Download Sin título de diapositiva

Tema 16
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA II
1. Inhibición pseudoirreversibles
2. Inhibición irreversible
2.1 Inhibidores irreversibles o venenos catalíticos
2.2 Análisis de la velocidad de inactivación
enzimática
2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible
1.-Inhibición irreversible simple.
2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente
4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.
1. Inhibición Pseudoirreversible
Inhibidores
[I] no es >>> [E]
Inhiben a concentraciones parecidas a la enzima
Ki <<<<< Ki de Inhibidores reversibles
Orden 10-12 a 10-14 Unión fuerte a los enzimas
Pseudoirreversible el equilibrio está completamente desplazado
hacia la formación del complejo [EI]
[EI] no es despreciable
E +I
EI
a razón de velocidades máximas en
Io= I + EI
Eo=E + EI
presencia y ausencia de inhibidor
vi kcatE
E
a


vo kcatE0 E 0
E  aE0
EI = Eo – E
E  aE0
EI = Eo – aEo
Io= I + EI
EI = Eo (1-a)
Eo=E + EI
EI
I  Ki
E
Eo(1  a)
(1  a)
Io  Ki
 Eo(1  a )  Ki
 Eo(1  a)
aEo
a
Dividiendo los dos miembros por (1-a)
Io
1
 Ki  Eo
(1  a) a
Io
(1  a )
m=Ki
Eo  Ki  Io  ( Ki  Io  Eo) 2  4 E 0 Ki
a
2 Eo
Eo
a valores experimentales
1/a
Representación de Willian y Morrison: Inhibición pseudoirreversible
Io=0
vo
Io=1,5nM
Io=3,0 nM
Io=4,5nM
1,5
3,0
4,5
Eo nM
Inhibidor titula a la enzima
2. Inhibidores irreversibles
2.1 Venenos Catalíticos
Inhibidor irreversible une a la enzima por un proceso irreversible*
(constante de disociación 10-9 mol l-1)
Inhibidores se unen por enlaces covalentes a centro activo de la enzima
Inhibición suele ser progresiva. Depende del tiempo
* Los inhibidores irreversibles o venenos catalíticos son sustancias que se
unen a la enzima de manera tal que reducen su actividad prácticamente a cero.
- Esto es de particular importancia en los procesos de purificación de enzimas:
* Muchas enzimas son “envenenadas” por trazas de metales pesados, y por
esta razón, es una práctica común utilizar sustancias complejantes, p. ej.,
EDTA, en los tampones de ensayo, para secuestrar estos metales pesados.
-La aspirina inhibe la formación de Protaglandina-G2,
gracias a la metilación de la subunidad o dominio
responsable de la actividad ciclooxigenasa, de la
Prostaglandina-H-sintetasa.
Penicilina
La enzima modificada por la penicilina no puede unir el
puente de poli-Gly
2.2. Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible
E +I
EI* Se forma este complejo que es inactivo
Cinética
[I]>>>[E]
El I esta en exceso no cambia durante la inhibición
[I] =[Io]
La cinética de la inhibición irreversible puede ser modelada
usando un modelo de primer orden de la forma
[EI]* mM
[EI]*=[ET] (1-exp-k`T)
K`(s-1) tendrá un significado diferente dependiendo del
mecanismo exacto de inhibición
Tiempo (s)
2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible
1.-Inhibición irreversible simple.
E+I
EI*
2.-Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
E+I
EI*
E+S
ES
3.- IInhibición irreversible simple tiempo dependiente
E+I
EI
EI*
4.- Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de
Sustrato.
E+I
EI
E+S
ES
EI*
1.-Inhibición irreversible simple.
ki
E+I
EI*
Reacción de segundo orden
ki constante de inhibición de segundo orden (M-1 s-1)
Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI
d EI *
 kiI E 
dt
ET   E   EI *
I =Io
Ecuación diferencial de primer orden describe el cambio en la
concentración de [EI] en el tiempo
d EI *
 kiIo ET  EI *  k `ET  EI *
dt
k`=ki [Io]
Integración de la ecuación

EI *
o
t
d EI *
 k´ dt
ET  EI * 0
EI *  ET (1  exp
 k `t
)
[EI]* mM
k`=ki [Io]
Calcula k`
k`
ki 
Io
Se obtiene una constante de
inhibición de segundo orden
Tiempo (s)
2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
E+I
E+S
ki
Ks
EI*
ES
Substrato puede proteger a la enzima de
la inhibición irreversible
Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*
d EI *
 kiI E 
dt

E S 
Km 
ES 
ET   E   EI *  ES 

d EI *
Et  EI *Km
 kiIo 
dt
Ks  S
d EI *
 k´ET  EI *
dt
I = Io

Et  EI *Km
E  
Km  S
Sustituyendo y despejando
kiKm
k ` 
Io
Km  S
Integración de la ecuación

EI *
o
t
d EI *
 k´ dt
ET  EI * 0
[EI]* mM
Calcula k`
Tiempo (s)
EI *  ET (1  exp k `t )
kiKs
k ` 
Io 
Ks  S
k`(s-1)
Graficando k` frente a diferentes
concentraciones de Inhibidor
ki
S y Ks constantes se
pueden calcular
idenpendientemente
kiKs
m
Ks  S
Io mM
3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente
E+I
Ki
EI
ki
EI*
Rápido equilibrio reversible entre E y el I seguida de una reacción lenta e
irreversible de inactivación
[EI]*
Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*
d EI *
 kiEI 
dt

E I 
Ki 
EI 
ET   E   EI *  EI 

d EI *
Et  EI *
 ki
dt
1  ki /Io 
d EI *
 k `ET  EI *
dt

Et  EI *
EI  
1  ki /Io 
ki
k´

1  ki /Io 
kiIo 
k `
Io  Ki
Integración de la ecuación

EI *
o
t
d EI *
 k´ dt
ET  EI * 0
EI *  ET (1  exp k `t )
Graficando k` frente a diferentes
concentraciones de Inhibidor
[EI]* mM
Calcula k`
kiIo 
k `
Io  Ki
k`(s-1)
Hipérbola rectangular
Ki y ki Procedimientos de
regresión no linear
Io mM
4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en
presencia de Sustrato.
Ki
ki
E+I
d EI *
E+S
 kiEI 
dt

E I 
Ki 
EI 

E S 
Ks 
ES 
ET   E   EI *  EI   ES 
d EI *

dt
Et  EI *
Ki  S  
1
1 

Io   Ks 
d EI *
 k `ET  EI *
dt
EI
Ks
EI*
ES

Et  EI *
EI  
Ki  S  
1
1 

Io   Ks 
Sustituyendo y despejando
ki
k´
Ki  S  
1
1 

Io   Ks 
Integración de la ecuación

EI *
o
t
d EI *
 k´ dt
ET  EI * 0
EI *  ET (1  exp k `t )
Graficando k` frente a diferentes
concentraciones de Inhibidor
[EI]* mM
Calcula k`
ki
k´
Ki  S  
1
1 

Io   Ks 
k`(s-1)
Hipérbola rectangular
Ki y ki Procedimientos de
regresión no linear
Io mM
Como distinguirías entre una Inhibición
irreversible tiempo dependiente y otra Inhibición
irreversible tiempo independiente
k`(s-1)
Io mM
k`(s-1)
Io mM
RESUMEN
● Existen unos inhibidores denominados pseudoirreversibles que no cumplen todas las
condiciones de Michaelis, puesto que la concentración inicial de inhibidor [Io] es efectiva
al mismo orden de magnitud que la concentración inicial de enzima.
En este tipo de inhibición la Ki presenta valores que van desde 10-8 -10-12.
Se comportan como inhibidores pseudoirreversibles la gran mayoria de inhidores de
naturaleza proteica, así como los anticuerpos obtenidos frente a las proteínas enzimáticas.
El comportamiento cinético es diferente de los inhibidores reversibles.
● Los inhibidores suicidas son compuestos que son inactivos como inhibidores en
ausencia de enzimas, se activan específicamente por la enzima a la que van a inhibir ,
uniéndose covalentemente a la proteína enzimática.
● Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible. Muestra un comportamiento
dependiente de la presencia de substrato y de la posibilidad que el parámetro tiempo
influya en el proceso de unión covalente. Así se distinguen desde el punto de vista
cinético:
Inhibición irreversible simple
Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
Inhibición irreversible simple tiempo dependiente
Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato