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• CINETICA ENZIMATICA
Dra EMMA GUERRERO HURTADO
CINETICA QUIMICA
Cinética Química es aquella parte de la Química que
se encarga de estudiar la velocidad de una Reacción
Química y los factores que permiten su control.
Se limita a :
a) Reacciones Reversibles
CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICAS
• Según el número de moléculas:
A
P
A+B
A+B+C
p
P
SEGÚN EL NÚMERO DE REACCIÓN
R. Primer Orden: A
P
V= -d A= K (A)
dT
R. Segundo Orden: A+ B
V= -dA = -dB ó + dP
dT
dT
dT
V= K (A) (B)
P
CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN
En 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una
teória para explicar la velocidad inicial de una reacción
catalizada por una enzima, en función a la concentración
del sustrato.
La concentración de sustrato que produce la mitad de la
velocidad máxima, llamada valor Km o Constante de
Michaelis, se puede determinar experimentalmente
graficando v1(velocidad inicial) como función de [S].
La expresión de Michaelis-Menten
Vo = Vmax [S]
Km + [S]
M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema :
Sacarosa
invertasa
Glucosa + Fructosa
agua
Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones
experimentales
a)(E) variable y (S) constante
b)(E) constante y (S) variable
A) Efecto de la (E) sobre la velocidad Enzimática
Vo
(E)
B) Efecto de la concentración del sustrato
sobre la velocidad de una reacción
-------------------------------------------------------
Vo
1/2 Vmax
KM
Sustrato (S)
Se supone:
E+ S
ES
KM
ES
E+P
= Constante de Michaelis -Menten
Constante global que sustituye o engloba las constantes de
velocidad de la reacción de interacción entre el enzima y
el sustrato
Vo = Velocidad inicial de reacción
Vmax = Cuando el enzima se halla saturado
Como se relacionan Vmax, Km y Vo?
• Observemos : *
•
K1
• E+S
•
K3
ES
K2
E+P
K4
• Que hay un solo sustrato
• Que la velocidad K4 se desprecia
• * Que la concentración del E es muy pequeña
• * Que la E puede estar como: E libre y ES
• * Que el equilibrio alcanzado por K1 es más rápido que
K3, por lo que éste es limitante determina, o limita, la
cantidad de producto formado
POR LO QUE...
• LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA:
• VO = K 3(ES)
• LA ECUACION RESULTANTE SERA:
•
•
VO =Vmax.(S)
(S) + Km
Ecuac. Michaelis
Menten
La dependencia de la velocidad inicial de una reacción
catalizada por enzima en [S] y en Km puede aclararse
valorando la ecuación de Michaelis-Menten como sigue:
.-1)
Cuando [S] es igual que Km:
vo= Vmax*[S]
Km + [S]
2)
vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = Vmax
[S]+ [S]
2[S]
2
Km= K2 + K3/
K1
Si K2>> K3
K m= (E) (S)
(ES)
Km =K2/K1
K = (E) (S)
ES)
SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA
• Vmax= K3 (ET)
•
# de recambio
• K3= número de moléculas de Sustrato convertidas
en producto por unidad de tiempo, cuando la
enzima esta saturada
NÚMERO DE RECAMBIO
Carboxipeptidasa
102
Tripsina
102 a 103
Cinasas
103
Deshidrogenasas
Transaminasas
Anhidrasa carbonica
Superoxido dismutasa
103
103
106
106
catalasa
107
DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA
ECUACION LINEAL
Se tiene:
vo= Vmax*[S]
Km + [S]
Se factoriza 1 =
vo
se invierte 1 = Km + [S]
vo Vmax*[S]
Km
* 1 +
[S]
Vmax
[S]
Vmax[S]
Se simplifica:
1=
vo
Km * 1 +
1
Vmax [S]
Vmax
La ecuación de la recta es:
y=a*x+b
La ecuación de la recta es:
y=a*x+b
donde:
y = 1
Vo
y
x =
1
[S]
El valor de Km puede ser hallado a partir de la
gráfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco
usando la pendiente y la intersección negativa de x.
Representación recíproca doble
(Lineweaver - Burk)
y=a*x+b
0.04
1/v
0.03
1/Vmax
0.02
-1/Km
1 Km 1 1

 
v Vmx s Vmx
0.01
0.00
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
1/s
INHIBICION ENZIMATICA
• ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS
SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA
• APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN LA
IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.
INHIIBIDORES
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima
libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E+I
EI
ES + I
ESI
2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la
enzima:
E+I
E’
INHIBICIÓN REVERSIBLE
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,
IMPIDIENDO LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO:
Inhibición Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de
que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, NO
IMPIDE LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO a la enzima,
pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No
Competitiva
Inhibición Competitiva
S
E
ES
E+P
I
EI
Se define una constante de
equilibrio de disociación del
inhibidor:
[E] [I]
Ki =
[EI]
Características:
- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del
substrato.
- El inhibidor es tan específico como el substrato
Por tanto, en la inhibición competitiva,
1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la
Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy
altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia
del inhibidor competitivo.
Inhibición competitiva - Representación recíproca doble
1/v
0.07
0.06
0.05
1/Vmax
0.04
-1/Km
0.03
0.02
0.01
1/s
0.00
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
-1/(K
(1
+
i/K
m
i))
0.3
0.4
0.5
0.6
Inhibidores
competitivos
Succinato deshidrogenasa
COO-
FAD
FADH2
COO-
CH2
CH
CH2
CH
COOSuccinato
SDH
COOFumarato
COOCH2
COOMalonato
COOC O
CH2
COOOxalacetato
COOInhibidores competitivos
como ánalogos estructurales
del substrato
CH2
CH2
COOSuccinato
COOC O
CH2
COO-
Oxalacetato
Inhibición No Competitiva
S
E
ES
I
E+P
I
S
EI
ESI
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E
y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos
INHIBICION NO COMPETITIVA
• E+I
• I + ES
EI
ESI
• El agente quelante EDTA se une reversiblemente al
Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de
modo no competitivo a algunas enzimas que precisan
esos iones para su actividad.
DROGA
USO
TERAPEUTICO
ENZIMA
AFECTADA
TIPO DE
INHIBICION
Lovastina
Hipercolestero
lemia
HMGCoA
reductasa
Competitiva
5fluoroacil
cancer
Dihidrofolato
reductasa
competitiva
alopurinol
gota
Xantino
oxidasa
irreversible
cumadin
anticoagulante
Glutamilcar
boxilasa
competitiva
captopril
hipertensión
ECA
competitiva
concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)
- El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato,
sino del Estado de Transición de la reacción.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del
orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que
puede considerarse irreversible
Estado de
transición
Substrato
Análogo de
estado de transición
EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN LAS INTERACCIONES ENTRE LA
ENZIMA Y EL SUSTRATO SON ÓPTIMAS
INHIBICIÓN IRREVERSIBLE
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
químico de la enzima, modificándola covalentemente
E+I
E’
-El efecto de los inhibidores irreversibles depende del
-tiempo de actuación del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente
tóxicos.
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfóricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
Reactivos de grupos -SH,
(a) Agentes alquilantes
Yodoacetato
ICH2 COO-
E SH
IH
E S CH2 COOO
(b) Compuestos insaturados
E S
E SH
N CH2 CH3
O
O
N CH2 CH3
N-Etil maleimida (NEM)
O
Reactivos de grupos -SH, 2
(c) Formadores de mercáptidos
HOHg
E SH
COO-
p-Hidroximercuribenzoato
E S Hg
COO-
(d) Oxidantes
Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro
Organofosfóricos
Ser CH CH2
H3C
OH
Ser CH CH2
H 3C
CH3
CH
F
P O
CH
H 3C
CH3
DFP:
diisopropil
fluorofosfato
CH3
CH
O P O
CH
H3C
CH3
- Actúan sobre enzimas serínicas
- Únicamente sobre la Ser activa
- Insecticidas: Parathion, Malathion
- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa
Ligandos de coordinación de metales
Es el caso del ion cianuro, CNSe fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación
del Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.
Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta
posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa,
de lo que deriva su elevadísima toxicidad
SUBSTRATOS SUICIDAS
(Inhibidores activados enzimáticamente)
- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera
específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la
molécula en una especie química muy reactiva que modifica
covalentemente a la enzima, inactivándola
-Tienen por tanto :
(a) la especificidad del inhibidor competitivo y
(b) la potencia de los inhibidores irreversibles
Modo de acción de los inhibidores suicidas
E+I
1
EI
2
EI*
3
E’ + I*
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un
inhibidor competitivo convencional
2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I
en una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola
de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
INHIBIDORES SUICIDAS,
- SISTEMA DE LA b-LACTAMASA BACTERIANA
La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas,
sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a
la aparición de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por
producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibióticos b-lactámicos.
Penicilina (activa)
S
R CO NH
CH3
CH3
N
O
COO-
b-Lactamasa
R CO NH
O C HN
O-
S
CH3
CH3
COO-
Ác.peniciloico (inactivo)
Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas
semisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicida
de la b-lactamasa, el ácido clavulánico
O
CH2OH
C
N
b-Lactamasa
H
O
O
C
O-
CH2OH
C
HN
H
-
COO
COO-
Ác.clavulánico
O
O
C
CH CH2
Ser
O
O
CH2OH
C
HN
H
COO-
Esta molécula
reacciona con la
serina activa de la
b-lactamasa,
produciendo su
inactivación
- SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL
Los estados depresivos, en general, están relacionados con un
descenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos
(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del
cerebro.
Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos
neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).
Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea como
terapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos
inhibidores suicidas de la MAO
Noradrenalina
HO
HO
CHOH CH2 NH2
O2 + H2O
Monoamino
oxidasa
NH3 + H2O2
HO
HO
CHOH CHO
Dihidroxifenilglicol
La MAO es una flavoproteína:
tiene un grupo prostético
flavínico (FAD) fundamental
para la catálisis. Los inhibidores
suicidas de la MAO inactivan
al cofactor FAD.
O
H3C
N
E S H2C
N
N,N’ dimetil
propargilamina
(pargilina)
NH
N
R
Flavina
O
CH3
+
HC C CH N
CH3
H3C
Inhibición suicida de la
MAO mediante Pargilina
N+
CH CH
H3C
CH
H3C
N
E S H2C
N
R
Flavina modificada
O
NH
NH
O
CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES
1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple
Azahar:
A +E
AE
AE+B
AEB
B+ E
BE
BE + A
BEA
2) ORDENADA
MALATO + NAD
M.D
OXALACETATO + NADH.
E-NAD-MALATO
1
2
2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO
ASPARTATO + OXOGLUTARATO
OXALACETATO + GLUTAMATO
1) Aspartato + PLP-E
Oxalacetato
2) Oxoglutarato + NH3
NH3- PLP-E +
PLP-E +
Glutamato
qué son las moléculas
efectoras o moduladoras ?
Son moléculas que pueden ser
activadores (+) o inhibidores (-) de la
velocidad catalítica.
No cambian la afinidad del enzima
por el sustrato.
Pueden ser el mismo sustrato
denominado HOMOTROPICO o es
otra sustancia al que se le conoce
como HETEROTROPICO
¡SI!!
PORQUE LOS E.A. PRESENTAN 2
LOCALIZACIONES DE UNION DE
LIGANDOS:
1.- Las catalíticas (Centro Activo) a las
que se une el sustrato.
2.- Las reguladoras (Centro Alostérico)
a las que se unen las moléculas
denominada efectores o moduladores.
ENZIMAS ALOSTERICAS
S
S
CA
C.ALOST.
ENZIMA
CINETICA SIGMOIDEA
La unión cooperativa de la primera
molécula de S o ligando a la Enzima
incrementa la velocidad de unión de
subsecuentes moléculas de sustrato
a los otros sitios de unión:
cooperatividad positiva
ENZIMAS ALOSTERICAS
Enzimas
susceptibles de
ser modificadas
por moléculas
pequeñas.
• ESTADO CONFORMACIONAL
T
Baja afinidad por el sustrato
R
Alta afinidad por el sustrato
MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS
MODELO CONCERTADO:
+S
RR
TT
RR
MODELO SECUENCIAL :
TT
RT
+S
+S
RR