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Identificación y análisis funcional de microRNAs
desregulados en cáncer mama
Dr. César López Camarillo
Laboratorio de
Oncogenómica y Proteómica del Cáncer
[email protected]
POSGRADO EN
CIENCIAS
GENÓMICAS
secuencia del genoma humano se conoce desde
Lafebrero
de 2001
James Watson
3,200 millones de bases (3200 Mb)
Predice unos 20,000 - 25,000 genes (1.5% genoma !)
Craig Venter
70% está compuesto por ADN extra-génico no
codificante (DNA basura - microRNAs)
Examples of People Who Have had Their
Genomes Sequenced
Jim Watson
James Watson
Craig Ventor
Craig Venter
From: www.genciencia.com
sciencewithmoxie.blogspot.com.au/2010_11_01_archive.html
Ozzy Osbourne
El Dogma Central de la Biología
Molecular y los “omas”
Gen-oma (DNA)
ACGTTATGAGACGGATTAGGACAAACTATAA
AAATATTAGCCGATGATCACCCAGGATTTTT
Transcript-oma (mRNA)
MicroRN-oma (miRNAs)
Prote-oma (Proteínas)
microRNAs: nuevos reguladores de
la expresión genética
Transcritos
RNAs no codificantes
RNAm que
codifican proteínas
RNAs reguladores de
la expresión génica
siRNAs, lncRNA,
microRNAs
RNAs de mantenimiento
tRNA, rRNA, snRNA
snoRNAs
MicroRNAs: RNA pequeños (21-25 nt) que regulan negativamente la expresión genética.
Descritos en 1993 por
Victor Ambros en
C. elegans.
Un microRNA puede modular hasta mas de 100 transcritos y proteínas diferentes
Los microRNAs son reguladores
negativos de la expresión génica
Existen mas de 1000 miRNAs codificados en el genoma humano.
Se desconoce la función de mas del 80% de los miRNAs.
Gen miRNA
mi
MicroRNA
Los genes que codifican a los
microRNAs (>1000) se localizan
dispersos en el genoma.
Se unen a la región 3´UTR de
los RNAm (transcritos) e inhiben
su traducción e inducen su
degradación
Degradación del RNAm
Silenciamiento de
la expresion génica
OncomiRs: microRNAs que funcionan como
oncogenes y supresores de tumor
Un microRNA funciona como oncogén cuando inhibe genes que suprimen
la proliferación, crecimiento tumoral, metástasis, o que activan apoptosis
miR-21
miR-21
PDCD4
PDCD4
Apoptosis
Cáncer
Los microRNAs modulan los hallmarks del cáncer
Autosuficiencia de las
señales de crecimiento
Evasión de la
apoptosis
Angiogénesis
Insensibilidad a las señales de
anti-crecimiento
Potencial replicativo
ilimitado
Invasión de tejidos
y metástasis
Los microRNAs representan nuevos blancos
terapéuticos en cáncer
La expresión de los miRNAs se altera
frecuentemente y contribuye a la carcinogénesis
Cáncer de mama
Crecimiento exacerbado de los tejidos de la mama debido al aumento en la proliferación
migración e invasión celular, así como la inhibición de la apoptosis .
Es la neoplasia con mayor incidencia y mortalidad en las mujeres.
Una muerte por cáncer de mama cada 2 h.
(10%)
(80%)
Genómica integrativa (omics) en el
descubrimiento de biomarcadores en cáncer
Tumour, serum
Protemics
Protein quantification (2DE)
Protein identification (MS/MS)
microRNAs profiling
miRNAs microarrays
qRT-PCR arrays (TLDA)
Transcriptomics
DNA microarray
RNA seq
normal
Diferentially expressed
onco-proteins
tumoral
Differentially expressed
omcogenic mRNA/miRNA
Concordant protein/mRNA/miRNA
expression (Regulatory networks)
normal
tumoral
Validate proteins, mRNAs
Microarray tissues (IEQ)
Functional analysis
Therapeutic targets
Biomarker candidates
Validation in
patients
Prognostic
markers
Búsqueda de microRNAs desregulados
en cáncer de mama
Cirugía
Sueros
Biopsias
Congelación en N2
almacenamiento a 80°C
Banco de tejidos FUCAM
Inmunohistoquímica
ER, PR, HER2
Megaplex Primers TaqMan Low Density Arrays
(TLDA)
667 microRNAs cuantificados en un solo paso
54 miRNAs modulados
(FC ≥2.0 p=0.05)
34 miRNAs reprimidos (63%)
20 miRNAs sobrexpresados (37%)
Huella de expresión de 54 miRNAS
y validación de TLDAs
MicroRNAs seleccionados para análisis funcional
miRNA
Reportes
Función
miR-944
↓ (9/9)
Sobre-expresado en Induce migración
cáncer de cérvix
miR-204
↓ (9/9)
En cancer de mama,
cancer endmetrial,
glioma
Reprime
migración y
metástasis
miR-18b
↑ (9/9)
Reprimido en cáncer
de prostata.
.
Regulación
negativa del
receptor HER2
Procesos y rutas celulares
Blancos predichos
Vía de señalización WNT
APC, AMOT, DLL4,
Vía de señalización de TGF-b IGF1R, JAG1, MAPK1,
Glioma, Cáncer colorectal
NF1, NEXN, PTP4A1,
TAC1 THBS1, VEGFA,
ARID5B,
BTG1,
CD2AP,
POU3F2,
POU4F1, SIX4,
MAPK
Biosíntesis de glicanos
Uniones adherentes
Señalización Fc epsilon R1
HIF1A, IGF1, MAP3K1,
PARD6B, KIT
Análisis funcional del miR-204 en cáncer de mama
M. en C. Ali Flores Pérez, UACM
La expresión del miR-204 se reprime en
tumores y líneas celulares de cáncer de mama
¿Genes regulados por el miR-204?
Transfección del precursor miR-204
Transcritos modulados
por el miR-204
(DNA microarrays)
Supresión de los transcritos
blanco de miR-204
DNA microarrays Nimbelgen 12x135 (Roche)
miR-944
transfected
No transfected
control
135,000 probes
3 probes per gene
45,032 genes
Oligos 60-mer
549 modulated genes by miR-204(FC≥2.0)
311 suppressed genes
238 upregulated genes
Procesos celulares en los que participan los genes modulados por el miR-204
¿ La restauración de la expresión del miR-204 modula
los hallmarks del cáncer ?
Transfección del miR-204
Análisis de fenotipos:
migración, invasión,
proliferación,
angiogénesis
Supresión de los transcritos
blanco de miR-204
El miR-204 inhibe migración de las células tumorales
Scratch/wound
healing assays
Transwell assays
Inserto
Membrana
El miR-204 inhibe la proliferación celular
Clonogenic assays
El miR-204 reprime genes involucrados
en angiogénesis
Agentes
pro-angiogénicos
Agentes
anti-angiogénicos
VEGFA
Angiopoyetina 2
ANGPT1
Trombospondina
FGF (α y β)
Interleucina 4, 12 y 18
TNF-α,
interfereron α,β,γ
MMPs (2 y 9)
Troponina-1
Angiogenina e
Angiostatina
IL8
TGFβ/TGFBR
El miR-204 inhibe la angiogénesis in vitro
Co-culture angiogenesis
assays HUVEC/MDA-MB-231
MDA-MB-231
HUVEC/MDA-MB-231-Sc
HUVEC
HUVEC/MDA-MB-231
miR-204
Human umbilical vein endothelial cells
(HUVEC) are cells derived from the
endothelium of veins from the umbilical cord.
They are used for the study of the function
and pathology of endothelial cells and
angiogenesis.
HUVEC/VEGFA
¿ El miR-204 inhibe la angiogénesis a través de la represión del mRNA de los
genes pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2 ?
3´UTR LUC assay
3´UTR of miR-204
target
In abscence
of miR-204
miR-204
3´UTR ANGPT1
miR-204
El miR-204 se une a la región 3´UTR y reprime la
expresión de ANGPT1 y TGFBR2
CONCLUSIONES:
Identificamos nuevos microRNAs
desregulados en cáncer de
mama de pacientes mexicanas
El miR-204 inhibe proliferación y
la migración de la célula tumoral.
El miR-204 inhibe angiogénesis a
través de la unión directa y
desregulación del mRNA de los
factores pro-angiogénicos
ANGPT1 y TGFBR2
La restauración del miR-204 en
tumores de pacientes podría
considerarse como una
estrategia útil en la terapia del
cáncer de mama
Colaboradores
Dr. Sergio Rodríguez Cuevas
Dra. Verónica Bautista
Instituto de Enfermedades de la Mama, FUCAM
Dr. Alfredo Hidalgo Miranda
Instituto Nacional de Medicina Genómica, INMEGEN
Dra. Elena Arechaga Ocampo
Dr. José Díaz Chávez
Dra. Erika Ruiz Garcia
Instituto Nacional de Cancerología, InCan
Dra. Laurence Annie Marchat
Programa en Biomedicina Molecular, ENMyH-IPN
Dra. Ángeles Carlos-Reyes
Financiamiento
Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias
Dr. Patricio Gariglio
CINVESTAV-IPN
Fonsec Salud 2009-2012
Fonsec Salud 2014-2017
Ciencia Básica 2014-2017
Se aceptan estudiantes de
Maestría y Doctorado en
Ciencias Genómicas !!
[email protected]
Gracias por su atención
Biomarcadores tumorales en la
clasificación y tratamiento del cáncer de mama
HER2
ER
PR
Inmunohistoquímica
Variables
clínicas
pronósticas
Tamaño tumor
Nódulos
Metástasis
ER+, PR+, HER2+/-
Marcadores tumorales
(variables biológicas)
Receptor de estrógenos (ER)
progesterona (PR) y HER2
ER+, PR+, HER2+++
ER-, PR-, HER2-
Luminal A
HER2
Triple negativo
(50%)
(30%)
(15-20%)
Terapia hormonal
Tamoxifeno (anti-ER)
Ablación ovárica
Anastrozol, Letrozol
Quimioterapia
Terapia personalizada
Trastuzumab (anti-HER2)
Tamoxifeno (anti-ER)
Quimioterapia
Quimioterapia
La expresión
de 54 miRNAs seen
moduló
54 miRNAs
se desregularon
los
significativamente en 9 tumores mamarios ductales
tumores mamarios
microRNAs reprimidos
miR-139-5p
miR-508-3p
miR-10b*
miR-944
miR-486-5p
miR-100
miR-424*
miR-125b-2*
miR-218
miR-541
miR-221*
miR-337-3p
miR-369-3p
miR-1
miR-26b*
miR-95
miR-204
miR-216b
miR-656
miR-488
miR-139-3p
Let-7b
miR-543
miR-335
miR-433
miR-489
miR-132*
miR-195
miR-376c
Let-7c
miR-432
miR-132
miR-376a
miR-10b
microRNAs sobreexpresados
miR-155
miR-331-3p
Let-7g*
miR-188-5p
miR-708
miR-301a
miR-454*
miR-7
miR-130b
miR-18b
miR-183*
miR-181a*
miR-21
miR-142-3p
miR-592
miR-425*
miR-431
miR-142-5p
miR-148b*
miR-638
Los microRNAs regulan de manera
negativa la expresión génica
López-Camarillo C., et al 2013