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Tema 7. Genética Reversa II.
Mutagénesis Insercional
Genética reversa II. Mutagenesis insercional. Colecciones
mutagenizadas por transposición. Rastreo de mutantes. Análisis
genético, reversión. Gene trap.
Tema 7. Genética Reversa II.
Mutagénesis Insercional
Functional Genomics in Plants. David Bouchez and
Herman Höfte. Plant Physiol. (1998) 118: 725–732
Transposons as tools for functional genomics. Srinivasan
Ramachandran, Venkatesan Sundaresan. Plant Physiol. Biochem. 39
(2001) 243-252
Tema 7. Genética Reversa II.
Mutagénesis Insercional
La inserción de transposones y T-DNA puede ser utilizada en
mutagénesis:
•
En aplicaciones de “Forward genetics”, el elemento insertado
proporciona una etiqueta que puede facilitar el aislamiento
del gen mutado por perdida o ganancia (“activation tagging”)
de función
•
En “gene trap” el elemento de inserción proporciona un
marcador que facilita el análisis del patrón de expresión del
gen
•
El desarrollo de técnicas de “screening” masivo permite
utilizar estas colecciones mutagenizadas por inserción en
genética reversa
Tema 7. Genética Reversa II.
Mutagénesis Insercional
Tema 7. Genética Reversa II.
Mutagénesis Insercional
En plantas los sistemas más utilizados son:
Transposones de maíz (En/Spm, Ac/Ds y Mu). RetroFacilidad en la generación de grandes colecciones
Posibilidad de reversión
Inestables
T-DNA
Menor número de copias
Mayor estabilidad
Sin preferencias por el sitio de inserción
Necesidad de transgénesis
Tema 7. Genética Reversa II.
Mutagénesis Insercional
Los parámetros críticos, como en cualquier experimento de
mutagénesis, son:
El nivel de saturación
La homogeneidad en la distribución de inserciones por el
genoma
El número medio de inserciones en cada línea de la
colección
En Arabidopsis, una probabilidad del 95% de tener al menos
una inserción en un gen se corresponde con una colección de
120.000 inserciones independientes
Tema 7. Genética Reversa II.
Mutagénesis Insercional
La técnica de PCR ha permitido abordar el “screening” eficaz
de grandes colecciones de mutantes por inserción
La sensibilidad de la técnica permite el análisis en “pools” de
hasta miles de individuos
Tema 7.
Genética Reversa
II.
Mutagénesis
Insercional
AIMS
TAIL-PCR
Rescue-MU
Database
Database
Tema 7.
Genética Reversa II. Un ejemplo
Toward the Analysis of the Petunia MADS Box Gene Family by Reverse
and Forward Transposon Insertion Mutagenesis Approaches: B, C, and D
Floral Organ Identity Functions Require SEPALLATALike MADS Box
Genes in Petunia. Michiel Vandenbussche, y col. The Plant Cell, Vol. 15,
2680–2693, November 2003.
Los genes MAD-box son factores transcripcionales, muchos de ellos
implicados en la regulación de la identidad de órganos florales.
El modelo original de determinación de identidad floral (modelo
ABC) se basaba en el análisis de mutantes de desarrollo (genética
directa), la mayoría de los genes identificados pertenecían a la
familia MAD-box.
El descubrimiento de nuevos genes MAD implicados en el proceso
(por genética reversa) ha permitido refinar el modelo.
Tema 7.
Genética Reversa II. Un ejemplo
En este trabajo, los autores se proponen identificar lineas
mutagenizadas por transposición en todos los MAD-box de Petunia.
El trabajo comienza con el diseño de primers específicos de distintas
subfamilias de MAD-box.
Tema 7.
Genética Reversa II. Un ejemplo
Se utilizó una estrategia de pooling para reducir el número de PCRs
y para descartar falsos positivos (amplicones artefactuales,
inserciones somáticas)
Tres hojas por planta
Ejemplo de pooling 3D
256 individuos en 4
parcelas de 64
Ejemplo de pooling 3D
Agrupamiento en filas, F1 a F8=8 filas
Ejemplo de pooling 3D
Agrupamiento en Columnas, C1 a C8=8 columnas
Ejemplo de pooling 3D
Agrupamiento en parcelas, P1 a P4=4 parcelas
Ejemplo de pooling 3D
La reunión individuos en grupos reduce el número de muestras……
256 individuos
8 filas+8 columnas+4 parcelas = 20 muestras
Ejemplo de pooling 3D
……………….Sin necesidad de perder información individual
El individuo señalado justifica
un resultado positivo (presencia
de amplicón) en F5,C6,P1
Si además utilizamos distintas
partes de la planta para construir
los pools F, C y P descartamos
inserciones somáticas
Tema 7.
Genética Reversa II. Un ejemplo
Los amplicones “positivos” fueron re-amplificados y secuenciados
Tema 7.
Genética Reversa II. Un ejemplo
Han identificado 32 inserciones en 20 genes MAD-box
Se ha realizado el análisis de transmisión y segregación (análisis
genético) para todos ellos con la ayuda de primers específicos
El trabajo concluye con la caracterización fenotípica de sólo dos de
las líneas fbp2 y fbp5, y los dobles mutantes fbp2 fbp5.
Flores e inflorescencias secundarias en fbp2
Tema 7.
Genética Reversa II. Un ejemplo
Efecto aditivo de la mutación fbp5 sobre la fbp2 en los dobles
mutantes fbp2 fbp5.
fbp5, fbp2, and fbp2 fbp5.
Tema 7.
Genética Reversa II. Un ejemplo
Órganos transformándose en estructuras tipo sépalo en los dobles
mutantes fbp2 fbp5.
fbp5, fbp2, and fbp2 fbp5.
fbp2 fbp5, fbp5 and fbp2 fbp5.
Tema 7.
Genética Reversa II. Otro ejemplo
Isolation of mtpim Proves Tnt1 a Useful Reverse Genetics Tool in
Medicago truncatula and Uncovers New Aspects of AP1-Like
Functions in Legumes
Reyes Benlloch, Isabelle d’Erfurth, Cristina Ferrandiz, Viviane Cosson, José Pío Beltrán,
Luis Antonio Cañas, Adam Kondorosi, Francisco Madueño, and Pascal Ratet
Plant Physiology, November 2006, Vol. 142, pp. 972–983.
Tema 7.
Genética Reversa II. Otro ejemplo
Colección mutagenizada: 200 plantas procedentes de la
transformación de M. truncatula con el retrotransposón (15-20
inserciones por línea)
Estrategia de screening. PCRs con
oligos del dominio MADS, sobre
20 pools de 10 individuos
El individuo 9 del pool 5 dio un
resultado positivo
Tema 7.
Genética Reversa II. Otro ejemplo
La secuenciaciópn confirmó la
insercion del retrotransposón en
un gen MADS de M. truncatula
El gen en el que se ha
insertado el transposón,
MtPIM es muy similar a
otros MADs previamente
implicados en desarrollo
floral
Tema 7.
Genética Reversa II. Otro ejemplo
•Co-segregación:
•3 plantas mtpim que mostraban un fenotipo floral fueron retrocruzadas
por el parental sin transposón. 111 individuos F2 fueron analizados y 28
(=1/4) mostraban el fenotipo mutante.
•83plantas F2 fueron genotipadas por PCR. 55 silvestres contenían la
inserción en heterocigosis o no eran portadoras. Las 28 mutantes
contenían la inserción en homocigosis.
Tema 7.
Genética Reversa II. Otro ejemplo
Análisis de la expresión del gen
en WT:
Expresión restringida a flores y,
débilmente, tallos
Tránscrito indetectable en plantas
mutantes
En inflorescencias se expresa
en meristemo floral y bractea.
Más tarde en primordios de
sépalos y pétalos
Tema 7.
Genética Reversa II. Otro ejemplo
mtpim muestra proliferación
de meristemos
y transformaciones
homeóticas
Tema 7.
Genética Reversa II. Gene traps
Patricia S. Springer. Gene Traps: Tools for Plant Development and
Genomics.The Plant Cell, Vol. 12, 1007–1020, July 2000
La estrategia de identificación génica mediante alteración de la
actividad (típicamente genética) tiene algunos inconvenientes:
•Redundancia
•Pleiotropía
La identificación génica mediante caracterización cuidadosa del
patrón de expresión, tiene algunos inconvenientes metodológicos.
Las “trampas génicas” combinan ambas aproximaciones.
Gene traps
Es necesario generar una colección de individuos, con inserciones
individuales, que puede ser cribada de formas diversas
Vectores de transformación:
T-DNA
Transposones
Gene traps
La idea de producir inserciones al azar de un gen delator fue
desarrollada primero en E. coli (1979).
Ha sido ampliamente utilizada en Drosophila (enhancer detection)
y ratón.
Dependiendo de la construcción delatora podemos distinguir al
menos tres tipos de gen trap:
•Enhancer trap
•Promoter trap
•Gene trap
Gene traps
Gene traps
El sistema Ac/Ds se ha utilizado con éxito:
Bajo número de copias
Transposición ligada
Dispersión?
indoleacetamide
hydrolase
NAM, Kan
Gene traps
Reporters
GUS (uidA)
GFP y otros colores
Otras alternativas, reguladores de la síntesis de antocianinas (Lc)
El gen es identificado sin necesidad de un fenotipo mutante, lo cual
es útil para:
•Genes redundantes
•Genes activos en distintos estadios de desarrollo
La función génica puede caracterizarse a posteriori en las mismas
líneas, si la inserción ha producido KO
Gene traps
Existen bases de datos de patrones de expresión en líneas gene-trap
Gene traps
La caracterización del gen PROLIFERA (PRL) ilustra la eficacia de las
colecciones gen trap en el descubrimiento de nuevas funciones géncias.
PRL fue identificado en una línea gene trap que mostraba actividad
GUS en células en división.
PRL codifica para una proteína perteneciente a la familia MCM,
proteínas necesarias para la iniciación de la replicación del DNA y
presentes en todos los eucariotas.
La interrupción de PRL por el elemento DsG da lugar a letalidad en
mega-gametofito y embrión. Aunque la muerte puede ocurrir en varios
estadios a lo largo del desarrollo de estas estructuras.
En este caso el análisis fenotípico es complejo porque existen muchas
mutaciones que provocan letalidad a nivel del desarrollo embrionario.
El patrón de expresión de GUS, en células en división, proporcionó
pistas sobre la función alterada incluso antes de la identificación del
gen.
Tema 6. Genética Reversa 1.
Mutagénesis Insercional
Algunos
sistemas de
elementos
transponibles
caracterizados
en plantas
Tema 7.
Genética
Reversa II.
TAIL-PCR
Tema 7. Genética Reversa II.
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Tema 7. Genética Reversa II.
SIGnAL "T-DNA Express" Arabidopsis
Gene Mapping Tool ( Nov. 22, 2005 )
Tema 7. Genética Reversa II.
T-DNA
SALK
SAIL
GABI
FLAG
EXOTIC
Wisc
RIKEN
CSHL
Total
Total Mapped
145589
48434
59455
31560
23411
10459
18551
5169
342832
Coding Exon
14221
5396
9324
3711
3559
1954
3488
961
22573
Intron
7255
2391
4534
1967
1020
954
1124
257
11748
5' UTR
5042
1809
2478
957
627
459
818
130
9700
Promoter
(1st 500bp)
9850
4217
5695
3122
1058
1196
1368
200
16705
Location