Download Técnicas para evaluar inmunidad viral

Técnicas para Evaluar
Inmunidad Viral
Inmunología Aplicada 1065
Formación de profesores 2005
Carolina Hernández
Supervisado por MD Lastra
Radioinmunoensayo (RIA)

Técnica muy sensible basada en la
competencia de unión al anticuerpo
específico entre la sustancia a cuantificar y
cantidades conocidas de la misma sustancia
marcada con un isótopo. A mayor antígeno a
cuantificar, menor será el antígeno marcado
unido al anticuerpo y viceversa.
Enzimoinmunoanálisis (EIA)

Los EIA para la detección de antígeno se
basan habitualmente en la captura del
antígeno por anticuerpos específicos unidos
a una fase sólida, en general, un pocillo de
una microplaca o una esfera de plástico. El
antigeno presente en la muestra se combina
con el anticuerpo fijado. El Ag se detecta con
otro anticuerpo específico conjugado a una
enzima, se adiciona un sustrato para la
enzima y se mide la intensidad de color.
Enzimoinmunoanálisis Indirecto
(EIA)

Se han aplicado de manera amplia en el
diagnóstico de anticuerpos virales. Los
antígenos virales se inmovilizan sobre una
fase sólida (policubetas), se agregan los
sueros en estudio, se incuban, se lavan y se
revela la reacción Ag-Ac por el agregado de
una Ig antiespecie conjugada con una
enzima seguida de un sustrato apropiado
para esta.
ELISA

Permite identificar inmunocomplejos por
medio de enzimas unidas al antígeno o
anticuerpo, estando uno de ellos adsorbido a
un soporte sólido (placa de poliestireno). La
reacción antígeno-anticuerpo se detecta
mediante la utilización de un marcador que
es una enzima conjugada químicamente al
antígeno
o
anticuerpo
(peroxidasa,
fosfatasa), se añade un sustrato al cuál la
enzima convierte de incoloro a un producto
coloreado.
ELISPOT




Prueba diseñada originalmente para la detección de
células B secretoras de anticuerpos antígeno
específicos.
Se ha adaptado para la detección de células
secretoras de citocinas específicas u otros
antígenos.
Incorpora el ensayo inmunoenzimático en fase
sólida ELISA.
Es un método sensible y selectivo para el estudio
de citocinas, no requiere estimulación previa para
reflejar la situación in vivo.
ELISPOT

Se puede utilizar para cuantificar y monitorear
respuesta de células T con frecuencias del
orden de 1 en 100,00, así como células que
secreten menos de 100 moléculas de citocina
por segundo.

El IFN-γ secretado por las células en cultivo, es
capturado en las inmediaciones de la células
por un anticuerpo específico anti- IFN-γ
adsorbido en el fondo del pozo.
ELISPOT

Las células se retiran mediante lavados
sucesivos y se adiciona un segundo anticuerpo
específico anti-IFN-γ marcado con una enzima,
el cuál va a adherirse al interferón inmovilizado
por el primer anticuerpo, al adicionar el sustrato
de la enzima se forma un producto colorido
insoluble que permite ver el sitio en donde se
encontraba la célula secretora de IFN-γ como
una mancha de color.
Inmunofluorescencia


Es una técnica histoquímica o citoquímica,
útil para detectar y localizar antígenos en
células o tejidos. Se utiliza un anticuerpo
específico conjugado con un compuesto
fluorescente dando como resultado un
marcador sensible contra el antígeno.
Inmunofluorescencia
directa
(ID).
El
anticuerpo conjugado se añade directamente
a la sección de tejido o suspensión de
células viables.
Inmunofluorescencia
Indirecta

Se basa en la unión de anticuerpos
antivirales a los antigenos virales expresados
en la superficie y el citoplasma de células
infectadas (fijadas en un portaobjetos). Útil
para la determinación de anticuerpos
antivirales en el suero del paciente. Se
incuba el suero del paciente con las células
infectadas y se agrega un anticuerpo anti-IgG
humana conjugada con isotiocianato de
fluoresceína.
Inmunofluorescencia

Puede usarse para detectar el virus de la
influenza A y B, Parainfluenza 1,2 y 3 y
Adenovirus entre otros
Virus de la influenza
La presencia de anticuerpos en el
citoplasma y superficie de las células
infectadas
Aglutinación en látex


La aglutinación de las partículas de látex
recubiertas por un Ag específico permite la
detección de Ac libres específicos para el Ag
Se basa en las interacciones Ag-Ac, donde la
cantidad y especificidad de la reacción se
evalúa por los cambios físicos inducidos tras
la unión del anticuerpo específico con su
antígeno correspondiente para formar
inmunocomplejos.
Hemaglutinación


Ciertos virus (influenza, parainfluenza y
togavirus) producen antígenos que logran
acoplarse de manera espontánea a los
eritrocitos y forman reactivos estables para la
detección de anticuerpos.
Esta reacción puede inhibirse usando un
anticuerpo específico antiviral. De esta
manera la hemaglutinación puede usarse
para cuantificar el virus y el título de
anticuerpos contra el virus hemaglutinante.
Western Blot (WB)


Con el uso combinado de electroforésis y
ELISA puede determinarse la respuesta a
una diversidad de proteínas específicas a
patógenos.
Este procedimiento proporciona un medio
específico para identificar reactividad de
anticuerpos.
Western Blot (WB)


Se basa en la separación de los antígenos
virales mediante una electroforesis en gel
de SDS-PAGE (lo cual proporciona una
carga negativa a la proteínas).
Las proteínas virales son sometidas a una
electroforesis en geles de poliacrilamida.
Como las proteínas están cargadas
negativamente se separan con base a su
peso
molecular
(las
más
grandes
permanecen en la parte superior del gel y las
menores migran hacia la base).
Western Blot (WB)


Las proteínas se transfieren a un soporte
sólido (papel de nitrocelulosa, nylon), lo cual
da una copia exacta del patrón del gel en la
matriz.
La identificación de las proteínas a estudiar
se realiza usando un ELISA indirecto. Las
reacciones se leen como positivas cuando
una línea de precipitación o color se forma en
el peso molecular correcto para una proteína
particular.