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Genética Reversa I. Mutagénesis Insercional
Transposons
as
tools
for
functional
genomics.
Srinivasan
Ramachandran, Venkatesan Sundaresan. Plant Physiol. Biochem. 39 (2001) 243-252
From sequence to phenotype: Reverse Genetics in Drosophila
melanogaster. Melissa D. Adams and Jeff J. Sekelsky. NATURE REVIEWS.
GENETICS. VOLUME 3. MARCH 2002. 189
Use of DNA transposons for functional genetic screens in mouse
models of cancer. Camino Bermejo-Rodríguez and Pedro A Pérez-Mancera.
Current Opinion in Biotechnology 2015, 35:103–110
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
La inserción de transposones y T-DNA puede ser utilizada en
aplicaciones de genética directa y reversa:
•
En aplicaciones de “Forward genetics”, el elemento insertado
proporciona una etiqueta que puede facilitar el aislamiento
del gen mutado por perdida o ganancia (“activation tagging”)
de función
•
En “gene trap” el elemento de inserción proporciona un
marcador que facilita el análisis del patrón de expresión del
gen
•
El desarrollo de técnicas de “screening” masivo permite
utilizar estas colecciones mutagenizadas por inserción en
genética reversa
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
En plantas los sistemas más utilizados son:
1)Transposones de maíz (En/Spm, Ac/Ds y Mu) y transposones
homólogos identificados en otras especies. RetroEs posible el intercambio entre especies (no sólo plantas),
aunque se observa dependencia de factores endógenos para la
transposición
Facilidad en la generación de grandes colecciones
Posibilidad de reversión
Inestables
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
2) En Arabidopsis el T-DNA se ha utilizado como alternativa
a transposones:
Menor número de copias
Mayor estabilidad
Sin preferencias por el sitio de inserción
Necesidad de transgénesis, no aplicable en sistemas de
baja eficacia de transformación
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
Construccion de una colección Mu (TUSC, Uniform-Mu) y de una
TDNA..................
Los parámetros críticos, como en cualquier experimento de
mutagénesis, son:
El nivel de saturación
La homogeneidad en la distribución de inserciones por el
genoma
El número medio de inserciones (GERMINALES) en cada
línea de la colección
En Arabidopsis, una probabilidad del 95% de tener al menos una
inserción en un gen se corresponde con una colección de
120.000 inserciones independientes
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
Drosophila:
Se han utilizado transposones tipo P, hobo, mariner, Hermes
o piggybac
El elemento P es un eficaz vector de transformación en un
sistema de dos componentes.
También es un eficaz elemento de inserción, por desgracia
limitado a Drosophila
Cómo mutágeno insercional existen sofisticadas versiones
para activation tagging, gene disruption y gene trap, algunas
con tecnología plasmid-rescue
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
Vertebrados:
Sleeping Beauty (SB), un transposón tipo TC1/mariner se
reconstruyó a partir de un elemento durmiente encontrado en
peces.
SB se ha optimizado para transponerse en distintos tipos
celulares, incluidas embryonic SC y células somáticas de ratón.
SB tiende a la transposición ligada, su tamaño es limitado y es
fuertemente dependiente de factores endógenos
PiggyBac (PB) un transposón derivado de una polilla, ha sido
modificado para ser activo en mamíferos y tiene varias ventajas
respecto a SB:
•Admite mayores fragmentos de DNA en su interior
•Tiene menor tendencia a la transposición ligada
•No deja huellas tras la re-movilización
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
Método clásico de Screening:
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
La técnica de PCR ha permitido abordar el “screening” eficaz
de grandes colecciones de mutantes por inserción
La sensibilidad de la técnica permite el análisis en “pools” de
hasta miles de individuos
La preparación de “pools” de DNA
puede utilizarse para discriminar
inserciones somáticas y germinales
May B P et al. PNAS 2003;100:11541-11546
©2003 by National Academy of Sciences
Genética no-tan-reversa I.
Mutagénesis Insercional
Las inserciones somáticas pueden ser útiles en determinadas
aplicaciones. Han sido utilizadas eficazmente en ratón, en
aproximaciones de genética directa, para la detección de genes
implicados en la formación de tumores. Ejem:
Sleeping Beauty transposon insertional mutagenesis
based mouse models for cancer gene discovery.
Branden S Moriarity and David A Largaespada
Current Opinion in Genetics & Development 2015, 30:66–72
Genética no-tan-reversa I.
Mutagénesis Insercional
Genética no-tanreversa I.
Mutagénesis
Insercional
Genética Reversa I. Mutagénesis
Insercional
IMPORTANTE
Como en toda aproximación basada en la generación de
mutantes, un análisis de co-segregación es un requerimiento
mínimo
+ alelos adicionales o reversión
Genética Reversa I.
Mutagénesis Insercional
Screening “in silico”:
Diversas técnicas de PCR inversa, primero, y técnicas de
secuenciación masiva, más tarde, han permitido la generación de
bases de datos de sitios de inserción
La búsqueda en estas bases de datos de inserciones en nuestro gen
favorito, por ejemplo mediante BLAST, permiten encontrar en
segundos la línea/líneas portadoras de un potencial KO de interés
El análisis de mutantes por inserción obtenidos “in silico” es una
herramienta fundamental y de uso rutinario de genética reversa en
determinados organismos. Lo cual dificulta la selección de artículos
para un seminario con énfasis en los aspectos metodológicos de la
técnica
Genética Reversa I.
SIGnAL "T-DNA Express" Arabidopsis
Gene Mapping Tool ( Nov. 22, 2005 )
http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress
Genética Reversa I.
T-DNA
SALK
SAIL
GABI
FLAG
EXOTIC
Wisc
RIKEN
CSHL
Total
Total Mapped
145589
48434
59455
31560
23411
10459
18551
5169
342832
Coding Exon
14221
5396
9324
3711
3559
1954
3488
961
22573
Intron
7255
2391
4534
1967
1020
954
1124
257
11748
5' UTR
5042
1809
2478
957
627
459
818
130
9700
Promoter
(1st 500bp)
9850
4217
5695
3122
1058
1196
1368
200
16705
Location
Genética Reversa I. Un ejemplo
sal1 determines the number of aleurone cell layers in maize
endosperm and encodes a class E vacuolar sorting protein
PNAS , 2003 vol. 100 no. 11, pg 6552–6557
sal1-1 se encontró en un
screening de genética directa
sobre una colección de maíz
mutagenizada por Mu
Una segunda línea mutante,
con
defectos
en
la
determinación de la capa de
aleurona, resultó ser alélica
con sal1-1 (sal1-1’)
Genética Reversa I. Un ejemplo
La presencia de la etiqueta Mu permitió
clonar el gen causal. El análisis molecular
de sal1-1’ mostro que en realidad se
trataba del mismo alelo que sal1-1
Un screening de genética reversa permitió identificar
un segundo alelo, sal1-2, esta vez con una inserción
de Mu en un sitio distinto del gen. Pero con el mismo
fenotipo que sal1-1.
Genética Reversa I. Un ejemplo
El gen se expresa en varios tejidos, el
alelo sal1-2 da lugar a ausencia de
transcrito en hojas
Las plantas sal1-2 muestran
defectos en el desarrollo y la
estructura de las capas celulares en
hojas.
Genética Reversa I. Otro ejemplo
Genome-Wide Insertional Mutagenesis of Arabidopsis thaliana
Science 1 August 2003: Vol. 301 no. 5633 pp. 653-657
José M. Alonso et al. Science 2003;301:653-657
Published by AAAS
Genética Reversa I. Otro ejemplo
Fig. 1. Nonuniform distribution of T-DNAs in the Arabidopsis genome.
José M. Alonso et al. Science 2003;301:653-657
Published by AAAS
Fig. 2. Functional analysis of the AP2/EREBP multigenic family.
José M. Alonso et al. Science 2003;301:653-657
Published by AAAS
Fig. 3. EDF knockouts.
José M. Alonso et al. Science 2003;301:653-657
Published by AAAS
Fig. 3. EDF knockouts.
José M. Alonso et al. Science 2003;301:653-657
Published by AAAS