Download PCR - Blog de Química Biológica Patológica

Química Biológica Patológica
Técnicas de Biología Molecular
aplicadas a Bioquímica Clínica
2015
Tema 2
 Dra. Silvia Varas
[email protected]
Tema 2
PCR
 Historia
 Bases
 Optimización de una reacción de
PCR

APLICACIONES DE PCR








MUTAGENESIS
RT-PCR
PRODUCCION DE SONDAS
DETECCIÓN DE INFECCIONES BACTERIANAS Y
VIRALES
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
HEREDITARIAS
ESTUDIOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR
ESTUDIOS DE MEDICINA FORENSE
ESTUDIOS DE FILIACIÓN

Un poco de historia…



La reacción en cadena de
la polimerasa (PCR): no fué
un descubrimiento pero fué
mas que una invención
Una
ADN
polimerasa
especial (Taq) es usada
para hacer muchas copias
de una corta longitud de
ADN (0,1-10 Kb) y que esta
definida por cebadores o
primers
Kary Mullis, el inventor de
la PCR fue premiado en
1993 con el Premio Nobel
en Química
Camino Biotecnológico
Life at High Temperatures
by Thomas D. Brock
Biotechnology in Yellowstone
© 1994 Yellowstone Association for Natural Science
http://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27
En el año 1960, el microbiólogo Dr.



Steamboat Geyser:
Thermus aquaticus
Taq DNA polymerase
Thomas Brock viaja al Parque
Yellowstone National (Wyoming) para investigar a los
microorganismos termófilos que viven en el calor de los géiser. El
descubrió una bacteria de la especie de la Eubacterias que vivía a
altas temperaturas en los géiser Barco de vapor (Steamboat
Geyser) del parque: Thermus aquaticus
En 1976 se purificó la Taq DNA polymerasa desde Thermus
aquaticus.
En 1983 la empresa Cetus Corporation patentó la técnica y el uso
de la enzima DNA polimerasa de Thermus aquaticus y sentó las
bases para el desarrollo de esta tecnología
Hubo en paralelo un desarrollo de un blocks de calentamiento
programables (termocicladores)
Termocicladores para PCR
CUIDADOS!
Separación Física: Estructura de un
laboratorio de biología molecular
(PCR)
El principal agente contaminante es el usuario!
Área 1
Área 2
Preparación de
los reactivos
Preparación de
las muestras
Área 3
Amplificación
de las muestras
(PCR)
Material Contaminante
Pre-PCR
Post-PCR
Área 4
Detección de
los resultados
Separación Física :Estructura de un
laboratorio de biología molecular (PCR)
Área 1
Área 2
Preparación de
los reactivos
Preparación de
las muestras
Prohibida la
entrada de toda
fuente de ADN.
Uso de kits para
minimizar manipulación.
Alicuotar los
reactivos
Almacenamiento
dentro del área.
Preparar mezclas
de reacción.
Uso de gabinetes
con UV o flujo
laminar.
Almacenamiento
dentro del área.
Uso de gabinetes
con UV.
Área 3
Amplificación
de las muestras
(PCR)
Área 4
Detección de
los resultados
Disminuir la formación de
aerosoles:
•Centrifugar antes de abrir los tubos
•Abrirlos con cuidado
•Pipetear con cuidado
Si se requiere re-amplificar:
•Limpieza de las cubas (depurinación
con HCl 1N)
•Cubrir transiluminador con un film
Contaminación: Riesgos y Mecanismos
 Cuando la PCR se realiza en un laboratorio
sala separadas para cada etapa).
común(sin
 No existe un conjunto de pipetas dedicadas a cada
etapa (preparación, PCR, análisis).
 Uso de material no estéril o contaminado.
 Formación de aerosoles (pipeteo o centrifugación).
 Contaminación humana (secreciones, saliva, cabellos,
etc.)
 Arrastre de muestra o carryover.
Control de Contaminación
Buenas prácticas de laboratorio
Movimiento unidireccional (no transportar
elementos de post a pre PCR).
Uso de elementos específicos para cada área.
Uso de consumibles de alta calidad
Uso de tips con filtro o de desplazamiento
positivo.
Evitar el uso de baños de agua o de hielo.
El ciclo de amplificación de PCR
Cada ciclo requiere tres pasos de
temperaturas para completar un
ronda de la síntesis de ADN.
primers
DNA producto
PCR: cinética
nº ciclos
El perfil de temperatura de un ciclo
de PCR es controlado por el programa
del termociclador.
 Hay un incremento exponencial del
producto de PCR hasta cerca del ciclo nº
30.

DNA producto
primers
Actividad Enzimática
PCR: cinética
Taq polimerasa
nº ciclos
PROCEDIMIENTO…..
PCR:
PRINCIPIOS
La Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)

PCR es una técnica la cual es usada para
amplificar un numero de copias de una región
específica del ADN hasta producir una cantidad
de ADN que sea adecuadamente testeada.

El propósito de la PCR es hacer un alto número
de copias de un gen. Como resultado es posible
y caracterizar fragmentos de ADN hallados en una
gota de sangre, en una escena de crimen o de un
dinosaurio extinguido.
Definición



PCR es un sistema no celular de clonado
del ADN
Es un método de amplificación selectiva de
secuencia específicas. A partir de una
población heterogénea de moléculas, como
puede ser ADN genómico o cDNA.
PCR es un proceso de replicación in vitro.
Ventajas y Desventajas
VENTAJAS:
Rapidez
Sensibilidad
Fortaleza
 DESVENTAJA DE PCR COMO
METODO DE CLONADO:
Se debe conocer la secuencia
Producto generalmente pequeño
Infidelidad de la replicación del ADN

CONCEPTOS BASICOS:

EFICIENCIA: MAXIMA PRODUCCION DE AMPLIFICACION
EN FUNCION DEL NUMERO DE CICLOS

ESPECIFICIDAD: GENERACION DE UN UNICO PRODUCTO
DE AMPLIFICACION

FIDELIDAD: NUMERO DE ERRORES QUE COMETE LA DNA
POLIMERASA DURANTE LA COPIA

SENSIBILIDAD: MINIMA CANTIDAD DE DNA QUE SE
NECESITA PARA OBTENER UNA GRAN CANTIDAD DE
COPIAS
Eficiencia de una PCR
Especificidad
Rendimiento
Fidelidad
Fidelidad vs Eficiencia
Infidelidad:

Errores cometidos por la enzima:
Eficiencia:

Taq pol 1 error / 2x104 pb incorporadas
88 %

Tli pol (Thermococcus litoralis) 1 error/ 4x105 pb incorporadas
70%

Pfu pol (Pyrococcus furiosus): 1error/ 7x107 pb incorporadas
60%

In vivo ADN polimerasa: 1 error/ 3x109 pb incorporadas
fidelidad eficiencia
Procesividad
Tiempo de extensión:
Taq polimerasa: 2 Kb/min
Tli polimerasa: 1 Kb/min
Pfu polimerasa: 0.5 Kb/ min
PCR
En un tubo de PCR con
una mezcla de DNA
genómico, DNA
polimerasa, buffer,
nucleósido trifosfatos y
primers
Termociclador
Nomenclatura Hebras de ADN !
Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+)
Secuencia publicada en Gene Bank!
5’
3’
3’
5’
Cadena Molde, no-codificante, no-informativa,
antisentido (anti sens) o cadena (-)
Paso 1: Desnaturalización
del DNA
Esto ocurre a 92-95 ºC
Paso 2: Annealing o Unión de
Primers
Reverse Primer
Forward Primer
Los cebadores se unen a la secuencia
complementaria sobre DNA target.
Paso 3: Extensión o “Primer
Extension”
5’
3’
extension
extension
3’
5’
DNA polimerasa cataliza la extensión
de la hebra en sentido 5’3

El nuevo ciclo se inicia por
desnaturalización de las nuevas
hebras formados en el ciclo
previo.
El tamaño del fragmento producido
en PCR depende de los primers
Reverse primer
Forward primer
Tamaño de los fragmentos que son amplificados
Elementos de una PCR
especifica
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
Calidad
Templado
Concentración
Enzima
Secuencia
Iniciadores Concentración, pureza y estabilidad
Temperatura de anneling
Concentración de Magnesio
Concentración de Nucleótidos
Condiciones del medio: Buffer, pH, etc.
Aditivos: Formamida, DMSO, glicerol, etc.
1)Templado ADN genómico


CALIDAD:
CONCENTRACION: 10pg-1μg
Templados: Sangre, sangre seca,
exudado vaginal, cabellos, frotis
nasofaríngeo, etc.
2) Enzima
DNA Polimerase de Taq
(Thermus aquaticus )
 Esta
enzima tolerante al calor y
sobrevive a los distintos ciclos
de desnaturalización
Acción DNA polimerasa I
DNA polimerasas termoestables:
características

Procesividad: Actividad de polimerasa 5’3’
actividad de síntesis

Fidelidad: Actividad 3’5’ exonucleasa (correctora)

Actividad de Transferasa Terminal: Agrega un
nucleótido de adenina (A) en extremo 3’.

(-) actividad transferasa teminal: extremos romos (blunt)
5’
3’ A
A 3’
5’



La actividad 3'5’
exonucleasa remueve en
posición 3’ todo
nucleótido mal apareado
(Realiza una función de
lectura de prueba)
(proofreading)
La actividad 5'3’
exonucleasa
desplaza nucleótidos
por delante de la
adición por la
actividad polimerasa
La función 3’5’ exonucleasa
La función 3’5’ exonucleasa de la
DNA polimerasa I. Esta actividad
enzimática escinde los nucleótidos
mal apareados desde el extremo 3’
de la hebra azul que esta creciendo
La función 5’3’ exonucleasa
función de DNA polimerasa I
La Pol I 5 '→ 3' exonucleasa se une en nicks (mellas) de
la mono hebra. Escinde la cadena de ADN mellado en
una región de bases apareadas más allá de la mella
para escindir el ADN, ya sea como mononucleótidos u
oligonucleótidos de hasta 10 residuos

La actividad 3'5’
exonucleasa
(proofreading)
In vivo 1 base en 3x109nt es copiado incorrectamente
Diferencias entre 2
polimerasas

Velocidad
de síntesis



Termoestabilidad

Taq
Mas rápida
(2000nt/min)

Menos de 1h a
95ºC



Pfu
Más lenta
(500nt/min)
Vida media 18-25h
a 95ºC
98ºCGC
3) Elección de los
Primers o Iniciadores I
1. Tamaño: generalmente cerca de 20 nt. Si
son muy largos problemas annealing y
inespecificos.
2. Tº de anneling semejante
3. Tm= 4(G+C) + 2 (A+T) ºC
4. Evitar repeticiones, buscar regiones con
una distribución homogeneas de bases
5. Contenido de GC (40-60%)
6. Elección de primers para cDNA
3) Elección de los
Primers o Iniciadores II
7.
Elegir iniciadores con residuos G o C en 3’ o en
la zona central
8. Evitar secuencias complementarias en el
extremo 3’
9. Evitar secuencias que formen estructuras
secundarias.
10. CONCENTRACION : 20-50 pM/ul
11. Proporción molecular: Iniciadores/ADN molde =
108:1
12. Si es  disminuye la eficiencia
13.Si es  disminuye el rendimiento
Se debe evitar:
Secuencias
complementarias
dentro del mismo
primer
Secuencias
complementarias
entre primers
3) Primers o Iniciadores:
Resumen
1. Específicos de la secuencia de interés
2. Longitud 18-30 nucleótido
3. Tº Annealing 50oC-70oC
Idealmente 58oC-63oC
4. GC contenido 40-60%
5. Extremo 3’ critico
G o C en extremo 3’ terminal aumenta la
eficiencia de la reacción.
4. Secuencia Complementarias entre si mismas
y con otros
Hairpins <5, dimers <9
4) Temperatura de
anneling



Temperatura de Annealing:
Tmprimer = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] –273.15°C + 16.6 log 10 [K+]
H:entalpia, S entropia para la formación helix; R constante
molar y c es la concentración primer
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC

Para 18–24 bases
~ 5oC menos que la Tm de los primers
 en la tº anneling resulta en una union noespecífica.
en la tº annealing resulta en reducción en el
rendimiento
G:·3 ;
A: 11
C:5
T: 7
;
TOTAL= 26 nt
Tm= 4.8+2.18=32+36=68ºC
Efecto de la temperatura de anneling
vs rendimiento y especificidad


Los pares de primer o cebadores 1 y 2 generan
altos niveles del producto de PCR correcto a 55ºC.
Sin embargo el par 3 de cebadores funciona mejor a
50ºC.
RESUMEN:










LONGITUD DE 18 a 24 nucleótidos
ESPECIFICOS
Tm = 55 a 75 C, CON Tm SIMILARES ENTRE SI
DISEÑAR PRIMERS CON CANTIDAD APROXIMADAMENTE 50% DE
GC Y DISTRIBUCION AL AZAR
EVITAR PRIMERS CON SECUENCIAS DE POLIPURINAS Y/O
POLIPIRIMIDINAS (Poly GC: DISMINUYE ESPECIFICIDAD Poly AT: DISMINUYE EFICIENCIA)
EVITAR SECUENCIAS QUE FORMEN ESTRUCTURAS SECUNDARIAS
CONTROLAR QUE LOS PRIMERS NO HIBRIDICEN ENTRE SI
EVITAR MAS DE 3 CG SEGUIDAD EN EL EXTREMO 3´
COMENZAR Y TERMINAR CON PURINAS
EXISTEN PROGRAMAS PARA DISEÑO DE PRIMERS
Rol de los iones metálicos
Mg+2, se une en el sitio activo
de la ADN polimerasa.
Los iones de metal A activa
grupo 3-OH grupo del primers
para el ataque nucleofílico
(flecha) en el grupo -fosfato
del nucleótido entrante (en
este caso, ddCTP).
El ión metálico orienta y
estabiliza electrostáticamente
el grupo trifosfato cargado
negativamente de DNTPs.
Los átomos están coloreados de acuerdo al tipo (C: gris, N: azul, O:rojo y P:
amarillo), y la coordinación de iones metálicos se representa por líneas de puntos
verdes.
5) Concentración de
Mg2+
1. Importante para la actividad
de la enzima.
2. Debe hacerse una curva de
titulación 1-3 mM con
incrementos de 0,5mM.
3. MgCl2: se requiere para la
unión del primer
5) Concentración de Mg2+ - II
 MgCl2 afecta la union de los cebadores, Tm del
templado del ADN, actividad de la enzima y fidelidad
 Los
dNTPs,
cebadores
y
el
templado
quelan
y
secuestran ion Mg  su concentración debe ser mayor
que los dNTPs
 Exceso de Mg2+ aumenta la inespecificidad
 Pequeñas cantidades de Mg2+ reduce el rendimiento
6) Concentración de
dNTPS
1. Debe variar según el tamaño de la
secuencia target a amplificar.
2. Por ejemplo: para un rendimiento de 1012
moléculas de 100pb, se necesitan 1014
moléculas.
3. Generalmente la mix que se prepara son
de 2-2,5 mM
7) Mezcla de reacción
1. El buffer, pH y concentración de Mg2+
óptimos de acuerdo a la secuencia y al
par de iniciadores elegidos
2. Uso de estabilizantes de la enzima:
gelatina, Tritón X-100, Tween 20, BSA
3. Elementos que facilitan la
desnaturalización del ADN molde:
glicerol, dimetilsulfóxido y formamida
7) Mezcla de reacción II
La mayoría de los buffers tienen KCl (50mM)
y Tris (10mM):
1. Estas concentraciones pueden ser alteradas,
KCl facilita la unión de los cebadores pero a
concentraciones 50mM inhiben la Taq
2. Los buffer pueden tener: DMSO, BSA,
gelatina, glicerol, Tween-20, Nonidet P-40,
Triton X-100, DTT.  la especificidad de
la reacción pero tambien pueden ser
inhibitorios.
Coadyuvantes:
BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra
inhibidores no especifícos
 Formamida: Baja la temperatura de
desnaturalización (templado ricos en GC)
 DMSO: Ayuda la elongación en templados
ricos en GC
Mezcla de polimerasas
Hot start



8) Típica reacción de
PCR:
1. El
Optimización: número de
ciclos
 25-40
ciclos
 El tiempo de vida media de Taq
es de 30 minutes a 95oC
 Si se usa mas de 30 ciclos con
un tiempo de desnaturalización
de 1 minuto, la eficiencia de la
Taq será menor.
 No caer en la fase de Plateau
Rendimiento Teórico = 2n
Por ej.. ciclo 1 = 2, ciclo 2 = 4, ciclo 3 = 8, etc
Ej. Si Ud. inicia la PCR con 100 copias después de 30 ciclos
obtendrá 1.073.741.800 copias
Amplificación Exponencial
Ciclos
Copias
1
2
2
4
4
16
10
1.024
15
32.768
20
1.048.576
25
33.554.432
30
1.073.741.824
Fases en una reacción de PCR



El producto de PCR se acumula
en función del número de
ciclos. Se distinguen las
siguientes fases:
La fase exponencial hasta
cerca del ciclo 30 esta bajo las
condiciones estándar de
reacción.
La fase plateau resulta de
cantidades limitantes de
enzima y/o reducción actividad
enzimática.
Causas de Efecto Plateau
Agotamiento de los sustratos (dNTPs o
primers).
 Estabilidad de los reactivos (dNTPs o
enzima) particularmente a la tº de
desnaturalización.
 Inhibición por los productos finales
generados (pirofosfato, duplex de DNA).
 Competición de los reactivos por
productos no específicos o dímeros de
cebadores.
 Incompleta desnaturalización / separación de hebras a altas concentraciones
del producto.

CONDICIONES PARA MEJORAR
LA ESPECIFICIDAD
DISMINUIR:
 Mg++
 [d NTP]
 LARGO DE LOS CICLOS
 NUMERO DE CICLOS
 CONCENTRACION DE PRIMER
AUMENTAR:
 Tº DE ANNEALING
RESUMEN:

MENOR TIEMPO Y MAYOR Tº DE ANNEALING:
MAYOR ESPECIFICIDAD
CICLOS EXTRAS: MENOR ESPECIFICIDAD
PARA OBTENER MAS MASA DE AMPLIFICACION SE
REALIZA REAMPLIFICACION

CONTROL NEGATIVO:



SIN ADN
MUESTRA CON ADN QUE NO CONTIENE
SECUENCIA TARGET
SOLUCION DE EXTRACCION DE ADN
VARIANTES DE PCR PARA
MEJORAR ESPECIFICIDAD

HOT START PCR: EVITA PRODUCTOS
INESPECIFICOS GENERADOS INICIALMENTE
CUANDO AUMENTA LA Tº