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Amplificación de ADN in vitro:
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Objetivos
Conocer:

Los fundamentos de la técnica de amplificación de
DNA por PCR

Usos y aplicaciones del PCR

Ventajas y desventajas del PCR
PCR
Polymerase Chain Reaction
Es
la amplificación de DNA in vitro por medio de la
polimerización en cadena de DNA utilizando un
termociclador.
El
propósito del PCR es hacer muchas copias de un
fragmento de DNA.
Se
realiza la amplificación de un segmento específico
de DNA, teniendo poco material disponible.
Polimerasa Chain Reaction: Reacción en
Cadena de la Polimerasa

Fue diseñada por el Dr.
Kary Mullis en 1987.

Ganó el premio Nóbel de
Química en 1993 por su
invento.

Utilizo el PCR para
amplificación del gen de
-hemoglobina humana, y
el diagnostico prenatal de
anemia falciforme.
Termociclador
La
PCR se realiza
en un “Thermo
Cycler”
Termociclador.
Es
una máquina
que calienta y enfría
la reacción en
periodos cortos de
tiempo.
El proceso de “PCR” incluye 3 pasos
básicos que se repiten 25 veces o más:
1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble cadena
de ADN y convertirla en cadena sencilla.
-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a
40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-

2. Apareamiento o “anneling”:

Los cebadores “primers” previamente diseñados,
reaccionan con la cadena sencilla de ADN y se
pegan en lugares específicos por
complementariedad de bases. Para esto, se baja la
temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La
temperatura y el tiempo puede variar entre primers
según sea el caso.
3. Polimerización o Extensión.
Una Polimerasa de ADN extiende los “primers”, en el
espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca
dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el
DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNA molde
Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según
sea necesario)
Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.
En el PCR hay una amplificación exponencial
Reactivos necesarios para PCR:

Amortiguador (Buffer)

MgCl2: Es un cofactor para la función de la polimerasa-

dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP,
dCTP, dTTP.
-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño
del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a
amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb,
necesitamos más concentración de dNTPS para el de
5500pb.
Reactivos necesarios para PCR:



Cebadores “primers”: Son secuencias cortas
de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud,
complementarias a una región del DNA que se
quiere amplificar.
ADN molde: El ADN a amplificar puede tener
desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.
El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre
400-500 ng.
Taq Polimerasa
Polimerasa
•En un principio, la polimerasa de DNA que
se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero
esta es sensitiva a alta temperatura, por lo
que había que añadir enzima fresca al
comenzar el tercer ciclo.
•Se
reemplazo la enzima por la de la
bacteria “Thermus aquaticus” conocida
como Taq pol
Análisis de la Muestra

La detección del producto de la
PCR se realiza normalmente
mediante
corrido
electroforético.

Dependiendo del tamaño de la
amplificación y la resolución
que deseemos utilizaremos
diferentes medios (agarosa,
poliacrilamida)
a
distintas
concentraciones.
Análisis de la Muestra
• La posterior visualización se puede realizar con
bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de
plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecíficos se pegan a
varios sitios)
Análisis de la Muestra


En algunos casos, los productos
amplificados poseen secuencias que son
reconocidas por endonucleasas
Hibridación, Southern Blot
Se puede amplificar directamente de:

ADN genómico

cDNA (RT-PCR)
Aplicaciones
Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B
y C, papiloma virus, HIV, entre otros
Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o
muerto, análisis de fósiles

Mutagénesis dirigida (cambios en la información
contenida a través de “primers” con mutaciones)


Investigación forense

Pruebas de paternidad
Aplicaciones
Criminalística

Ejemplo de un caso de
criminalística resuelto
utilizando electroforesis en
gel vertical de acrilamida.

Si se observan los patrones
bandas podrá comprobarse
como los perfiles obtenidos
en las manchas de sangre
encontradas en el sombrero
(Hat) y pantalón (Jeans) del
sospechoso (S) coinciden
con el perfil genético de la
víctima (V)
Utilidad del PCR
Ventajas del “PCR”

A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener
una cantidad considerable para el estudio que se vaya a
realizar.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y
análisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o
muerto.

Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense,
diagnósticos, análisis prenatales, etc.
Desventajas del “PCR”

Se puede reproducir solamente partes del genoma en
donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de
20 – 40 pb.

Se necesitan “primers” específicos que sean
complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo
investigador o de cualquier otro)
Materiales Para PCR


Termociclador “Thermo cycler”
Microcentrífuga

Micropipetas de 2, 20 y 200 ul

Microtubos para “PCR”, estériles

Puntas estériles

Agua destilada, desionizada y
estéril

ADN molde (ADN en estudio)

Primer Forward y Reverse

dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP de [25 μM] c/u)

10X buffer para PCR (Solución
amortiguadora para “PCR”)

MgCl2 (25 mM)

BSA

Polimerasa Taq