
Por otra parte, los bacteriófagos líticos o virulentos se replican dentro de la bacteria
huésped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos líticos más
extensamente estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con
la letra T y diferentes números (bacteriófagos de la serie T). Los fagos virulentos al
destruir a las bacterias producen placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en
cultivos sobre placas de agar.
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Objetivo
El alumno aprenderá a desarrollar bacteriófagos en el laboratorio y conocerá su
importancia en la Microbiología.
Material y equipo
•
Incubadora bacteriológica
•
Pipeteador automático
•
Pipetas Pasteur
•
Pipetas serológicas de 1 y 5 ml
•
Tubos de ensaye de 13 x 100
•
Gradillas
•
Asa bacteriológica
•
Cajas Petri
•
Suspensión de bacteriófago T2
•
Cultivo en caldo de Escherichia coli
•
Etanol al 70%
•
Solución salina fisiológica
•
Agar cerebro corazón
•
Caldo cerebro corazón
Desarrollo
1. Prueba cualitativa:
a) Siembre una placa de agar cerebro corazón, depositando en la superficie 0.2 ml
de una suspensión de Escherichia coli, que será el huésped específico del fago.
b) Enseguida distribuya el inóculo homogéneamente con un asa bacteriológica.
c) A continuación, marque 4 puntos separados en el reverso de la misma caja y en
cada uno deje caer una gota de suspensión del fago T2, utilizando una pipeta
Pasteur.
d) Incube a 37º C por 24 hrs.
e) Observe las áreas circulares sin crecimiento de la bacteria, equivalentes a zonas
de bacterias lisadas por replicación del fago.
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II. Prueba cuantitativa por dilución en placa:
a) Haga diluciones de una suspensión del fago de la siguiente manera: En un tubo
estéril coloque 0.5 ml de la suspensión del fago, más 4.5 ml de caldo cerebro
corazón.
b) Transfiera 0.5 ml a otro tubo conteniendo 4.5 ml de solución salina fisiológica (S.
S. F.) y continúe haciendo diluciones con S. S. F. hasta obtener una dilución de
1:1000 000.
c) De cada dilución del fago, transfiera 0.1 ml a tubos que contengan 0.1 ml de
Escherichia coli. Mezcle e incube a 37º C por 20 min.
d) Al cabo de este tiempo adicione a cada tubo 4 ml de agar cerebro corazón
“blando” (0.5%), mezcle y vacíe en cajas de Petri estériles con agar cerebro corazón.
e) Deje solidificar e incube a 37º C durante 24 hrs. Determine las placas líticas o
calvas y cuéntelas.
f) Para calcular el número de partículas virales / ml, cuente el número de placas
líticas en las cajas de cultivo que presenten pocas calvas y emplee la siguiente
fórmula:
UFP / ml = PV x FD
Donde:
PV = número de placas virales
FD = Factor de dilución
UFP / ml = unidades formadoras de placas por ml de suspensión original del fago.
Cuestionario
1. Anote Usted un ejemplo de bacteriófago temperado
2. En que mecanismo de recombinación genética entre bacterias se involucra la
participación de bacteriófagos
3. Realice un esquema en donde se representen los principales componentes
estructurales de los bacteriófagos de la serie T
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4. Investigue Usted el porque ciertas cepas de Escherichia coli son capaces de
producir colitis hemorrágica
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PRACTICA No. 14
ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL DIAGNÓSTICO
SEROLÓGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y
LIMITACIONES
El diagnóstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que
se enfrenta la medicina actual ya que para estos agentes, una cosa es lo que
idealmente deseamos tener y otra la realidad con la que contamos. Durante las
últimas décadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores herramientas para
evidenciar las etiologías de tipo viral, hace posible que estas entidades se puedan
descubrir y estudiar no sólo a nivel de laboratorios especializados, sino también en
los de diagnóstico de rutina.
¿Qué es lo ideal?
™ Identificar plenamente el agente viral.
™ Resultados en corto tiempo.
™ Una sola prueba.
¿Cuál es la realidad?
™ No se hace diagnóstico directo del agente viral (descarte).
™ Se requiere la complementación entre la clínica y el laboratorio.
™ Recurrir al análisis por pruebas pares.
Diagnosticar si una infección es de etiología viral es muy importante porque
determina un cambio en la conducta clínica y en el manejo terapéutico del
paciente, además de que ayuda a realizar un seguimiento clínico de la entidad.
Llevada con ética, esta actitud impacta social y económicamente, puesto que la
administración oportuna del tratamiento correcto reduce aspectos como el tiempo de
hospitalización y directamente el gasto a familiares.
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PRUEBAS SEROLÓGICAS
Al igual que la mayoría de los microorganismos, los virus se pueden
descubrir ya sea de una forma directa o indirecta. Las pruebas directas son las que
evidencian al virus o algunos de los antígenos virales que se pueden encontrar
presentes en los tejidos o fluidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se
utilizan con más frecuencia y básicamente demuestran un contacto del huésped con
el agente viral mediante la determinación de anticuerpos específicos contra el virus.
En el laboratorio clínico se cuenta con las pruebas serológicas que tanto de
forma directa e indirecta son la principal herramienta que se aplica en el diagnóstico
viral. En estos ensayos se aprovechan las características fisicoquímicas de los
anticuerpos, así como su especificidad. Los principales aspectos a considerar son:
¾ Se pueden detectan antígenos virales.
¾ Se pueden valorar anticuerpos con especificidad antiviral en el paciente.
¾ Requiere del análisis de sueros pares. En muestras tomadas con periodos de
separación de 10-14 días, un incremento de 4 veces o más en el título de la
segunda muestra con respecto a la primera, es considerado significativo para
una infección viral en curso.
¾ Puede diferenciar entre infecciones primarias y crónicas. La presencia de Ig
M específica es más rápido y detectable a pocos días del inicio de la
enfermedad
Las pruebas serológicas con mayor aplicación en el diagnóstico clínico viral son:
9
INMUNOFLUORESCENCIA
a) Directa (Antígenos virales)
b) Indirecta (Anticuerpos de respuesta)
9
ENSAYOS ENZIMÁTICOS
a) Directo (Antígenos)
b) Indirecto (Anticuerpos de respuesta)
9
WESTERN-BLOT
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ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS: ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent
Assay)
ELISA Directo
Ensayos de captura del antígeno (sandwich). Son inmunoensayos en fase
sólida donde se fijan los anticuerpos específicos para el virus en la superficie de una
matriz, tubo o microplaca y luego se pone en presencia del suero o muestra que
contiene el antígeno que se quiere demostrar; una vez que ocurre la reacción
antígeno-anticuerpo, se hace un lavado y se agrega un anticuerpo marcado (Fig
1A).
En la técnica ELISA el anticuerpo se marca con una enzima que puede ser la
fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rábano (PR) y para revelar la reacción se
coloca el sustrato específico para la enzima que es modificado por ésta y produce
un compuesto coloreado. En el caso de la FA el sustrato es el paranitrofenilfosfato y
para la PR es el peróxido de hidrógeno en una solución de ortofenilendiamina
(OPD) que hace visible la reacción. Para la cuantificación se mide la absorbancia en
una longitud de onda determinada en un espectrofotómetro. La absorbancia será
directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra.
Estas técnicas se utilizan ampliamente en el diagnóstico de hepatitis A y B,
rotavirus, el agente Norwalk, parainfluenza, influenza A y B. Para la hepatitis B la
demostración de antígeno de superficie diagnóstica la infección activa así como el
estado de portador; el diagnóstico de rotavirus con este método ayuda a obtener un
resultado rápido en niños menores de dos años con cuadros diarreicos, donde este
virus es el principal causante de dichos cuadros; por otro lado para VIH la
demostración del antígeno p 24 es útil en el diagnóstico de la infección en niños y en
pacientes que se encuentran en ventana inmunológica y además es de gran utilidad
en el pronóstico y la progresión de la infección así como en el control de la terapia
antirretroviral.
ELISA Indirecto
Estas técnicas serológicas se emplean para determinar la existencia de
anticuerpos contra determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposición al
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agente produce una respuesta por parte del sistema inmune que genera la
producción de anticuerpos específicos.
La prueba ELISA indirecta tiene un principio semejante al de ELISA directa, en
este caso, un antígeno específico está unido a una fase sólida que puede ser un
tubo, microplaca o perlas de vidrio; luego se añade el suero del paciente que posee
los anticuerpos y después se adiciona el conjugado constituido por un antianticuerpo IgG o IgM unido a una enzima; posteriormente se adiciona el sustrato
específico para la enzima, que lo va a modificar y produce un compuesto coloreado,
cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en el suero del
paciente (Fig. 1B).
Esta prueba se utiliza ampliamente; más aún, con el advenimiento y la
disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo de 1 a
2 horas. Su utilidad en virología es básicamente para determinar anticuerpos contra
antígenos específicos del virus dengue, herpesvirus, VIH, sincitial respiratorio,
Citomegalovirus, rubéola, hepatitis A, B y C principalmente, y en infecciones por
Virus Epstein-Bar se usa para demostrar marcadores serológicos tempranos de la
infección, que se pueden utilizar en el manejo de huéspedes inmunocomprometidos.
La especificidad de las pruebas de ELISA, depende de la calidad de los
sustratos adsorbidos en la fase sólida, lo cual se aprecia principalmente en los
diferentes tipos de ELISA indirecto donde de acuerdo con el antígeno que se utilice
la prueba puede ser:
a. De primera generación
Son pruebas incipientes donde se utilizan antígenos crudos sin mayores
procesos de purificación, como p.e., el virus completo inactivado, es el caso de las
primeras técnicas de ELISA para VIH. Sin embargo, estos ensayos presentaban
como resultado muchas reacciones inespecíficas.
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Marcaje
Marcaje
Anticuerpo secundario
Anti-IgG
Antígeno viral
Anticuerpo en la
muestra (IgG o IgM)
Anticuerpo de captura
Antígeno viral
Fase sólida
Fase sólida
A) ELISA Directo
B) ELISA Indirecto
Fig. 1. Diagrama esquemático de las pruebas de ELISA
b. De segunda generación
En este caso los antígenos son proteínas recombinantes, que se producen
mediante ingeniería genética en bacterias y son sometidas a procesos de
purificación lo que da más especificidad a la prueba pues se descubren anticuerpos
particulares contra las proteínas consideradas más inmunogénicas.
c. De tercera generación
Son las más utilizadas actualmente y las más específicas, donde se emplean
péptidos sintéticos (fabricados en un sintetizador en el laboratorio) con secuencias
más específicas del virus: tal es el caso de las pruebas diseñadas para determinar
sólo anticuerpos contra VIH2 y VIH1.
En otra modalidad de ELISA se usa el sistema biotina/avidina-estreptavidina,
método que se fundamenta en sistemas con distintos marcadores unidos a la
biotina y demostrados por reacciones enzimáticas, de color o quimioluminiscentes
que portan la avidina, la estreptavidina o la biotina. La biotina ligada a un
anticuerpo, nucleótidos, proteína o lecitina, se une a una molécula blanco que
puede ser anticuerpo (indirecta) o antígeno (directa), la avidina o estreptavidina se
marcan con una molécula demostrable como una enzima, una sustancia
fluorescente o un metal.
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PRACTICA No. 15
ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE
CITOMEGALOVIRUS, RUBÉOLA, HEPATITIS B Y HIV.
ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO INDIRECTO DE FASE SÓLIDA (EIA), PARA LA
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LOS VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA
HUMANA (HIV).
INTRODUCCIÓN
El virus de inmunodeficiencia humana (HIV) es un retrovirus, identificado en
1983 como el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
(SIDA).
Aunque se trata de un síndrome, es decir, un conjunto de signos y síntomas, y
no de una sola enfermedad, por ser valido y más sencillo de aquí en adelante nos
referimos al SIDA como enfermedad. Por lo pronto no existe tratamiento ni vacuna
contra el virus, por lo que una vez que se desarrolla, casi inexorablemente, a la
muerte en un tiempo muy corto.
En nuestro país, el informe, descripción y análisis de esta singular
enfermedad, ha sido objeto de múltiples actividades académicas, clínicas, e incluso
culturales. A partir de abril de 1987, el SIDA se convirtió en una enfermedad sujeta a
vigilancia epidemiológica; la notificación de los casos tiene carácter de obligatoria e
inmediata.
Hasta ahora se conocen dos variables genéticas del virus, en función del
antígeno de superficie que los clasifica en VIH-1 y VIH-2. Para el VIH-1 la
glicoproteína externa es la gp120 y la de transmembrana es la gp41; para el VIH-2 la
gp externa es la 140 y la de transmembrana es la gp36.
Desde que se reconocieron los primeros casos de SIDA, una de las primeras
líneas de investigación ha sido lo referente a la transmisión del virus; conociéndose
hasta el momento las siguientes vías:
1. Sexual: homosexual, heterosexual.
2. Sanguínea: transfusión de sangre y/o hemoderivados.
3. Perinatal: durante el embarazo, en el parto, después del parto (leche materna).
Para el diagnostico de VIH se cuenta con:
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Métodos directos (determinan estructuras de los virus), como:
ƒ
Aislamiento del virus en cultivos celulares
ƒ
Detección de antígenos virales con anticuerpos monoclonales
ƒ
Reacción en cadena de la polimerasa
ƒ
Hibridización con sonda de DNA marcadas
Métodos indirectos (donde se valoran anticuerpos contra el virus), como:
ƒ
Pruebas de Inmunoenzayo enzimatico (ELISA)
ƒ
Aglutinación pasiva con partículas de látex
ƒ
Inmunoelectrotransferencia (Western-Blot)
OBJETIVO:
El alumno aprenderá una de las técnicas empleadas para el diagnostico de
infección por los virus del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (SIDA)
MATERIAL Y REACTIVOS:
ƒ
Equipo Inmuno Comb HIV 1+2 PBS-Orgenics
ƒ
Micropipetas con puntillas para 25, 50 y 100 µl
ƒ
Tijeras
ƒ
Perforador
ƒ
Reloj
ƒ
Papel desechable
ƒ
Sueros problema
ƒ
Sueros control positivo y negativo
ƒ
Solución de hipoclorito de Sodio
METODOLOGÍA
o Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de
los sueros problema, control positivo y negativo
o Deposito de muestra. Compartimiento A.
Deposite por separado 50 µl de los sueros dentro de cada pozo del
compartimiento A perforando la cubierta de papel aluminio y descargando la
muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente contenido en
el compartimiento A mediante carga y descarga del a solución en varias
ocasiones. Utilice una puntilla por cada muestra y deséchela
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Desarrollo de la prueba
o Reacción antígeno-anticuerpo.
Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa
apuntando hacia usted. Reinserte el peine varias veces para mover las
burbujas de aire. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.
Al final de la incubación extraiga el peine del compartimiento y seque el
líquido sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y
perfore con las pinzas el papel que cubre los pozos del siguiente
compartimiento.
NOTA: Este último procedimiento se repetirá siempre antes de pasar de un
compartimiento a otro.
o Lavado. Compartimiento B
Inserte el peine en el compartimiento B, para lograr un lavado adecuado
mueva el peine hacia atrás y adelante durante un periodo 2 min.
o Conjugado. Compartimiento C.
Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces.
Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.
o Lavado. Compartimiento D.
Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.
o Lavado. Compartimiento E.
Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.
o Reacción de color. Compartimiento F
Inserte el peine dentro del compartimiento F; Reinserte el peine varias veces
durante 10 min. a temperatura ambiente.
o Detección de la reacción. Compartimiento E.
Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E, después de 1 min. retire el
peine y séquelo al aire completamente.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento de está prueba?
2. ¿Cuándo se dice que el paciente es seropositivo?
3. ¿Cuál es la diferencia entre un paciente seropositivo y uno con SIDA?
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4. ¿Cómo se puede prevenir el SIDA?
5. ¿Cómo se trata la enfermedad del VIH?
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ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE
ANTICUERPOS IgG CONTRA EL VIRUS DE LA RUBÉOLA EN EL SUERO O
PLASMA HUMANO.
INTRODUCCIÓN
El virus de la rubéola es miembro de la familia Togavirus. La familia está
formada por un grupo de agentes virales pequeños que contienen ácido ribonucléico
en su genoma y una envoltura lipídica, de donde deriva la palabra “toga”.
Es considerable el avance alcanzado en el conocimiento del virus de la
rubéola a partir de que se logro cultivar in vitro en 1962. Esto condujo a la posibilidad
de hacer estudios moleculares del virus, de estudiar la infección y su replicación.
El virus de la rubéola es sensible al éter y fácilmente inactibable por agentes
químicos y por radiación ultravioleta; es relativamente termolábil, perdiendo su in
efectividad si permanece durante una hora a 37ºC, mientras que es capaz de
mantener su viabilidad a temperatura de refrigeración si se encuentra en una
solución que contenga proteínas. Son partículas esféricas y de diámetro de 60 a 70
micras; posee una nucleocápside rodeada de doble membrana lipídica con espículas
con capacidad hemaglutinante, se cultiva en varios tipos de líneas celulares,
principalmente las provenientes de mono (RK-13, VERO y AGMK).
El único resrvorio del virus de la rubéola es el humano y la enfermedad se
propaga por medio de las secreciones faríngeas, la orina, líquido cefalorraquideo y
sangre de personas infectadas, tengan o no síntomas clínicos, desde varios días
antes de aparecer el exantema y hasta después de una semana, manifestándose
con una multitud de formas clínicas posibles desde la infección inaparente, hasta un
cuadro clínico clásico de exantema linfadenopatía y fiebre. Puede haber
complicaciones de tipo meningoencefalítico.
La enfermedad es endémica en todo el mundo y aparece en epidemias
periódicas, principalmente en la infancia, aunque es más frecuente en los adultos,
común entre los estudiantes universitarios.
El período de incubación es de 14 a 21 días con un promedio de 17 días.
En los adultos la enfermedad puede presentarse en forma más severa, con
poliartralgias tan frecuentes que se consideran típicas de la enfermedad.
La infección posnatal es benigna, en contraste con la infección prenatal,
particularmente si ocurre durante las primeras 16 semanas del embarazo. Las
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consecuencias de la rubéola in utero son variadas e impredecibles y pueden variar
desde la afectación severa con muerte fetal, en nacimientos vivos con
malformaciones evidentes o en productos normales sin evidencia clínica de la
infección.
El diagnostico de la rubéola puede establecerse en base a dos
procedimientos: virológico que se refiere al cultivo del virus a partir de muestras del
paciente y el serológico que se refiere a la demostración de anticuerpos que se han
adquirido como resultado de la infección, existen varios métodos tales como la
fijación del complemento, hemaglutinación, hemólisis en gel aglutinación en latex,
anticuerpos fluorescentes, métodos inmunoenzimaticos, radioinmunoanálisis y gran
variedad de pruebas especificas para detección de IgM.
La vacuna HPV 77 (Meyor-Parkman)es preparada en cultivo celular de
embrión de pato y está indicada en niños desde 1 año hasta la pubertad.
OBJETIVO
El alumno aprenderá el manejo de la técnica del ensayo inmunoenzima´tico
indirecto de fase sólida (EIA), empleada para el diagnóstico de anticuerpos Ig G
contra el virus de la rubéola.
MATERIAL Y REACTIVOS
ƒ
Equipo Inmuno Comb II para la rubeola IgG
ƒ
Micropipetas con puntilla 10, 25 y 100 ul
ƒ
Perforador
ƒ
Tijera.
ƒ
Reloj
ƒ
Papel desechable
ƒ
Sueros control
ƒ
Suero problema
ƒ
Hipoclorito de Sodio.
METODOLOGIA
Pre dilución de muestras y controles.
1. Para cada muestra y control. Colocar 100 ul de diluyente de la muestra de cada
microtubo.
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2. Añadir a cada microtubo 10ul de la muestra o del control positivo o negativo
Mezcle cargando y descargando repetidamente la solución con la pipeta.
-Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de los
sueros muestra, control positivo y negativo.
-Depósito de muestra. Compartimiento A.
Deposite por separado 20 ul de los sueros problema y controles de cada pozo
de compartimiento A, perforando la cubierta de aluminio con el perforador y
descargar la muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente
contenido en el compartimiento A mediante carga y descarga de la solución en
varias ocasiones.
-Reacción Ag-Ac.
Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa
apuntando hacia usted. Reinserte la tarjeta varias veces para remover las burbujas
de aire. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación extraiga el peine de compartimiento y seque el líquido
sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y perfore con el
perforador el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento.
NOTA: Este último procedimiento se repetirá siempre antes de pasar de un
compartimiento a otro.
-Lavado. Compartimiento B.
Inserte el peine en el compartimiento B e incube por 2 minutos, para lograr un
lavado adecuado, mueva periódicamente el peine hacia atrás y adelante durante la
incubación.
-Conjugado. Compartimiento C
Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte e peine varias veces para
remover las burbujas de aire. Incube durante 20 min. a temperatura ambiente.
- Lavado. Compartimiento D.
Inserte el peine en el compartimiento D e incube por 2 min., para lograr un lavado
adecuado mueva periódicamente el peine hacia atrás y hacia delante durante la
incubación.
-Lavado. Compartimiento E.
Repetir el procedimiento como para el compartimiento D.
- Reacción de color. Compartimiento F.
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Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte el peine varias veces para
remover las burbujas de aire. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.
- Detección de la reacción. Compartimiento E.
Vuelva a insertar el peine al compartimiento E. Después de 1 min. retire el peine y
séquelo al aire completamente.
CUESTIONARIO.
1.- ¿Cuál es el fundamente de esta prueba?
2.- ¿Cuál es la diferencia entre rubéola congénita y neonatal?
3.- Mencione mecanismos de prevención y tratamiento para la rubéola.
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ENSAYO INMUNOENZIMATICO PARA LA DETERMINACIÓN DEL ANTIGENO DE
SUPERFICIE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B (AgsHB).
INTRODUCCIÓN
La hepatitis viral es una enfermedad generalizada que afecta principalmente al
hígado. Es causada por los siguientes agentes:
1. Virus de la Hepatitis A (agente causal de la hepatitis infecciosa)
2. Virus de la Hepatitis B (asociado a la hepatitis sérica)
3. Virus de la Hepatitis C (causa de muchos casos de hepatitis postranfucional)
4. Virus de la Hepatitis D requiere de la presencia de del VHB. Asimismo, se ha
identificado el agente causal de otra de las formadas de la antes llamada
hepatitis no A-no B
5. Virus de la Hepatitis E
Otros virus que tambien pueden ser agentes causales de la Hepatitis se
encuentran: virus Epstein Bar, rubéola, citomegalovirus, coxsakie, varicela zoster
entre otros.
El virus de la Hepatitis B pertenece al grupo hepadnavirus y su transmisión es
vía parenteral (sangre y derivados, fomites contaminados por el virus). Al virus se le
conoce como partícula DANE, presente diversos antigenos que estimulas
anticuerpos, lo cual se utiliza en el diagnostico de la enfermedad, este puede
detectarse de manera completa (virión completo) o en partes del mismo, la cubierta
proteínica se determina antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y la
partícula interna antígeno core (o central) de la hepatitis B (HBcAg). Resiste la
temperatura a 37ºC por 1 hora, 60ºC por 10 horas, 25ºC por una semana, 100ºC un
minuto y 20ºC por 5 años. El hipoclorito de sodio al 0.5 % lo inactiva en 3 minutos.
La infección tiene un periodo de incubación de 60 a 180 días; su comienzo es
insidioso, con poca o ninguna fiebre. Pudiendo presentarse a cualquier edad.
OBJETIVO
1. El alumno aprenderá el manejo de la técnica del Ensayo inmunoenzimático
indirecto de fase sólida (EIA), empleado para el diagnostico de HBsAg.
MATERIAL Y REACTIVOS
ƒ
Equipo Inmuno Comb II para HBsAg
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Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
Q.F.B
ƒ
Micro pipetas con puntillas para 10, 25, y 100 ul
ƒ
Estufa a 37ºC
ƒ
Tijeras
ƒ
Perforador
ƒ
Reloj
ƒ
Papel desechable
ƒ
Suero problema
ƒ
Suero control positivo y negativo
ƒ
Solución de hipoclorito de sodio
METODOLOGÍA
Š
Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de los
sueros problema, control positivo y negativo.
Š
Deposito de muestra compartimiento A.
Deposite por separado 75 ul de los sueros problema, control positivo y
negativo dentro de cada poza del compartimiento A (cada una por separado en el
pozo A correspondiente para cada muestra), perforando la cubierta de papel
aluminio con el perforador y descargando la pipeta con la muestra en el fondo del
pozo. Mezcle vaciando y cargando repetidamente la solución con la pipeta. Deseche
la punta de la pipeta.
Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa
apuntando hacia usted. Reinserte varias veces para remover las burbujas de aire,
incube por 30 minutos a 37ºC.
Al final de la incubación extraiga el peine del compartimiento y seque el
liquido sobre nadante con el papel desechable y perfore el papel que cubre los
pozos del siguiente compartimiento.
NOTA: Este ultimo procedimiento se repetira siempre antes de pasar de un
compartimiento a otro.
Š
Lavado. Compartimiento B
Inserte el peine en el compartimiento B e incube por dos minutos; para lograr
un lavado adecuado mueva periódicamente el peine hacia atrás y adelante durante
la incubación.
Š
Enlace anti-HBs. Compartimiento C.
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Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
Q.F.B
Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces para
remover las burbujas de aire. Incube durante 20 minutos a 37ºC.
Š
Reacción con fosfatasa alcalina. Compartimiento D.
Inserte el peine en el compartimiento D. Reinserte el peine varias veces para
remover las burbujas de aire. Incube durante 20 minutos a 37ºC.
Š
Lavado. Compartimiento E.
Inserte el peine en el compartimiento E y agite vigorosamente por 2 minutos,
moviendo el peine hacia atrás y adelante.
Š
Reacción de color. Compartimiento F.
Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte varias veces igual que en
A, e incube durante 10 minutos a 37ºC.
Š
Detección de la reacción. Compartimiento E
Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E. Después de un minuto
retire el peine y séquelo al aire completamente.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es le fundamento de esta prueba?
2. ¿Cuál es la diferencia entre los tipos de hepatitis?
3. ¿Cuáles son las formas de transmisión de los diferentes tipos de hepatitis y
cuáles serían los mecanismos de prevención?
4. Describa otros métodos para diagnosticar hepatitis, diferente a la hepatitis B.
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