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Diagnóstico prenatal no invasivo de
enfermedades
monogénicas
por
secuenciación masiva dirigida en paralelo
de plasma materno: aplicación a βTalasemia
K.-W.G. Lam, P. Jiang, G.J.W. Liao, K.C. A. Chan,
T.Y. Leung, R.W.K. Chiu y Y.M.D. Lo
Octubre 2012
www.clinchem.org/cgi/content/article/58/10/1467.full
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Introducción
Diagnóstico prenatal:
 Parte establecida del cuidado obstétrico
 Las pruebas fetales de ADN definitivas típicamente
involucran procesos invasivos (por ejemplo, amniocentesis,
muestreo de vellosidad coriónica) con riesgo de aborto fetal
ADN fetal libre en plasma materno:




Informado por primera vez en 1997
Solo equivale a un promedio del 10% del ADN total
Facilita el diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD)
Aplicación temprana: determinación del sexo del feto
por enfermedades relacionadas con el sexo y por
hiperplasia suprarrenal congénita, pruebas de grupo
sanguíneo rhesus D © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry
Introducción
Secuenciación masiva en paralelo del ADN de
plasma materno:
 Medición precisa del ADN
 Permite el NIPD de aneuploides cromosómicos
(por ejemplo, trisomía 21)
 La secuenciación profunda permitió el análisis fetal
genético y mutacional
Secuenciación dirigida:
 Para capturar y amplificar selectivamente los fragmentos
de ADN en zonas dirigidas de una muestra de ADN para
secuenciación
 Económico para secuenciación profunda de las zonas
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dirigidas
Introducción
NIPD de β-talasemia:
 Una enfermedad monogenética recesiva autosómica
causa anemia (el gen HBB en el cromosoma 11)
 Un feto afectado heredó tanto las mutaciones
maternas como las paternas
 El NIPD requiere determinar la herencia fetal de las
mutaciones maternas y paternas del ADN de plasma
materno
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Pregunta 1
 ¿Cuáles son los retos para alcanzar el NIPD
de la β-talasemia fetal en plasma materno
en comparación con aplicaciones tales
como la determinación del sexo del feto?
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Materiales y métodos
Muestras:
 2 familias: ambos padres eran portadores de β-talasemia
 Se tomaron muestras sanguíneas de 2 mujeres
embarazadas y de sus esposos durante el 1er trimestre
Secuenciación dirigida del ADN de plasma materno:
 Se extrajo el ADN de plasma materno
 Las moléculas de ADN en el grupo del gen HBB fueron
enriquecidas para la secuenciación masiva en paralelo
Plasma de ADN
Enriquecimiento de la meta
ADN en zonas dirigidas
Lecturas de secuenciación
Secuenciación
masiva en paralelo
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Materiales y métodos
Información genética de los padres:
 Se extrajo el ADN genómico de los padres de una capa leucocitaria
 La información de haploescritura del grupo del gen HBB fue
cuestionada mediante RCP digital
 El haplotipo es una combinación de alelos en el lugar adyacente
del cromosoma que se transmiten en forma conjunta
Haplotipo 1 Haplotipo 2
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Materiales y métodos
Región para enriquecimiento de la meta,
kb
~288
Región para haploescritura, ~103 kb
Figura 1. Las mutaciones de HBB y la herencia de mutaciones β- talasémicas en 2 familias. (A), Regiones
dirigidas para enriquecimiento y haploescritura. Las cajas llenas y las vacías representan los exones e
intrones de HBB, respectivamente. Tres mutaciones comunes identificadas en las 2 familias estudiadas
están marcadas con líneas punteadas. (B), La herencia de mutaciones β- talasémicas en la primer familia.
(C), La herencia de las mutaciones β- talasémicas en la segunda familia. WT, alelo natural.
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Materiales y métodos
Deducción de la herencia de HBB fetal paterna:
 Para detectar la presencia de una mutación de origen
paterno en el plasma materno, si la mutación paterna
difiere de la mutación materna
HBB paterna
HBB materna
HBB fetal
Plasma de ADN materno
Figura 2. Deducción de la mutación de origen paterna en el gen HBB. M=mutante,
W=natural
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Materiales y métodos
Deducción de la herencia de HBB fetal materna:

Para detectar la sobrerreprentación de mutación y de alelos adyacentes
(como un haplotipo) en ADN de plasma mediante un “análisis de la dosis de
haplotipo relativo” (análisis RHDO)
HBB paterno
HBB materno
HBB fetal
Análisis RHDO
ADN de plasma materno
Figura 3. Deducción de mutación de origen materna mediante análisis RHDO en el gen HBB.
M=mutante, W=natural.
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Pregunta 2
 ¿Qué factores pueden afectar la precisión del
análisis RHDO?
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Resultados principales
NIPD del estado mutacional del feto en la 1ra familia
 Se detectó la mutación paterna (eliminación –CTTT)
mediante secuenciación profunda (60/741 lecturas)
 Se sobrerrepresentó el haplotipo materno que lleva el
gen HBB natural
 Conclusión: el feto era un portador heterocigoto.
1ra familia
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Resultados principales
NIPD del estado mutacional del feto en la 2da familia
 NO se detectó mutación paterna (A→T en el codón 17)
mediante secuenciación profunda (0/826 lecturas)
 Se sobrerrepresentó el haplotipo materno que lleva la
mutación materna (eliminación –CTTT)
 Conclusión: el feto era un portador heterocigoto
2da familia
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Pregunta 3
 ¿Cuáles son los pros y contras del RHDO
dirigido frente a enfoques digitales basados
en PCR “más sencillos” para el análisis de la
dosis de mutación relativa en NIPD de
enfermedades monogénicas?
Referencia: Lun FMF et al. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and
relative mutation dosage on DNA in maternal plasma.
Proc Natl
Acad
SciAmerican
U S A 2008;105:19920–5.
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Conclusiones
 La combinación de la secuenciación dirigida y
el análisis de RHDO es factible para NIPD de βtalasemia
 El concepto puede generalizarse para otras
afecciones genéticas, pues expande la
aplicación del NIPD basado en ADN de plasma
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