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TEMA 19- ESTRATEGIAS DE CONTROL DE ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA II.
1. Introducción regulación por Cambios Conformacionales.
2. Interacción proteína-ligando.
2.1. Función de Scatchard.
2.1.1. Linearización de la ecuación de Scatchard.
2.2. Ecuación de Hill.
2.2.1. Linearización de la ecuación de Hill.
2.2.2. Razón de saturación Rs.
3.Modelo Proteínas alostéricas.
3.1.Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeux (MWC)
3.1.1. Enzimas alostéricas tipo K
3.1.2. Enzimas alostéricas tipo V
3.1.3. Modelo alostérico mixto
3.2. Modelo secuencial (KNF).
Regulación por Cambios Conformacionales
- Observaciones experimentales
i) Observaciones experimentales que condujeron al desarrollo
de la idea sobre los cambios conformacionales y su papel en
la regulación de la actividad enzimática.
- Modelo de Monod-Wyman-Changeux
- Modelo de Koshland-Nemethy-Filmer
ii) Modelos teóricos empleados para la descripción de este
sistema de control.
iii) Significado biológico/bioquímico de este tipo de control.
I) Observaciones experimentales
* Muchas de las ideas sobre el control conformacional de la actividad
enzimática se desarrollaron como consecuencia del trabajo sobre las vías
biosintéticas de los aminoácidos en microorganismos, especialmente en E.
coli.
* A mediados de la década de los años 50 se descubrió que la Treoninadehidratasa, primera enzima de la vía biosintética de la Ile, en E. coli, se
inhibía fuertemente por Ile, producto final de la vía, que tiene muy pocas
analogías estructurales con el sustrato de la enzima, la Thr.
Threonine
dehydratase
-
L-Thr ---------> 2-Oxo-butyric acid ---> ---> --->... ---> ---> L-Ile
- Sólo la primera enzima de la vía, la “treonina-dehidratasa”,
muestra este tipo de inhibición.
* Un ejemplo, semejante, se encontró en el caso de la enzima
Carbamoiltransferasa o Aspartato Transcarbamilasa
(ATCasa), enzima que cataliza la primera reacción de la vía
biosintética de las bases pirimidínicas, en E. coli, la cual se inhibe
también por el producto final de la vía, especialmente por CTP.
Active relaxed form
COOCH2
HN-C-COOHH
COOO CH2
H2N-C- N-C-COOHH
Quaternary structure
Catalytic subunits
CCC
R
R
R
R
CCC
R
R
Regulatory subunits
Catalytic subunits
- - -
+
Carbamoyl aspartate
=
=
O
H2N-C-O-PO32-
Aspartate
- - -
Carbamoyl
phosphate
ATCase
ATP
CTP
CTP
CTP
CTP
CTP
CTP
Inactive tense form
Feedback
inhibition
CTP
Nucleic acid
metabolism
* En este caso, también se observó que el ATP podía actuar
activando a la enzima, la ATCasa; proporcionando así un
mecanismo para conseguir el balance entre la producción de
nucleótidos purínicos y pirimidínicos, necesarios para la
biosíntesis de ácidos nucleicos.
* A principios de los años 60, ya se habían descrito varios
sistemas que presentaban este tipo de regulación, en los que
únicamente la primera enzima de la vía era inhibida por
“retroalimentación” o “feed-back”.
* El primer intento serio de unificar todas estas observaciones fue
realizado por Monod, Changeux y Jacob, y constituye uno de
los trabajos “clásico” de la Enzimología.
- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306
- En este trabajo se resaltan los siguientes puntos o
características comunes a este tipo de sistemas:
a) El ligando implicado en la regulación de la actividad
enzimática (molécula reguladora o efector), generalmente, es
estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la
reacción que cataliza la enzima retroinhibida.
b) La mayor parte de las enzimas cuya actividad se
controla/regula por este tipo de regulación, no muestran cinéticas
hiperbólicas clásicas cuando se representa v  [S], sino que
muestran una cinética de tipo sigmoidal.
c) Es relativamente fácil distinguir entre la unión del efector a la
enzima y la unión del sustrato. Varios tratamientos químicos y físicos nos
permiten “desensitizar” la enzima, es decir, hacerle perder su respuesta ante
las moléculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida de la
actividad catalítica. Así en el caso de la ACTasa un tratamiento térmico, suave,
da lugar a una enzima activa no inhibible por CTP. La enzima “desensitizada”
muestra una cinética hiperbólica semejante a la que presentan las enzimas
michaelianas.
d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo
son “oligómeros”, es decir, proteínas formadas por varias
subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas
débiles.
* Monod, Changeux y Jacob propusieron que la molécula
reguladora o efector se une a un sitio de la enzima diferente del
centro activo, de manera que la interacción entre la molécula
reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o
“alostérica”, (del griego otra estructura).
* La unión de la molécula reguladora al “sitio de regulación”
induce un cambio conformacional reversible en la enzima que
causa una alteración de la estructura del centro activo y los
consiguientes cambios en sus propiedades cinéticas.
Sitio regulador
Centro activo
+
-
2. INTERACCIÓN PROTEÍNA-LIGANDO
Una proteína une más de una molécula de un mismo ligando
L
P
L
P
K1
L
L
P
K2
L
P
K3
L
L
L
L
K4
P
L
L
K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positiva
K1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa
K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad
Tratamiento de Scatchard permite calcular el número de sitios
de unión por molécula de proteína, la constante de unión
proteína-ligando y el tipo de cooperatividad
2.1. FUNCION DE SCATCHARD
La función de Scatchard, , se define como la razón entre la
concentración de ligando-unido y la concentración total de
proteína
[Ligandounido}
 = -----------------------[Proteína]
- Esta función es diferente de la función de saturación, que
representa el número de sitios ocupados partido por el número
total de sitios de unión que tiene la macromolécula.
Nº Sitiosocupados
Y = -----------------------Nº totalsitios
Nº sitios = (concentración de proteína) x (numero de sitios por
mol de proteína)
No total sitios = [P] n
En esta ec.
=Y n
Se deduce la relación
función de Scatchard
y Saturación
 --> función de Scatchard
Y --> función de saturación
L
P
L
n --> nº sitios por mol de proteína
Para deducir la ecuación de Scatchard consideraremos una proteína P, con
dos sitios de unión para el mismo ligando, L, que se unen independientemente
y con la misma afinidad a ambos sitios.
En el sistema no existe cooperatividad, 
K1 = K2 = K3 = K4=K
P
K1
L
K3
P
L
P
L
K4
K2
L
[Ligandounido}
 = -----------------------[Proteína]
P

PL  2PL2 
v
P   PL  PL2 
Po   P   PL  PL2 
La función de Scatchard para dos lugares equivalentes viene definida por:
Deducción Enzimología. Página 224 Nuñez de Castro 2001
K[L]
 = 2 ----------------1 + K[L]
Para un número n de lugares equivalentes de unión
K[L]
 = n ----------------1 + K[L]
n número de ligandos que pueden unirse por molécula de proteína
K es la constante de equilibrio de unión del ligando a cada centro (es la
misma para todos los lugares de unión n que tenga la proteína
[L] es la concentración de ligando libre
2.1.1. Linearización de la ecuación de SCATCHARD
K[L]
 = n ----------------1 + K[L]
v(1  K L )  nK L 
v  vKL   nK L 
Dividendo por [L] y despejando

[L]
= nK - K 
Representación de Scatchard para una proteína que
tiene 4 lugares de unión equivalentes

[L]
No cooperatividad
mM-1
m= -K
n
1
2

3
4
K es la constante de equilibrio de
cada uno de los sitios de unión
PERMITE
CALCULAR
NÚMERO DE
LIGANDOS QUE
SE UNEN POR
MOLÉCULA DE
PROTEÍNA
Linearización de la ecuación de SCATCHARD
Cuando las gráficas se desvían de la linealidad
Proteínas presentan cooperatividad
Cooperatividad positiva

[L]
mM-1
n
Cooperatividad negativa
1
2

3
4
5
6
Cálculo: EQUILIBRIO DE DIÁLISIS, CENTRIFUGACIÓN
2.2. TRATAMIENTO DE HILL
Enzimas presentaban cinéticas de saturación respecto al substrato se
desviaba del comportamiento hiperbólico michaeliano
Semejanza
Cinética sigmoidal
Curva de saturación de la hemoglobina
K [Po2]nh
Y = -----------------Y es saturación
nh
1
+
K
[Po
]
2
Po presión parcial de oxigeno
2
K constante de formación del complejo oxihemoglobina
K` = [Po2]nh0.5
[Po2]nh
Y = ------------------ [Po2]0.5 Presión da una saturación de 0,5
índice de Hill valor experimental
K` + [Po2]nh nh
(hemoglobina 2,8)
Tratamiento de Hill
Aplicada a las enzimas con cinética sigmoidal
v
Y = -----------Vmax
Saturación de la enzima
Snh
Y = ------------Snh0,5 + Snh
[Po2]nh
Y = --------------K` + [Po2]nh
S0,5 Concentración substrato la saturación
es igual ½ Vmax
nh igual a 1 es una saturación hiperbólica michaeliana
S0,5 = Km
S
Y = ----------- =
S0,5 + S
nh>1 Cooperatividad positiva
nh<1 Cooperatividad negativa
v
-----------Vmax
S
= ----------Km + S
vo
nh<1
nh=1
nh>1
Vmax Snh
vo = ----------------Snh0,5 + Snh
S
nh>1
nh=1
nh<1
1/S
1/S
1/S
1/vo
2.2.1-Linearización de la ecuación de Hill
S nh
nh
nh
nh
S

S
Y
S
0,5

 nh
nh
S
1 Y
S 0,5
1  nh
S 0,5  S nh
Y
log
 nh log S  nh log S 0,5
1 Y
Y
vo

1  Y V max  vo
Reacción enzimática la
fracción de saturación
v
Y
V max
vo
log
 nh log S  nh log S 0,5
V max  vo
Representando la ecuación lineal
La ecuación de una recta pendiente es el índice de Hill
vo
log
V max  vo
Log[S0,5]
m = nh
0
Obtención valor experimental del índice de Hill
Deducir la existencia de cooperatividad
Valor de S0,5
log [S]
S0,5 Concentración substrato para la cual la saturación es igual
a ½ de la velocidad máxima
2.2.2. Razón de saturación Rs. Significado biológico de la
cooperatividad positiva y negativa.
Rs, la razón de las concentraciones de substrato que dan como
resultado el 10% y 90% de saturación
Enzima michaelianas es
constante e independiente
S 0,9
de Km y Vmax
Rs = ----------S 0,1
Snh 0,9
Y = 0,9= -----------------0,9 Snh 0,5 = 0,1 Snh 0,9
Snh 0,5 + Snh 0,9
Snh 0,1
Y = 0,1= -----------------Snh 0,5 + Snh 0,1
0,1 Snh 0,5 = 0,9 Snh 0,1
9=
0,1 Snh 0,9
0,9 Snh 0,1
S 0,9
nh
Rs = ---------- =
S 0,1
81
nh = 1,0 valor de Rs es igual a 81
nh = 2,0 el valor de Rs es igual a 9,0
No cooperatividad
Cooperatividad positiva
nh = 0,5 el valor de Rs es igual a 6531 Cooperatividad negativa
Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la
concentración de sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de
una saturación del 10% al 90% Interruptores metabólicos
Enzimas con cinética hiperbólica, índice de Hill 1 se necesita
aumentar 81 veces
Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase
de una saturación del 10% al 90% se necesita aumentar 6561
veces. Amortiguadores de las variaciones de la [S].
Ej fosfatasa alcalina de E.coli suministra fosfato inorgánico.
3.MODELOS PROTEÍNAS ALOSTÉRICAS.
Proteína alostéricas actividad esta regulada por la unión no
covalente y reversible de moduladores: Se unen a sitios
distintos al sustrato
Transición alostérica hace referencia a transducción de
una señal a un lugar diferente ocupado por esa señal en la
proteína.
Efecto alostérico: Cambios conformacionales en una
enzima dan lugar a aumento o inhibición de la actividad
Transición alostérica homotrópica
cuando induce cambios en la unión del
mismo tipo de ligando
Transición alostérica heterotrópica
cuando induce cambios en la unión del
otro tipo de ligando
Hill no era posible determinar con exactitud las constantes de disociación y las constantes alostéricas
3.1. Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux
1. Las proteínas alostéricas son proteínas oligoméricas
2. Las subunidades (protomeros) ocupan posiciones
equivalentes, de manera que dentro del oligómero, existe al
menos un eje de simetria.
3. Cada protomero posee un sitio de unión (solo uno) para cada
uno de los diferentes ligandos: Activadores o inhibidores
3. El oligómero puede existir en dos estados conformacionales,
que designaremos por R (relajada, alta afinidad) y T (tensa,
baja afinidad) y que presentan afinidad diferente por un ligando
dado.
R
Relajada, alta afinidad
T
Tensa, baja afinidad
4. La conformación de la proteína cambia de de la forma R a la
forma T (o viceversa) se conserva la simetría del oligómero.
Los cambios R
T son concertados, no hay formas
híbridas, compuestas por subunidades (R-T)
* Si representamos la conformación de las subunidades en forma
T y R por un circulo y un cuadrado respectivamente, existe el
siguiente equilibrio:
T
Tensa, baja afinidad
R

T
L
R
Relajada, alta afinidad
5. No existirán especies híbridas (TR) ya que en tal caso se
perdería la simetría del oligómero.
*En otras palabras, todas las subunidades cambian de
conformación de una manera “concertada”, lo que le ha dado
también nombre al modelo: Modelo concertado.
6. Las formas R y T pueden poseer diferente capacidad catalítica
(siendo kcR y kcT las constantes catalíticas de las formas R y T,
respectivamente) o diferentes afinidades por los ligandos
sustratos, activadores o inhibidores.
KR y KT constantes de disociación intrínsecas de cada uno de los
protómeros de las formas R y T y el Substrato.
* En la siguiente figura, se representa el modelo concertado más sencillo de
una proteína dimérica que tiene un activador A, y un inhibidor I:
A
A
S
A
L
S
I
A
S
I
S
I
I
R
T
[T]
L = ------------
L cte de equilibrio entre las dos formas R y T.
[R]
Saturación por ligando
0.0
KT
KR
S
S
KR
KT
P
kcT
S
0.5
S
S
Cálculo de Y
Enzimología. Nuñez de
Castro
Pg 237
1.0
S
kcR
P
Parámetros describen el estado de un sistema alostérico
Y La función de saturación, la hemos definido anteriormente
como la razón entre el número de sitios ocupados partido por el
número total de sitios. Y= v/Vmax
L cte de equilibrio entre las dos formas R y T en ausencia de ligando.
n
[T]
L = ------------
número de sitios de unión
[R]
c constante ratio de las dos constantes de disociación

Concentración de ligando libre
[S]
 = -----------KR
L c  (1+ c  )n-1 +  (1 +  )n-1
Y=
L (1+ c  )n + (1 +  )n-1
KR
c = -----------KT
3.1.1.Enzimas alostéricas modelo tipo K
R
T
Relajada
Tensa
Misma constante catalítica kcR = kcT
KR
c = -----------KT
R mayor afinidad por el sustrato KR <<<KT
C
O
L c  (1+ c  )n-1 +  (1 +  )n-1
 (1 +  )n-1
Y=
Y=
L (1+ c  )n + (1 +  )n
L + (1 +  )n
1
Y

Ecuación
sigmoidal
 (1 +  )n-1
Y=
Y
L= 0
L + (1 +  )n
L=0
L= 10
No hay equilibrio de transconformación
L = 100
(Todo esta como R)
L =1000
la ecuación queda reducida a Ec. M-M

Y=
(1 +  )
S
S
v
Y  Km 

S
Km  S V max
1
Km

V max S
v
Km  S
Velocidad máxima no se ve alterada
La presencia del ligando afecta la afinidad del enzima por el sustrato
Modifica la Km Cambia la concentración de substrato para la cual
la saturación es semimáxima
Inhibidor desplaza el equilibrio hacia la forma T (KR <<<KT)
Km
Activador desplaza el equilibrio hacia la forma R
Km
Enzimas
3.1.2.
Enzimas
alostéricas
alostéricas
modelomodelo
tipo Vtipo V
R
T
Relajada
Tensa
Diferente constante catalítica kcR = kcT
KR
c = -----------KT
Igual afinidad por el sustrato KR = KT
C
1

L c  (1+ c  )n-1 +  (1 +  )n-1
Y=
L (1+ c  )n + (1 +  )n
Y=
1+
Saturación hiperbólica
Acción de los moduladores (activadores e inhibidores)
sobre la Vmax
Y
v
V max
Vmax = kcR R + kcT T
Suma de la contribución a la velocidad de la forma
transconformada R y de la forma transconformada T
A
VmaxA
vo
Vmax
Vmax I
Km
I
S
Fosforilasa b
activada por AMP
Aspartato quinasa (EC 2.7.2.4) de E.coli inhibe por
lisina
3.1.3.Enzimas alostéricas modelo tipo K mixto
Tanto la constante catalítica como la afinidad (Km) cambian
Resumen modelo MWC
- Sencillo
-Modelo da cuenta del comportamiento de proteínas que
muestran cinética sigmoide y que son oligomericas.
- Se adecua a la acción de activadores e inhibidores alostéricos
Limitación
No explica el compartamiento cinético de aquellas proteínas
que tienen cooperatividad negativa.
NOTA: Cinética sigmoide no es sinónimo de alosterismo. Hay proteínas con cinética
sigmoide no alestericas y enzimas alostericas con cinética hiperbólica (enzimas alostéricas
tipo V puro)
3.2.Modelo secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer
Ligando unido a uno de los protomeros induce un cambio conformacional
Ajuste
inducido
de Kosland Entrada de un segundo ligando
1.
+
Cooperatividad
positiva
-
Cooperatividad
negativa
Permite la presencia de formas híbridas, (prohibido en el modelo
concertado)
2. Explica tanto la cooperatividad positiva como negativa
3. Modelo concertado , sería un caso particular del modelo secuencial, en el
que se explica únicamente la cooperatividad positiva.
RESUMEN
TRATAMIENTO DE SCATCHARD
El tratamiento de Scatchard permite el estudio de la unión de una proteína con varios ligandos.
La representación linealizada de la ecuación permite obtener el número de ligando que se unen
por mol de proteína, así como la afinidad de los lugares de unión.
El signo de la cooperatividad se puede obtener de la representación linealizada
ECUACIÓN DE HILL
Derivada del estudio de la saturación de la hemoglobina es útil para explicar la saturación no
hiperbólica que se da en enzimas que se desvían del comportamiento Michaeliano,
monstrando curvas sigmoidales, con cooperatividad positiva, o hipérbolas no equiláteras
(curvas de cooperatividad negativa).
El índice de Hill (nh) es un parámetro experimental y no tiene que ser un número entero.
RAZON DE SATURACIÓN
La razón de saturación (Rs) entre concentraciones de substrato para dar una saturación del
90% a una concentración de substrato para la obtención de una saturación del 10% es 81, en el
caso de las proteínas con cinéticas michaelianas; es mucho menor para proteínas con
cooperatividad positiva, y muchísimo mayor para proteínas con cooperatividad negativa.
Enzimas con cooperatividad positiva puede comportarse como un interruptor metabólico; por
otra parte, una proteína con cooperatividad negativa puede servir para mantener el mismo flujo
a pesar de las posibles variaciones en la concentración de substratos.
MODELO ALOSTÉRICO CONCERTADO
Modelo propuesto por Monod, Wyman y Changuex. Explica de forma clara y elegante la
mayor tipo de procesos alostéricos de regulación.
Esquema mecánico simple, proteínas oligoméricas, con ejes de simetria
Clasifica en tres tipos de enzimas alostéricas.
Tipo K, son proteínas oligoméricas que presentan cooperatividad positiva, asi como la
acción de inhibidores y activadores.
Tipo V explica igualmente la acción de activadores e inhibidores sobre la velocidad
máxima sin cambiar la constante de afinidad por el substrato.
Tipo mixto, una mezcla de ambos modelos.
MODELO ALOSTÉRICO CONCERTADO
Modelo más potente , tiene mayor complejidad , no es muy utilizado en
Enzimología .
Práctica el instrumento más utilizado es el índice de Hill