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Fundamentos de
Espectrometría de Masa
Biológica
Matías Möller
7 de mayo de 2009
Lab. Fisicoquímica Biológica
Instituto de Química Biológica
Facultad de Ciencias
Universidad de la República
1
Bibliografía recomendada:
Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed.
Cap. 15.
J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.
Introduction to proteomics, Liebler, 2002.
2
Espectrometría de masa
1- Generalidades
2- MALDI-TOF
3- ESI-Q
4- Peptide Mass Fingerprinting y
tandem MS
3
Espectrometría de masa
1- Generalidades
4
Espectrometría de masa
Técnica que permite la
separación y determinación de
la relación masa/carga de
iones gaseosos
5
Espectrometría de masa
Espectrometría ≠ Espectroscopía
(Medición de un rango)
(implica absorción o
emisión de energía radiante)
6
Espectrometría de masa
Espectrometría de masa de Biomoléculas
Determinación de masa y/o composición:

Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares

Polisacáridos, oligosacáridos

Lípidos  Lipidoma

Fragmentos de ácidos nucleicos
Técnica muy sensible:
puede analizar mg-ng (y menos) de material
7
Espectrometría de masa
Espectrometría de masa de Proteínas

Determinación de masa y/o composición

Identificación por comparación con bases de datos
(peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos

Modificaciones postraduccionales

Complejos Supramoleculares:
Interacción entre proteínas
Interacción con compuestos de bajo PM

Plegamiento

Niveles de expresión/modificación posttraduccional
8
Gel 2D de
hígado humano
http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/
9
Espectrometría de masa
cyt C ~ 12000 Da
10
Espectrometría de masa
Espectrometría de masa biológica
Lisozima
11
Espectrometría de masa
PM(péptido) = 1162 Da
Modo positivo
m=
+1 +23 +39
Modo negativo
-1
12
Espectrometría de masa
Los Iones son importantes
En el proceso de Ionización se forman diferentes
tipos de iones  cambios en m/z:
[M+H]+ o [M-H]De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos,
fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+)
[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-
De la unión de iones especialmente a moléculas que
contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da)
[M]*+, [M]*(oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)
13
Espectrometría de masa
Espectrómetro de masa
Muestra
Entrada:
Volatilización/
Ionización
MALDI
ESI
Analizador
de masas
TOF
Cuadrupolo
Tampa de Iones
FTICR
Sector Magnético
Detector
Alto
Vacío
14
Espectrometría de masa
¿Cómo volatilizar una proteína?
Premio Nobel de Química 2002
Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization
Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization
Sin Premio:
Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI
(como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)
15
Espectrometría de masa
Espectrómetros de masa
(configuraciones para grandes biomoléculas)
MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight
ESI-Q:
ElectroSpray Ionization-Quadrupole
ESI-IT:
ElectroSpray Ionization-Ion Trap
ESI-FTICR:
Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance
16
Espectrometría de masa
2- MALDI-TOF
17
Espectrometría de masa
Ionización por MALDI:
(Matrix assisted Laser desorption/ionization)
Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe
energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación
de la muestra:
La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando
la proteína cargada hacia la entrada del analizador.
El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+.
Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante
un campo eléctrico
18
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Matriz
19
Espectrometría de masa
MALDI
Desorción/Ionización por Laser
Asistida por Matriz
20
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo
a su “tiempo de vuelo”(t).
t  (m/z)1/2
las partículas con menor m/z llegan antes al detector
No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y
tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)
21
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son
acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una
energía cinética:
Ek = zeEs
donde s es la distancia de la región de la fuente.
Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa
ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek,
½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½
t = D/v = (m/2zeEs)½D
 m/z = 2eEs(t/D)2
22
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
E
+
Sin E, iones a la deriva
Fig. Separación por TOF
+
+
s
Fuente
+
+
D
Detector
½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½
t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2
23
Espectrometría de masa
Tubo de
vuelo
4-25 kV
Detector
Carlos Cerveñansky
24
Espectrometría de masa
Tubo de
vuelo
4-25 kV
Detector
Carlos Cerveñansky
25
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
26
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF
27
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
28
Resolución en MALDI-TOF
Voyager Spec #1= > BC= > RSM10000= > MC= > MC= > MC[BP = 1672.8, 3222]
1672.917
1672.92
100
3222.3
90
80
% Intensity
70
60
50
Modo lineal
Resolucion: 2467
(FWHM)
40
30
20
10
0
1655.0
1662.2
1669.4
1676.6
1683.8
0
1691.0
Mass (m/z )
Voyager Spec #1= > BC= > NR(2.00)= > MC= > MC[BP = 1672.9, 16255]
1672.918
100
1.6E+ 4
90
80
% Intensity
70
60
50
Modo reflector
Resolucion:8500
(FWHM)
40
30
20
10
0
1655.0
Carlos Cerveñansky
1662.2
1669.4
1676.6
Mass (m/z )
1683.8
0
1691.0
29
Espectrometría de masa
Los Isótopos son importantes
Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos
Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu),
se basa en una escala relativa al 126C = 12 amu
1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10-24 g
Abundancia isotópica:
12C
13C
12.0000
13.0034
98.90 %
1.10 %
30
Elemento
Masa
%
1H
1.0078
99.985
2H
2.0141
0.015
12C
12.0000
98.90
13C
13.0034
1.10
14N
14.0031
99.634
15N
15.0001
0.366
16O
15.9949
99.762
17O
16.9991
0.038
18O
17.9992
0.200
31P
30.9738
100.00
32S
31.9721
95.02
33S
32.9715
0.75
34S
33.9679
4.21
36S
35.9671
0.02
79Br
78.9183
50.69
81Br
80.9163
49.31
Carlos Cerveñansky
31
Carlos Cerveñansky
32
Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005]
2xC13
100
90
2093
C13
80
% Intensity
70
60
50
40
C12
30
20
10
0
5725
5729
5733
5737
5741
5745
Mass (m/z)
Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina.
(aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 ml de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)
Carlos Cerveñansky
33
0
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
34
Espectrometría de masa
3- ESI-MS
35
Espectrometría de masa
ESI-Q
ElectroSpray Ionization - Quadrupole
Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar
sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2
(gas secante).
El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas
cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse
y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador
El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo
36
Espectrometría de masa
ESI
N2
37
Espectrometría de masa
ESI
38
Espectrometría de masa
ESI-Q
Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama
“Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de
un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son
neutralizados y eliminados.
Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible
variar la m/z y realizar un barrido espectral
Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de
electrodos del filtro de masas
Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen
muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000
39
Espectrometría de masa
ESI-Q
40
Espectrometría de masa
ESI-Q
41
Espectrometría de masa
ESI-Q
42
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
14+
13+
12+
11+
10+
9+
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
43
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
14+
13+
12+
11+
10+
9+
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
44
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
(n+1)+
n+
x1 = (M+n)/n
x2 = (M+n+1)/(n+1)
 n = (x2-1)/(x1-x2)
n = (1084.1-1) / 72.1 = 15
M = (1156.2 x 15) -15 = 17328
45
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
Mioglobina de caballo
46
Espectrometría de masa
ESI-MS
Deconvolución del espectro
Bajo PM
Alto PM
47
Espectrometría de masa
ESI-MS
48
Espectrometría de masa
Comparación ESI-MS y MALDI-TOF
Cyt C
49
Espectrometría de masa
Comparación
MALDI-TOF
ESI-(Q3 o IT)
Pocas, en general 1
Muchas
50000
3000
Rango de masas
200.000
70.000
Interacciones no
covalentes
No
Si
limitado, PSD
Si, CID
Acoplar LC
No
Si
Tolerancia a
contaminantes
Si
No
Cargas/ion
Rango de m/z
MS/MS
50
Identificación de proteínas
Peptide mass fingerprinting
51
Identificación de proteínas
52
53
54
Espectrometría de masa
MS/MS
Espectrometría en Tándem:
Secuenciación de péptidos
55
Espectrometría de masa
MS/MS: Espectrometría en Tándem
Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo
y estudiar la formación de iones “hijos”
mp+  md+ + mn0
Identificación de moléculas
Secuenciación de péptidos “al vuelo”
Modificaciones posttraduccionales
56
Espectrometría de masa
MS/MS: Espectrometría en Tandem
ESI-Q
Q1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q1 y Q3 separan iones moleculares,
mientras Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas
para que los iones acelerados choquen y se fragmenten
CID: Collision Induced Dissociation
MALDI-TOF
Iones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan
juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo.
PSD: Post Source Decay
57
MS/MS
Secuenciación peptídica
Mezcla de péptidos
1 péptido
seleccionado
para MS/MS
+
+
MS/MS
+
+
+
+
Espectro MS
Carlos Cerveñansky
Espectro MS/MS:
masa de los
fragmentos
58
Espectrometría de masa
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Fragmentación peptídica
59
60
61
Carlos Cerveñansky
62