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BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Dra Daniela Centrón Depto de Microbiología, Parasitología e Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires CONICET Que es la biología molecular? • Estudio de la biología a nivel molecular Se superpone con áreas de la biología y la química, en particular genética y bioquímica • Estudio de los procesos celulares De la genética clásica a la biología molecular al diagnóstico especializado…… CONTENIDOS I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS A. Biosíntesis de ácidos nucleicos: replicación, transcripción. B. Biosíntesis de proteínas: traducción. C. Marcos de lectura abiertos. Operones y regulones. II. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE A. Enzimas utilizadas en biología molecular. B. Vectores de clonado y de expresión. C. Construcción de bibliotecas genómicas. III. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA A. Mutaciones y mutantes. B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos. C. Adquisición de material genético exógeno. IV. METODOLOGIAS BASADAS EN LA IDENTIFICACION DE SECUENCIAS DE A. NUCLEICOS A. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). B. Hibridización de ácidos nucleicos. C. Epidemiología molecular bacteriana. D. ADN ramificado (branched DNA). E. Secuenciación de ácidos nucleicos. V. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE AGENTES ETIOLOGICOS MICROBIANOS A. Bacterias B. Virus C. Hongos D. Mecanismos de resistencia a antibióticos VI. SEMINARIOS DE INTEGRACION CRONOLOGÍA Genética AM y DM Mendel 1866 GENÉTICA AM Las partículas de la herencia se mezclaban Un parental aporta más que el otro Herencia de caracteres adquiridos MENDEL Y LOS “FACTORES” DE LA HERENCIA GENÉTICA DM LA GENÉTICA Y LOS GENES...... ADN o PROTEÍNAS? ….en busca del material hereditario…. Que características debería presentar el material hereditario? Perpetuarse (replicarse) Manifestarse (expresarse) Cambiar (mutar) Combinarse (recombinarse) 1902-Theodore Boveri- William Sutton 1865 Establecen la hipótesis según la cual los cromosomas, segregados de modo mendeliano, son unidades hereditarias. 1865 1915 - T.H. Morgan Los genes se disponían linealmente en el cromosoma Se comienza a hablar de genética..... 1865 1928 - Frederick Griffith Colonias “Rugosas” Colonias “Lisas” Transformación de Streptococcus pneumoniae Células L vivas Bacteria Inyección Resultados Células L Células R muertas por vivas calor cápsula Células L muertas por calor junto a celular R vivas “factor de transformación” 1865 1944 - Avery, MacLeod & McCarty El ADN purificado es “el factor de transformación” El ADN de las células lisas transformaba a las rugosas Oswald Avery Colin MacLeod Maclyn McCarty Su teoría fue rechazada por dos razones: De ser así cada especie debería tener un tipo diferente de ADN La composición química del ADN era demasiado simple para contener toda la información para la vida 1865 1952 - Hershey & Chase El ADN viral (no las proteínas) programa las células Martha Chase & Alfred Hershey Bacteriófagos … “los genes se componen de ADN, base química de la herencia”… LA ESTRUCTURA DEL ADN... 1947 - Erwin Chargoff 1865 Las bases de ADN siguen ciertas reglas La composición es especie específica A = T, C = G en todas las especies AT GC 1865 1953 - Franklin & Wilkins La naturaleza helicoidal del ADN Rosalind Franklin Film fotográfico Fuente de rayos X DNA cristalizado Maurice Wilkins 1865 1953 - Watson & Crick Descripción de la estructura tridimensional del ADN Francis Crick & James Watson 1865 1953 - Watson & Crick Que dedujeron de: Datos de R. Franklin • hélice doble • ancho uniforme de 2 nm • bases separadas por 0.34 nm Chargoff • la adenina se aparea con la timina • la citocina se aparea con la guanina 1865 1953 - Watson & Crick Que dedujeron ellos mismos? • Las bases están hacia adentro, y los fosfatos y las azúcares hacia afuera • Enlaces de hidrógeno • Hebras antiparalelas • Sugirieron un modo semiconservativo de replicación ESTRUCTURA DEL ADN ... 2 de abril de 1953, Molecular Structure of Nucleic Acids. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 171: 737. No más de 900 palabras….. J. D. WATSON and F. H. C. CRICK QUE ES EL ADN??? POLÍMERO LARGO, NO RAMIFICADO, COMPUESTO POR CUATRO TIPOS DE SUBUNIDADES Bases nitrogenadas Se combinan con azúcares y fosfatos DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS Nucleótido=base+azúcar+fosfato Nucleósido=base+azúcar MONÓMERO Del nucleótido al ADN 5´ ENLACE FOSFODIESTER ENTRE EL CARBONO 5´ DE UNA DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO FOSFATO DEL SIGUIENTE NUCLEÓTIDO FORMANDO UN NUCLEÓTIDO MONOFOSFATO. EL POLÍMERO SE FORMA AL ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3´ DEL OTRO NUCLEÓTIDO DIRECCIÓN (5´a 3´) 5´ Estructura estabilizada por puentes hidrógeno •Doble hebra 5´ •Antiparalela 3´ 5´ 3´ ESTRUCTURA PRIMARIA Apareamiento: A-T G-C Polímero uniforme 10 bases por vuelta Surco menor Surco mayor ESTRUCTURA SECUNDARIA REGION REGULATORIA Codón de iniciación Codón de terminación 1865 ADN en Procariotas ESTRUCTURA TERCIARIA Cromosoma bacteriano ADN doble cadena (1mm long) circular cerrado Condensado y ordenado (“supercoiled” o superenrollado) 1865 • • • • • Plásmidos en Procariotas Tamaño de 1 a 400Kb Cantidad variable de copias en una célula Origen de replicación propio Pueden movilizarse a otros genomas Puede integrarse al cromosoma bacteriano 1865 ADN en Eucariotas •1 o más cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos) •Localizado en núcleo •Empaquetado por histonas y otras proteínas cromatina Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos 1865 Replicación del ADN Semiconservativa: dos hebras generan una copia cada una 1865 Iniciación comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos conocida como origen de replicación, en el que hay un gran contenido de adenina y timina. Iniciación 1865 iniciador Síntesis de primers de ARN Iniciación de la replicación Unión de iniciador Horquillas se mueven en dirección opuesta Formación de dos hebras de replicación ADN circulares (Procariotas) Origen de replicación (oriC) ADN lineales (Eucariotas) Varios replicones Elongación 1865 ADN primasa ARN primer ADN polimerasa III ADN ligasa Hebra retrasada Frag. de Okazaki Hebra líder Topoisomerasa ADN polimerasa III Helicasa Proteínas de unión al ADNss La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada una de las cadenas primitivas, en sentido 5´ → 3´ partiendo de un ARN corto específico llamado ARN cebador –molécula formada por nucleótidos de ARN catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. “Proof-reading” DNA polimerasa comete un error cada 108 – 1010 bases Incorporación de G X A Pol III escinde G con actividad exonucleasa 3´ a 5´ Incorporación de A 1865 Terminación Fragmentos de Okazaki Ligasa Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa, conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado, catalizando las reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y azúcar de los nucleótidos contiguos y así, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki se completa la doble hélice de ADN. 1865 1957 - Francis Crick Propuso el dogma central ADN ARN PROTEINAS Transferencia de información biológica 1865 El ADN y el ARN •Ácidos nucleicos •Macromoléculas •Polímeros (monómero de nucleótidos) •Uniones fosfodiéster •Moléculas más grandes que se conocen. Diferencias entre la química del ADN y el ARN 1865 El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa en lugar de la desoxirribosa. El ARN tiene como base el uracilo en lugar de la timina. Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN. El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus. 1865 Estructura del ARN 1865 Tipos de ARN según sus funciones Componente principal del ribosoma •Decodifica el ARNm para sintetizar las proteínas •Interacciona con ARNt durante la traducción •En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S •En Eucariotas, 40S y 60 ARNr (ribosomal) 1865 Tipos de ARN según sus funciones ARNt (de transferencia) aa •Encargados de transportar los aminoácidos a los ribosomas para incorporarlos a las proteínas, durante el proceso de síntesis proteica. •Decodificación mediante apareamiento con el codón del ARNm anticodón 1865 Tipos de ARN según sus funciones ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para síntesis proteica (ARNr y ARNt) ARN corto de interferencia (siARN: del inglés: small interfering RNA ): son componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN involucrados en la regulación. Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actúan como llaves "encendidoapagado" de gran precisión. ARN catalíticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la molécula propiedades catalíticas como corte de ARN o ADN y ligación. El ARN posiblemente fue el primer biopolímero que apareció en la corteza terrestre durante el transcurso de la evolución. Como se leen los ARNm?? 1961- Nirenberg y Ochoa 1865 Sistema libre de células UUUUUUUU AAAAAAAA CCCCCCCC GGGGGGG fenilalanina lisina prolina glicina El código genético 43=64 ARNm Demostraron que hay 61 tripletes -o codonesque codifican aminoácidos, muchos de los cuales son codificados por más de un codón, por lo que se dice que el código está degenerado. y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados como señales de terminación. 1865 TRANSCRIPCIÓN ADN ARN PROTEINAS Requerimientos: Cadena de ADN como matriz ARN polimerasa Ribonucleósidos trifosfatos Región promotora TRANSCRIPCION ARN polimerasa Principio de un gen ADN Iniciación La ARN polimerasa junto a factores de transcripción se une a sitio donde va a iniciar la transcripción Promotor En bacterias •Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son reconocidas por factor sigma. •ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5´ a 3´ •Un promotor expresa varios genes (OPERÓN) Promotor en Eucariotas •Región promotora •Involucra varios factores de transcripción (proteínas) •Cada gen tiene su promotor TRANSCRIPCION Hebra antisentido Dirección de la transcripción 3´del gen 5´del gen 5´del ARNm 3´ del ARNm Hebra sentido: contiene la información genética Hebra antisentido: provee el molde para la síntesis del ARNm ARNm Elongación Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodiéster. TRANSCRIPCIÓN La ARN polimerasa deja el ADN ARN mensajero liberado El ADN se aparea nuevamente Terminación Desestabilización del complejo ARN-ADN •Rho-independiente (Secuencias palindrómicas del ADN que en estadio de ARN adopta una estructura en horquilla) •Rho-dependiente (mediada por la proteína) 1865 TRANSDUCCIÓN ADN El nombre proteína proviene de la palabra griega proteios, que significa lo primero. ARN PROTEÍNAS Las proteínas son macromoléculas formadas por aminoácidos TRADUCCION ARNt Sitio de unión al aminoácido Uniones hidrógeno entre pares de bases Iniciación La iniciación procariótica es el resultado de la asociación de las subunidades pequeña y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt) con el codón de iniciación mediante el emparejamiento de bases anticodón-codón. TRADUCCION Elongación La elongación de la cadena polipeptídica consiste en la adición de aminoácidos al extremo carboxilo de la cadena. TRADUCCION Continua la elongación Polipéptido Creciente Este proceso continua hasta que llega a un codón stop TRADUCCION Nueva proteína sintetizada Carboxilo terminal Amino terminal Terminación La terminación ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminación del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt. QUÉ ES UN GEN ? Un segmento de ADN que contribuye a un fenotipo/función. En ausencia de una función demostrable, un gen puede ser caracterizado por secuencia, transcripción u homología. Human Gene Nomenclature Committee En Procariotas..... Operón Transcripción policistrónica (ARNm de varios genes) En Eucariontes... REGION REGULATORIA +1 EXONES FIN TRANSCRIPCION INTRONES Un promotor para cada gen LA DECADA DE LOS 70 1865 1970 - Smith & Nathans Descubrimiento de las enzimas de restricción Hamilton Smith • Descubrió HindII en Haemophilus influenzae Daniel Nathans • Utilizó HindII para hacer el primer mapa de restricción del SV40 1972 - Paul Berg 1865 El primer ADN recombinante utilizando EcoRI Sitios de reconocimientoEcoRI DNA plasmidico EcoRI corta el DNA en fragmentos Extremos pegajosos DNA recombinante SV40 DNA DNA ligasa 1865 1973 - Boyer, Cohen & Chang Transformación de E. coli con plásmidos Gen resistente a la canamicina recombinantes Plasmid pSC101 Gen resistente a la tetraciclina Stanley Cohen & Annie Chan Medio con canamicina y tetraciclina E. coli transformada con plásmidos recombinantes Sólo crecen colonias recombiantes Herbert Boyer 1865 1977 - Genentech, Inc. La primera proteína humana producida por una bacteria transgénica (somatostatina) • Compañía fundada por Herbert Boyer y Robert Swanson en 1976 • Considerada el advenimiento de la edad de la biotecnología LA DECADA DE LOS 80 1865 1980 • La suprema corte de U.S. permite patentar formas de vida 1985 • Se prueban plantas modificadas genéticamente En 1988 el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y el GenBank Margaret Dayhoff LA DECADA DE LOS 90 1865 LOS 90: GENOMAS Y CLONES 1995 • primer genoma: Haemophilus influenzae. 1996 • Genoma de Saccharomyces cerevisiae •1997 • Se clona Dolly 1998 • Genoma de C. elegans COMO FUNCIONA UN GENOMA? GENÓMICA Y PROTEÓMICA 26 de junio del 2000: se concluyó el proyecto del GENOMA HUMANO, en el cual se invirtió más de 3.000 millones de dólares….. EL FUTURO...... Genómica y sociedad Genómica y salud Genómica biológica MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!! [email protected]
