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ANALIZADORES
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1
Analizadores
Cuadrupolo (Q)
Trampa de iones (IT)
Sector magnético-eléctrico
(BE)
Tiempo de vuelo (TOF)
Resonancia iónica
ciclotrónica (ICR)
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2
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Cuando un ion m/z deja la fuente:
mv2/2 = z e V = Ec
El tiempo (t) requerido para volar d es:
v=d/t
m (d2 / t2) / 2 = z e V
t2 = m d2
2zeV
t = m d2 1/2
z2eV
m / z puede ser calculado a partir de t
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
t = m d2 1/2
z2eV
Ejemplo:
V = 2000 v
d=1m
t H+= 1.7 µs
No tiene límite de m
t 2500 = 50 µs
1/2
t2 – t1 = d2
z2eV
( m2 )1/2 – ( m1 )1/2
fullereno C60 +.
t 720 = 27.665 µs
C5913C +. t 721 = 27.684 µs
∆t = 19 ns
Para mejorar la resolución: aumentar el largo del tubo
disminuír la dispersión en energías
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Analizadores
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s0
sa
sd
v
m/z
Detector
E
t = t0 + ta + td
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6
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
E kin = zeU
E kin = 21 mv 2
s
v=
t
m
t = t 0 + ( 2 sa + sd )
2 zeU
m = a + b ⋅t
2
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7
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
t=
2 mk / z e
V0 + ε −
ε
D0 / V0 + mk / 2 z e
L0 /
V0 + ε
ε : energía inicial del ion (eV)
D0 : distancia de extracción
L0 : distancia en la zona de deriva
V0 : voltaje de extracción
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Problema: Picos anchos (baja resolución).
Causa: Iones con la misma masa tienen diferentes velocidades
(dispersión de energía)
Muestra + matriz
Iones de igual masa con diferentes velocidades
+
+
+
Para mejorar la resolución: disminuír la dispersión en energías
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Problema: Picos anchos (baja resolución).
a
c
b
d
Causas: Iones con la misma masa
a- parten a distinto tiempo
b- parten de diferentes puntos
c- tienen diferente velocidad
d- poseen
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UBA inicial
diferente dirección
Plano de enfoque
espacial
Extracción en dos etapas
10
Analizadores
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11
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
¿Cómo compensar la dispersión de energía inicial (y tiempo y espacio) de
iones de igual masa?
Time-lag focusing TLF
Delayed Extraction (DE)
Pulse ion extraction (PIE)
TOF con Reflectrón
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Delayed Extraction (DE)
0V
Iones de igual masa y
diferente velocidad
+
+
Detector
+
1: No se aplica ningún campo eléctrico. Los iones difunden durante el ¨delay time¨.
+20 kV
+
+
+
+18 kV
2: Se aplica un campo eléctrico. El gradiente hace que los iones más lentos se
aceleren más.
+
+
+
0V
3: Los iones lentos alcanzan a los rápidos en el detector.
Placa de
muestra
¨Grid¨de
potencial
Facultad
de Ciencias
Exactas y Naturales
UBA
variable
13
Analizadores
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Potenciales de extracción - DE
Potencial variable (% del
potencial acelerador potencial acelerador)
(15-25) kV
+20 kV
Potential
Ground grid
+18 kV (90%)
Gradient
Al tubo
de
vuelo
Región de ionización
El gradiente de potencial y el tiempo de demora (delay time) deben
ser ajustados para obtener la máxima resolución para un dado rango
de masa.
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14
Analizadores
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Potenciales de extracción - DE
Son parámetros interactivos
Kompact Maldi IV – Shimadzu-Kratos
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Analizadores
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Delayed Extraction (DE) vs tiempo
¨Pulse Delay Time¨
potencial de aceleración
Pulso láser
kV
potencial variable
tiempo
¨delay time¨ de
extracción (25-1000 ns)
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16
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Mejoras en la resolución por DE
Linear mode
Reflector mode
delayed
extraction
R=1,100
10600
10800
continuous
extraction
R=125
11000
11200
11400
11600
m/z
muestra: mezcla de ADN (36-mer)
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Analizadores
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Reflectrón
Es un espejo iónico que somete a los
iones a un campo eléctrico uniforme
repulsivo, que los refleja.
Detector
Ion Source
Reflectrón (espejo iónico)
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Analizadores
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reflectrón
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
E kin = zeU
E kin = 21 mv 2
reflectrón
s
v=
t
m
t = t 0 + ( 2 sa + sd )
2 zeU
m = a + b ⋅t
2
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20
Analizadores
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Reflectrón
+
+
x
y
Enfoca los iones
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Reflectrón
Distancia penetrada por un ion de vix en el reflectrón :
x=K/qE
K energía cinética del ion
E campo en el reflectrón
Supongamos dos iones i e i´ con igual m y K´/K = a2
K = 0.5 m vix2
vix = (2 K / m)1/2
K´ = 0.5 m vi´x2
vi´x= (2 K´/ m)1/2 = (2 K a2 / m)1/2
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vi´x = a vix
22
Analizadores
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Reflectrón
El tiempo fuera del reflectrón :
t = d / vix
vi´x = a vix
t´ = d / vi´x = d / a vix
t´ = t / a
El tiempo dentro del reflectrón :
x=K/qE
x´ = K´ / q E = a2 K / q E = a2 x
Cuando llega a x: v = 0
v (promedio) = v ix / 2
en el reflectrón
t = 2 t0 = 2 x /(v ix / 2)
tr = 4 x / vix
t´r = 4 x´ / vi´x = 4 a2 x/ a vix = 4 a x /vix
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t´r = a tr
23
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Reflectrón
t´ = t / a
(K´/K = a2)
t´r = a tr
El tiempo total de vuelo :
tT = t + tr
t´T = t´ + t´r = t / a + a t
Si a > 1 el ion con exceso de Ec tiene un vuelo más corto fuera y más
largo dentro del reflectrón
Lo opuesto con a < 1
Con los valores adecuados de E, V y d se compensan totalmente
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Modo lineal
¾ Masas
altas (> 50 kDa)
¾ Alta sensibilidad
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25
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Modo Delayed Extraction (DE)
¾
¾
¾
Masas más bajas (< 40 kDa)
Buena resolución
Alta sensibilidad
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Modo reflectrón
¾
¾
¾
Masas bajas (< 10 kDa)
Alta resolución
Baja sensibilidad
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27
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Placa Extracción
de muestra grids
Atenuador
Prisma
Laser
Selector
tiempo
de iones
detector
Lineal
Reflector
detector
Reflector
Celda de
colisión
cámara
vacío
vacío
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
reflectrón
Kompact Maldi IV – Shimadzu-Kratos
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29
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Resolución y precisión en la determinación de melitina
Resolution = 18100
15 ppm error
8000
6000
Resolution = 14200
Counts
24 ppm error
4000
Resolution = 4500
2000
55 ppm error
0
2840
2845
2850
Mass Exactas
(m/z)
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y Naturales
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2855
30
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Mejoras en la resolución por DE
Linear mode
Reflector mode
Modo lineal
delayed
extraction
R=1,100
10600
10800
Modo reflectrón
continuous
extraction
R=125
11000
11200
11400
11600
continuous
extraction
R=650
delayed
extraction
R=11,000
6130
6140
6150
6160
6170
m/z
m/z
muestra: mezcla de ADN (36-mer)
muestra: mezcla de ADN (20-mer)
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Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Características generales:
Límite de m/z: ilimitada
API
Resolución: relativa s/lineal o reflectrón (10000)
Se puede acoplar a otros analizadores (TOF, Q, LT, BE) y a
pocas fuentes de ionización (MALDI)
Lím. detección: 1-10 pg
Velocidad de scaneo: muy rápida (> 106 u/s)
Más difícil realizar EM/EM sin otros analizadores
Símbolo
Requerimiento de vacío: 10-7 torr (mín)
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Reflectrón
Lineal
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Analizadores
Espectrometría de masa tándem con un
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
PSD (post-source decay)
¨Prompt fragmentation¨ : indistinguible en tiempo y espacio del evento de la
ionización.
Fragmentación metaestable (cuando ocurre en la zona de aceleración es
perjudicial)
Fragmentación post-fuente (Post-source fragmentation)
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Analizadores
Espectrometría de masa tándem con un
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
TOF-TOF
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34
Tandem
Híbridos
Q-TOF
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35
Tandem
Híbridos
Q-TOF
Removeable
Sample cone
Extraction
cone
Z-Spray
Ion source
Transfer
optics
Quadrupole
(resolving)
Hexapole
(collision cell)
Reflectron
Waters-Micromass
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¨modo V¨
36
Tandem
Híbridos
Q-TOF
Waters-Micromass
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¨modo W¨
37
Tandem
Híbridos
Ions in
P
u
s
h
e
r
Q-TOF
V2
V1
V1 > V2
“W” Mirror
MCP
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Tandem
Híbridos
Q-TOF
peptideo HR
argentina2 69 (3.182) M3 [Ev-130948,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Cm (60:77)
1206.733
100
TOF MS ES+
3.47e4
Espectro ESI de una mezcla de péptidos
%
2003.204
2017.231
1914.172
1220.740
1286.338
1387.857
1300
1400
2031.243
1900.182
0
mass
1200
1500
1600
1700
1800
1900
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2000
2100
39
Tandem
Híbridos
Q-TOF
peptideo CID950
argentina5 MaxEnt 3 7 [Ev-82828,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp)
1: TOF MSMS 950.00ES+
1588.97
100
Espectro ESI MS/MS del ion m/z 1900
1503.92
1602.99
%
1517.93
1178.73
1192.75
411.26
527.33
541.34
312.21326.21
213.13 298.19
0
72.08 85.09
100
793.48
810.51
652.40
442.27
524.31
779.47
542.28
1900.16(M+H) +
1062.66
878.54
977.60 1048.65
1107.69
1404.85
1617.00
1291.78
1801.10
1907.04
M/z
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
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UBA
1500
1600
1700
1800
1900
40
Tandem
MS/MS en un TOF
TOF - Modo reflectrón (ReTOF)
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Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source
Decay (PSD)
[M+H]+
100
75
50
25
80
Iones PSD
de masas
bajas
85
90
95
t/m
100 105 110 115
Iones PSD
de masas
altas
Ion molecular
Precursor
Detector
DE
MALDI
target
Ion gate
U1
Uacc Up
U2
Región libre de campo
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Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay (PSD)
Selección de precursor (¨Ion gating¨)
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Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay (PSD)
(mpH)+
(mpH) v = (m1H) v + m2 v
E0 = 0.5 (mpH) v2
E 1 = E0
(m1H)+ + m2
J
en modo lineal llegan a igual tiempo
v2 = 2 E0 / (mpH)
m1H / mpH
E1 = 0.5 (m1H) v2
en modo reflectrón se diferencia
mpH+ de sus fragmentos
Inconveniente: no se enfocan convenientemente
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Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay (PSD)
Espejo PSD R = 1.00
___ MH+ (PM 1000) enfocado
---- AH+ (PM 700) no enfocado
..... BH+ (PM 300) no enfocado
Espejo PSD R = 0.7
___ MH+ (PM 1000) no enfocado
---- AH+ (PM 700) enfocado
..... BH+ (PM 300) no enfocado
Espejo PSD R = 0.3
___ MH+ (PM 1000) no enfocado
---- AH+ (PM 700) no enfocado
..... BH+ (PM 300) enfocado
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Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay
(PSD)
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Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay (PSD)
Reflectrón de campo curvo: permite obtener el espectro completo de
fragmentos
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Tandem
MS/MS en un TOF
PSD
14000 P
G
R
F
PF
S
R
b8886.5
Bradykinin, MW 903.47
12000
Sequence: NH2-PRGFSPFR-COOH
10000
Counts
8000
y7
807.5
402.2
P
y3
70.2
b5
748.3
486.2
371.1 419.3
6000
R
302.1
y1
112.2155.1
175.2
4000
2000
F
120.3
b1
b2
195.1
y6
b4
b3
399.2
252.2
y2
710.4
y4
468.2
506.3
332.2
790.3
b7
y5
730.4
653.2
98.1
0
100
200
300
500 y Naturales
600
Facultad de400
Ciencias Exactas
UBA
Mass (m/z)
700
800
90048
Bibliografía
-Time-of-Flight Mass Spectrometry. Instrumentation and Applications in
Biological Research. R. J. Cotter. 1996. ACS
- Time-of-Flight Mass Spectrometry and its Applications. Ed. E. W. Schlag.
1994. Elsevier
- Mass Spectrometry. Principles and Applications. De Hoffmann, E.,
Charette, J. y Stroobant, V. 1996. John Wiley & sons Ltd.
- Mass Spectrometry. J. H. Gross. 2004. Springer
- Practical Organic Mass Spectrometry. Chapman J. R. 1993. John Wiley
& sons Ltd
- Manuales Voyager y Kompact MALDI IV
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49