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Enzimas: mecanismo, cinética y regulación Enzimas: mecanismo, cinética y regulación ➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción ➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores ➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición ➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas Para © Enrique Castro Los trabajos de terceros retienen su licencia original 2011 Enrique Castro 1 Propiedades de los enzimas Propiedades de los enzimas ➢Proteínas • Ribozimas son excepción ➢Catalizadores • No alteran la posición del equilibrio (Keq, ΔG) ➢Eficacia • Aceleran enormemente la velocidad de reacción ➢Especificidad • Una única reacción • Sin reacciones colaterales • No absoluta: varios sustratos Papaína: inespecífica Tripsina: muy específica (R,K) Trombina: absolutamente específica (R en secuencia definida) ➢Estereoselectivas • Complementariedad 3D 2011 Enrique Castro DHAP Dihidroxiacetona-fosfato GA3P L-gliceraldehído-3-fosfato 2 Nomenclatura y clasificación de enzimas Nomenclatura y clasificación de enzimas ➢Clases • ➢Subclases • D-Glucosa + ATP 1: Oxidoreductasas D-Glucosa-6-P + ADP Hexoquinasa ATP:glucosa fosfotransferasa EC 2.7.1.1 2: Transferasa 7: Fosfotransferasa 1: grupo aceptor -OH 1: compuesto aceptor • H: Deshidrogenasas • O2 : Oxigenasas (mono-, di-) 2: Transferasas • P: quinasas • NH2: aminotransferasas (transaminasas) • Ac: acetil-transferasas 3 2011 Enrique Castro Componentes adicionales: Cofactores Componentes adicionales: Cofactores ➢Cofactor • No proteico, termoestable, bajo Mrr • Unido permentemente • Ión metálico esencial para catálisis Covalente: grupo prostético Cofactores aportan reactividad química especial Holo-enzima = apo-enzima + cofactor Xantina oxidasa ➢Coenzima • Molécula orgánica esencial para catálisis • Unión transitoria: co-sustrato 2011 Enrique Castro 4 Curvas de progreso de reacción Curvas de progreso de reacción Keq v = − k1 A k-1 Constante de velocidad P d [ A] d [P] = = k 1⋅[ A] − k −1⋅[ P ] dt dt Curva exponencial Ecuación de velocidad [ A]=[ A]0⋅e−kt En el equilibrio no hay más reacción neta: vA→P = vP→A v eq = k 1⋅[ A]eq − k −1⋅[ P ]eq =0 ; K eq = k 1 [ P ]eq = k −1 [ A]eq ➢Velocidad inicial v0 • Elimina dependencia de [P] v0 = − d [ A]0 d [ P ]0 = = k 1⋅[ A]0 − k −1⋅[ P ]0 dt dt [P]0=0 v0 v 0 = k 1⋅[ A]0 5 2011 Enrique Castro Velocidad y orden de reacción Velocidad y orden de reacción ➢Reacciones de orden 0 A • No depende de [A] k P v 0= d [ P] = k dt [k] = M·s-1 ➢Reacciones de 1er orden (orden 1) • Dependencia lineal de [A] A v0= ln k P −d [ A] =k⋅[ A] dt [k] = s-1 [ A] =−kt ; [ A]=[ A]0⋅e−kt [ A]0 ➢Reacciones de 2º orden (orden 2) • Reacciones bimoleculares reales A+B 2A k k P P d[P] = k⋅[ A][ B] dt d [P] v 0= = k⋅[ A]2 dt v 0= Pseudo 1er orden [k] = M-1·s-1 • [B] constante (ej. Agua) v 0= d [ P] =k [ B]⋅[ A]=k '⋅[ A] dt k ' =k [ B] • Etapa limitante monomolecular A+A A* 2011 Enrique Castro k k' k>>k' A + A* P 6 Enzimas: mecanismo, cinética y regulación Enzimas: mecanismo, cinética y regulación ➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción ➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores ➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición ➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas 7 2011 Enrique Castro Energía de activación y catálisis Energía de activación y catálisis [P] [S] G 0=−RT⋅ln K eq 0 G S P = G RT ln Ecuación de Eyring k B T RTG k = ⋅e h Distribución de Boltzmann Ni g = i⋅e k N Z Keq, ΔGº indican dirección de la reacción NO indican si ocurre rápidamente ‡ Ei BT Catalizador reduce ΔG‡ sin afectar a ΔGO ΔG‡ indica velocidad de la reacción 2011 Enrique Castro 8 Centro activo Centro activo ➢Región catalítica especializada Centro activo de Lisozima Proteína = andamiaje para centro activo en posición • Hendidura 3D superficial (unión S) • Volumen reducido ➢Microentorno único • Agua excluída (salvo reactiva) • pKa especiales ➢Multiplicidad de enlaces débiles • Energía de unión alta (15-50 kJ·mol-1) • Kd baja (10-2-10-9 M) Unión de sustrato a RNasa ➢Especificidad=complementariedad • Forma 3D complementaria E-S • Enlace direccionales • Llave en cerradura / Ajuste inducido 9 2011 Enrique Castro Mecanismos generales de catálisis (1) Mecanismos generales de catálisis (1) ➢Estabilización del estado de transición • Desolvatación del sustrato (sustituye por unión ES) • Distorsión del sustrato (“tensión” similar a TS) • Alineamiento de grupos catalíticos • Reducción de entropía de reactivos Estado de transición Energía de unión: ΔH: Múltiples enlaces débiles E-S ΔS: Alineamiento adecuado La energía de unión ΔGB reduce la energía de activación ΔG‡ 2011 Enrique Castro 10 Catálisis: unión al estado de transición Catálisis: unión al estado de transición 2011 Enrique Castro 11 Efectos entrópicos: alienamiento de grupos Efectos entrópicos: alienamiento de grupos ΔG=ΔH – TΔS Reducción de ΔS requiere inversión en ΔH ΔH: Red de enlaces débiles E-S 2011 Enrique Castro 12 Mecanismos generales de catálisis (2) Mecanismos generales de catálisis (2) ➢Catálisis ácido-base general • Aporte/secuestro de H+ o pares e• Ionización de grupos • Ataques nucleofílicos a >C=O Estado de transición Sustrato (péptido) ➢Catálisis redox • Cofactores redox: grupos oxidantes/reductores X: grupo del enzima ➢Catálisis covalente • Intermediario unido al enzima • Ruta alternativa A—B H2O lento A+B A—B + X: A—X rápido H2O rápido A—X + B: A + X: ➢Catálisis por iones metálicos • Reactividad especial de orbitales d Mg:complejo de coordinación octaédrico (6 O) Enlaces de coordinación Actividad redox 13 2011 Enrique Castro Unión ES: especificidad y estereoselectividad Unión ES: especificidad y estereoselectividad ➢Complementariedad enzima-sustrato • Llave en cerradura (Fischer) • Estereoselectividad: unión a 3 sitios lisozima ➢Ajuste inducido Hexasacárido substrato Encaje inducido en la hexoquinasa • Complementario al unirse (Koshland) • Energía de unión : cambio conformacional 2011 Enrique Castro Inactiva aa catalíticos descolocados Activa aa catalíticos en posición 14 Mecanismos catalíticos: Anhidrasa carbónica Mecanismos catalíticos: Anhidrasa carbónica CO2 + HO HCO3 — 2— pKa(H2O) = 14 A pH 7 [HO—]= 10-7 M [HO—]/[H2O] = 10-7/55.5 ≈ 2·10-9 Dramático aumento de acidez de H2O pKa = 7 B: BH+ Transfiere H+ a superficie de proteína (y al medio) Estabilización por par iónico 2011 Enrique Castro 15 Mecanismos catalíticos: serínproteasas Mecanismos catalíticos: serínproteasas 2011 Enrique Castro 16 Mecanismos catalíticos: serínproteasas Mecanismos catalíticos: serínproteasas 17 2011 Enrique Castro Coenzimas de nicotinamida Coenzimas de nicotinamida Nicotinamida reducida Pliege de Rossmann en la ADH de hígado Lactato + NAD+ AMP Nicotinamida adenina dinucleótido, NAD+ Nicotinamida oxidada Piruvato + NADH + H+ H+ adenina 2'P en NADP NAD+ NADH • Coenzimas difusibles • Unión transitoria al enzima • Co-sustratos 2011 Enrique Castro 18 Vitaminas B3 Vitaminas B3 19 2011 Enrique Castro Coenzimas de flavina Coenzimas de flavina Riboflavina vit. B2 Ac. Succínico • Coenzimas no difusibles • Unión firme al enzima • Grupo prostético (covalente) 2011 Enrique Castro Ac. Fumárico FAD FADH2 20 Actividad enzimática: Dependencia de T y pH Actividad enzimática: Dependencia de T y pH ➢Dependencia de T • Energía cinética molecular • Q10 • Estabilidad de la proteína Q 10 = Ecuación de Arrhenius V T 10 VT k = A⋅e Curva bifásica asimétrica Desnaturalización térmica Ea RT 20 40 60 80 T, ºC 100 ➢Dependencia del pH • Titulación de grupos ionizables esenciales (Henderson-Hasselbalch) • pKa aa catalíticos • Estabilidad de la proteína Grupo desprotonado catalítico Grupo protonado catalítico Curva acampanada simétrica 2011 Enrique Castro 21 Enzimas: mecanismo, cinética y regulación Enzimas: mecanismo, cinética y regulación ➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción ➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores ➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición ➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas 2011 Enrique Castro 22 Cinética enzimática: curva hiperbólica y saturación Cinética enzimática: curva hiperbólica y saturación Saturación: Vmax v no aumenta al [S] v ≠ k⋅[ A]n Saturación implica unión enzima-sustrato Curva de velocidad no canónica v = k⋅[ S ] k ' [S ] E+S E·S Etapa rápida cuasi-equilibrio P+E Etapa lenta limitante, acúmulo ES 23 2011 Enrique Castro Cinética de MichaelisMenten Cinética de MichaelisMenten E+S k1 k-1 ES k2 P+E 1ª simplificación: v0 A t=0, [P]=0 y k-2 no afecta d [P] = v 0 = k 2⋅[ ES ] dt d [ ES ] =k 1 [ E ]T −[ ES ][ S ] − k −1⋅[ ES ] − k 2⋅[ ES ]=0 dt k 1 [ E ]T [S ] [ E ]T [ S ] [ ES ]= ; [ ES ]= k 1 [S ] k 2 k −1 k k [S ] 2 −1 k1 k 2 [ E ]T [S ] v 0=k 2⋅[ ES ]= k k [S ] 2 −1 k1 k 2 k −1 K M= k1 V max=k 2⋅[ E ]T V ⋅[S ] v 0 = max K M [S ] 2ª simplificación: Estado estacionario [ES] no varía (k1>>k2) Permite calcular [ES] VMax: V cuando [S]∞ [S] >> KM Orden 0 [S] << KM Orden 1 Ecuación de Michaelis-Menten 2011 Enrique Castro KM: [S] a la que V=½Vmax 24 Parámetros cinéticos: K y k Parámetros cinéticos: KMM, V , Vmax y kcat max cat ➢Constante de Michaelis, KM • Afinidad E-S • Kd de ES Si k2<< k-1 K M = k 2k −1 k −1 ≃ =Kd k1 k1 Alta KM, baja afinidad Baja KM, alta afinidad ➢Velocidad máxima, Vmax • Saturación. • Actividad enzimática: [E]T unidades V max =k 2⋅[ E ]T • Usuales: μmol/min = UI • SI: catal = mol/s Vmax mide actividad enzimática, [E]T ➢Constante catalítica, kcat • k de paso limitante P • 1er orden: Nº de recambio k cat = V max [ E ]T Kcat: nº de molécula S convertidas por segundo 25 2011 Enrique Castro Límite de velocidad: Eficiencia catalítica Límite de velocidad: Eficiencia catalítica E+S k1 k-1 ES k cat⋅[ E ]T [ S ] v 0= K M [S ] k2 Si [S] << KM kcat baja • KM debe ser bajo • Alta afinidad ES KM baja • alta afinidad, disociación lenta • kcat lenta 2011 Enrique Castro P+E Constante bimolecular de 2º orden k v 0= cat ⋅[ E ]T [ S ] KM k cat v diffusion KM Velocidad máxima bimolecular: Límite de difusión (nº choques) vdifusion=108-109 M-1·s-1. kcat elevada • KM no puede ser bajo • Afinidad ES limitada KM alta • Baja afinidad, disociación rápida • kcat rápida 26 Gráfico de LineweaverBurke Gráfico de LineweaverBurke V max⋅[ S ] ; K M [S ] 1 K M [S ] = v 0 V max⋅[S ] 1/v0, (μmol/min)-1 v 0= KM 1 [S ] = v 0 V max⋅[ S ] V max⋅[ S ] 1 KM 1 1 = ⋅ v 0 V max [ S ] V max Y= p=KM/Vmax 1/Vmax KM 1 ⋅X V max V max 1/[S], mM-1 -1/KM 27 2011 Enrique Castro Gráfico de EadieHofstee Gráfico de EadieHofstee v 0= V max⋅[ S ] K M [S ] Vmax v 0⋅ KM v 0=V max [S ] v v 0 =−K M⋅ 0 V max [S ] v0, (μmol/min) v 0⋅K M v 0⋅[ S ]=V max⋅[S ] p= -KM Vmax/KM v v 0 =−K M⋅ 0 V max [S ] Y =−K M⋅X V max 2011 Enrique Castro v0/[S], (μmol/min)/mM 28 Mecanismo de reacciones bisustrato Mecanismo de reacciones bisustrato ➢Mecanismo secuencial ordenado • ➢Mecanismo secuencial al azar • ➢Mecanismo ping-pong • 29 2011 Enrique Castro Cinética de reacciones bisustrato Cinética de reacciones bisustrato ➢Reacciones secuenciales 1/v0 • Ordenadas / al azar • Complejo ternario EAB 1/[A] ➢Reacciones ping-pong 1/v0 • Ordenadas • Sin complejo ternario EAB • Intermediario enzima modificada 1/[A] 2011 Enrique Castro 30 Mecanismos de inhibición Mecanismos de inhibición ➢ Inhibición reversible • Competitivos • Acompetitivos • No-competitivos: puros/mixtos Inhibidor en equilbrio con E KI: constante de disociación de EI Eliminación del inhibidor restaura actividad enzimática E +I KI Análogos del estado de transición • Muy baja KM (KI) • Competitivos EI [ E ]⋅[ I ] [ EI ] [I ] =1 KI KI= ➢ Inhibición irreversible • Agentes desnaturalizantes • Reactivos de centro activo • Inhibidores suicidas Fármacos inhibidores irreversibles • Penicilina / transpeptidasa bacteriana • Aspirina / COX • Disulfiram / AlDH (alcohol) Efectos cinéticos H2O +O2 • Vmax (kcat o [E]T) • KM H2O2 Inhibidores suicidas • Alopurinol / Xantina oxidasa • 5-Fluorouracilo / Timidilato sintasa • Deprenil / MAO Venenos inhibidores irreversibles • Inhibidores AchE (organofosforados) • Amanitina / RNApol Inactivación enzimática permanente Recuperación requiere biosíntesis 31 2011 Enrique Castro Inhibición irreversible: bloqueo aa activo Inhibición irreversible: bloqueo aa activo ➢Cisteín-enzimas • Agentes S-alquilantes (iodoacetato, pCl-Hg-benzoato) I2 antiséptico ➢Serín-enzimas • Organofosfatos Intoxicación por pesticidas Reactivación por pralidoxima 2011 Enrique Castro 32 Inhibición irreversible dirigida Inhibición irreversible dirigida 33 2011 Enrique Castro Inhibición competitiva Inhibición competitiva [ E ]⋅[ I ] [ EI ] [I ] =1 KI KI= ES P +E v0 = KI V max⋅[ S ] ⋅K M [ S ] Fármacos inhibidores competitivos EI • • • • 1/v0, (μmol/min)-1 1 ⋅K M 1 1 = ⋅ v 0 V max [ S ] V max 1/Vmax Vmax constante ap K M = K M⋅1 [I ] KI ap V max =V max constante p=KM/Vmax -1/KM 2011 Enrique Castro 1/[S], mM-1 v v 0=−⋅K M⋅ 0 V max [S ] KMap Vmaxap = +I I=0 Metotrexato / DHF reductasa Ibuprofeno / COX Sildenafilo / PDE V Estatinas /β-HMGCoA reductasa Inhibición superable por aumento de S v0, (μmol/min) E+ S + I I se une a E: EI Excluye unión S p= -KM I=0 +I Vmax/KM v0/[S], (μmol/min)/mM 34 Inhibidores enzimáticos análogos de sustrato Inhibidores enzimáticos análogos de sustrato Análogo del sustrato de la DHF reductasa humana Análogo del sustrato de la DHPS bacteriana 35 2011 Enrique Castro Inhibición acompetitiva Inhibición acompetitiva I se une sólo a ES: ESI E+ S [ E ]⋅[ I ] KI= EI [I ] =1 KI ES + I KI ES I P +E V max ⋅[ S ] v0= KM [ S ] Fármacos inhibidores acompetitivos • Camptotecina / Topo I; etopósido / Topo II • Análogos 2º sustrato secuencial/ping-pong /Vmax v 0=− +I KMap Vmaxap p=KM/Vmax -/KM 2011 Enrique Castro I=0 1/[S], mM-1 KM [I] 1 KI V max V ap max= [I] 1 KI ap KM= v0, (μmol/min) 1/v0, (μmol/min)-1 1 KM 1 = ⋅ v 0 V max [S ] V max +I K M v 0 V max ⋅ [S ] I=0 p= -KM/ Vmax/ Vmax/KM v0/[S], (μmol/min)/mM 36 Inhibición no competitiva pura Inhibición no competitiva pura E+ S + I [ E ]⋅[ I ] [ EI ] [I ] =1 KI KI= ES + I KI P +E V max ⋅[ S ] v0 = K M [ S ] KI EI+S ES I 1 ⋅K M 1 = ⋅ v 0 V max [ S ] V max KMap = Vmaxap +I K ap M=K M V max V ap max= [I] 1 KI I=0 p=KM/Vmax Inhibición insuperable por aumento de S 1/[S], mM-1 -1/KM constante • Digoxina / Na+ /K+-ATPasa •Tacrina / AchE • Análogos alostéricos v V v 0=−K M⋅ 0 max [S] 1/v0, (μmol/min)-1 /Vmax Fármacos inhibidores no-competitivos Vmax/ v0, (μmol/min) I se une a E y ES p= -KM constante I=0 +I Vmax/KM v0/[S], (μmol/min)/mM 37 2011 Enrique Castro Inhibición no competitiva mixta Inhibición no competitiva mixta I se une a E y ES [ E ]⋅[ I ] [ EI ] [I ] =1 KI KI= k2 E+ S + I KI ES P +E + [ ES ]⋅[ I ] I K ' I = [ ESI ] K'I EI+S ' =1 ES I '/Vmax 1/v0, (μmol/min)-1 1 ⋅K M 1 ' = ⋅ v 0 V max [ S ] V max +I I=0 p=KM/Vmax 1/[S], mM -1 -'/KM 2011 Enrique Castro k'2 [I] K 'I P +E V max ⋅[ S ] ' v0= KM [ S ] ' KMap Vmaxap [I] KI ap K M = K M⋅ [I] 1 K 'I V max ap V max = [I ] 1 K 'I 1 Inhibición insuperable por aumento de S 38 Enzimas: mecanismo, cinética y regulación Enzimas: mecanismo, cinética y regulación ➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción ➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores ➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición ➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas 39 2011 Enrique Castro Mecanismos genéricos de regulación enzimática Mecanismos genéricos de regulación enzimática ➢Regulación alostérica • Mod. Reversible • Proteolisis (irreversible) Activador heterotrópico: aumenta unión de sustrato Quinasas Señalización Inhibidor heterotrópico: dificulta unión de sustrato Zimógenos pancreáticos Coagulación Caspasas apoptóticas ➢Regulación de la Expresión • Inducción/represión • Ubiquitinación: degradación • Expresión diferencial de isoenzimas 2011 Enrique Castro • Efector <> Sustrato • Tanto ⊕⊖ • Sustrato actuando en otro sitio • Usualmente ⊕ • Modulador se une a otro sitio • Regula KM o kcat ➢Regulación covalente Efectos heterotrópicos Efectos homotrópicos gen biosíntesis [Proteína] degradación aa Expresión es un estado estacionario 40 Regulación alostérica: cooperatividad Regulación alostérica: cooperatividad 41 2011 Enrique Castro Cooperatividad cinética Cooperatividad cinética Cinética no michaeliana (sigmoidal) Análisis de cooperatividad: representación de Hill Vmax ½Vmax K0.5 2011 Enrique Castro 42 Cinética cooperativa Cinética cooperativa ➢ K enzimas ➢ V enzimas • Efector modula KM • Efector modula Vmax Cinética sigmoidal: activación/inactivación como interruptor (switch-like) 43 2011 Enrique Castro Modelos de cooperatividad Modelos de cooperatividad ➢Modelo concertado • Dos estados conformacionales • Efector cambia equilibrio T-R • Inhibidor T, activador R ➢Modelo secuencial • Subunidades cambian separadamente • Múltiples formas en equilibrio Equilibrio R-T L = T/R Stryer p. 282 fig. 10,15 2011 Enrique Castro 44 Reg. por modificación covalente reversible Reg. por modificación covalente reversible ➢Uso regulador • Reversible • Modula actividad ➢Uso no regulador Acilación • Activación constitutiva Farnesilación -carboxilación • Anclaje sulfatación 2011 Enrique Castro Funciones específicas no reguladoras 45 Fosforilación como mecanismo regulador Fosforilación como mecanismo regulador ➢Enzimas modificadoras de proteínas • Quinasas / fosfatasas • Actividad / unión ➢Dianas fosforilables Pi: • 2 cargas, 3 pdh, tetraédrico (capacidad enlazante, reorganización) • Reacción rápida • ATP ubicuo ΔG≈-25 kJ/mol Δratio P/D x104 Proteína quinasa • Múltiples sitios de fosforilación • Cambio estado conformacional • Actividad / unión Forma fosforilada Forma desfosforilada Fosforilación ≠ activación • Actividad enzimática Proteína fosfatasa • Capacidad de unión •Reclutamiento terminación de la señal •Translocación ➢Organización en cascada • Activación secuencial • Amplificación MKKK señal MKK ⊕ A A* 10 amplificación x10 ⊕ B B* 100 2011 Enrique Castro MAPK ⊕ C C* 1000 46 Secuencias diana de fosforilación Secuencias diana de fosforilación Cada quinasa fosforila -OH en secuencias específicas • S/T: quinasas efectoras • Y: transducción • H: quinasas efectoras Cada proteína puede contener múltiples dianas para varias quinasas ➢ Múltiples efectos • P constitutiva • Localización secuestro • Activación/inactivación • Magnitud variable 47 2011 Enrique Castro PKA: ejemplo de enzima reguladora PKA: ejemplo de enzima reguladora PKA • • • • AKAP localiza R Heterotetrámero R2C2 4 sitios cAMP, cooperativos S/T-quinasa Diana RRpS/T Subunidades R ligan 4 cAMP (cooperativo) Secuencia —RRGAI— pseudosustrato Centro catalítico libre, activo Activación cooperativa Actividad quinasa Subunidades R Inhiben a sub. C 100%- Subunidades C Fosforilan dianas sigmoidal ≈10 µM 50%- Umbral de activación [cAMP]i 2011 Enrique Castro proteína proteína -RRpS/T- -RRpS/TATP ADP OFosforilación de proteínas diana (secuencia específica) OH Pi 48 Reg. por proteolisis: zimógenos pancreáticos Reg. por proteolisis: zimógenos pancreáticos Zimógenos inactivos (Gránulos de almacenamiento) Activación proteolítica (extracelular) Activación por proteolisis en cascada Feedback ⊕ explosivo Proteolisis re-posiciona el centro activo 49 2011 Enrique Castro Activación por proteolisis: coagulación Activación por proteolisis: coagulación Proteasa activa Fibrinógeno Dom. Proteasa inactiva Activación por proteolisis en cascada Dom. Proteolisis por trombina Fibrinopéptidos AyB GHR Monómero de fibrina GPR Polimerización fibrina • Unión - GHR • Unión - GPR 2011 Enrique Castro 50 Isoenzimas como mecanismo regulador Isoenzimas como mecanismo regulador Hexoquinasas I-III ➢Isoenzimas • Igual reacción • Diferente cinética • Diferente localización • Diferente expresión • KM Gluc baja (0.1 mM, alta afinidad) • Inhibición por producto Ajuste fino del metabolismo en cada tejido o compartimento Hexoquinas IV (glucoquinasa) • KM Gluc alta (10 mM, alta afinidad) • SIN inhibición por producto LDH H4 LDH M4 • KM Lac baja (alta afinidad) • Inhibición alostérica Pyr • KM Lac alta (baja afinidad) • No efecto alostérico Pyr Lac Pyr NAD+ Pyr NADH Adaptado producción aerobia Pyr NADH Recambio de isoenzimas LDH en corazón (adaptación a aerobio) Lac NAD+ Adaptado producción anaerobia Lac 51 2011 Enrique Castro Regulación de rutas metabólicas Regulación de rutas metabólicas retroalimentación ➢Enzimas reguladas/reguladoras • Reacciones más lentas (paso limitante) • Inicio/ramificación/fin de rutas (etapa de compromiso) •Regular actividad •Regular expresión Paso limitante retroalimentación ➢Retroalimentación (feedback) • Usualmente negativo • Precursores ⊕ / Productos finales ⊖ ➢Compartimentación • Separar tras membranas • Regulación independiente en zonas • Transporte regulado g g' Etapa de compromiso 2011 Enrique Castro 52 Enzimas como marcadores Enzimas como marcadores ➢Ensayos enzimáticos • Medida Vmax (conocer KM) • Identificació de isoenzimas (selectividad tisular) CPK3 CPK2 2011 Enrique Castro 53
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