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Metilación del promotor SOX17 en
células tumorales circulantes y ADN
coincidente de células libres aislado
del plasma de pacientes con cáncer de
mama
M. Chimonidou, A. Strati, N. Malamos,
V. Georgoulias y E.S. Lianidou
Enero de 2013
www.clinchem.org/content/59/1/270.full
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Introducción
Células tumorales circulantes (CTC)
•Las CTC juegan un papel fundamental en la diseminación metastásica de los
carcinomas y su detección está asociada con el pronóstico en diversos tipos de
cáncer humano, mientras que su enumeración ha sido esclarecida por la FDA
para el seguimiento de pacientes con cáncer de mama, colon y próstata, a
quienes se les han confirmado metástasis.
•Las CTC representan una herramienta diagnóstica nueva y promisoria,
especialmente para pacientes con cáncer en etapa avanzada, en quienes las
CTC pueden usarse como una "biopsia líquida", que permite a los médicos llevar
un seguimiento de los cambios del cáncer con el paso del tiempo y adaptar el
tratamiento de forma correspondiente.
•No obstante, actualmente queda claro que la simple enumeración de las CTC no
es suficiente.
•La caracterización molecular de las CTC es muy importante ya que puede jugar
un papel fundamental en la comprensión de la biología de la metástasis y en la
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selección de pacientes para el tratamiento
dirigido.
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Introducción
ADN de células libres (ADNcf)
•El ADNcf circula en el plasma de pacientes con cáncer a elevadas
concentraciones.
•Muchos equipos se han enfocado al desarrollo de ensayos que permitan
la detección específica de pequeñas cantidades de ADNcf específico del
tumor en la sangre periférica de pacientes con cáncer.
•La detección de alteraciones en el ADN específico del tumor, como
mutaciones y metilación en el ADNcf, proporciona una fuente de ADN para
el análisis genético menos invasiva y de más fácil acceso que las biopsias
de tumores.
•Diversos estudios han descrito la metilación de los genes supresores de
tumores en muestras de suero o plasma y en los correspondientes tumores
de mama primarios, aunque la metilación de ADN no se detectó en el
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plasma ni en el suero de donantes ©sanos.
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Introducción
SOX17
•Es un miembro de la familia de los factores transcripción SOX (caja del
grupo de alta movilidad relacionado con el gen SRY).
•Juega un papel fundamental en la regulación del desarrollo y la función
de células precursoras o células madre, parcialmente a través de la
represión de la vía canónica de señalización Wnt/beta-catenina.
•El análisis global de la hipermetilación de islas de CpG y la expresión
genética en líneas celulares de cáncer demostraron que el silenciador
génico SOX17 está asociado con la hipermetilación de ADN de una isla
de CpG localizada en la región del promotor
•El promotor SOX17 está metilado en las CTC aisladas de sangre
periférica de pacientes con cáncer de mama.
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Pregunta:
¿Existe una conexión directa entre la presencia
de CTC y el ADN de células libres en pacientes
con cáncer de mama operable a quienes se les
ha realizado la resección del tumor primario?
Para contestar esta pregunta los autores escogieron usar el mismo
marcador y la misma metodología en las muestras clínicas coincidentes.
Los autores evaluaron si la metilación del promotor SOX17 en las CTC
estaba asociada con el patrón de metilación de este gen en el ADNcf
coincidente aislado del plasma de pacientes con cáncer de mama.
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Cáncer de mama temprano
(N=55)
Figura 1.
Diagrama esquemático del
flujo de trabajo del estudio.
Cáncer de mama avanzado con
metástasis confirmada
(N=59)
Individuos sanos
(N=13)
21 mL de sangre periférica en EDTA
20 mL: Aislamiento de PBMC
mediante centrifugación por
gradiente de densidad (Ficoll)
Selección positiva de CTC mediante
separación inmunomagnética
(EpCAM)
1 mL: separación de plasma
Aislamiento de ADNcf del plasma (200 mcL)
Fracción de CTC
Aislamiento de ARN total (Trizol)
Aislamiento de ADN genómico (Trizol)
Aislamiento de RNAm (oligo-dTbeads)
Conversión con SB del ADN genómico
Síntesis de ADNc
MSP en tiempo real para SOX17
RTq-PCR para CK-19
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20 mL de
sangre
periférica
Metodología
PBMC
Gradien
te de
Ficoll
Recuento de
células
Aislamiento de
CTC
Aislamiento de
ADN de células
libres
Plasma
Extracción
de ADN de
las CTC
Selección
positiva
(EpCAM)
Aplicación de
imán
Figura 2. Esquema de la obtención de ADN de células libres y CTC.
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Metodología
PCR específica de metilación (MSP)
La reacción de MSP es una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
basada en conversión con bisulfito para el estudio de la metilación CpG del ADN.
El bisulfito de sodio convierte a uracilo todas las citosinas no metiladas (no así las
metiladas).
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¿Cómo se diseñaron las sondas y los
cebadores específicos de metilación?
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Metodología
Diseño de cebadores para MSP
Para una discriminación máxima entre
los alelos metilados y los no metilados,
el cebador debe contener al menos un
sitio CpG con un saliente de 3’.
Además de los sitios con un saliente
de al menos 3’, se prefieren más sitios
CpG en las secuencias del cebador.
Tanto los cebadores como las sondas
de MSP deben incluir bases T
derivadas de las regiones C
modificadas no metiladas para
discriminar y amplificar el ADN
convertido del no convertido.
tratamiento
con bisulfito
GATUUTGATTGC
adición de cebadores
metilados específicos
para ADN
adición de cebadores no
metilados específicos para
ADN
inicio de la reacción
PCR
hibridación del cebador, prosigue la
elongación, generación de diversos
fragmentos de ADN por amplificación
de PCR; por tanto, se produce la
metilación de CpG
inicio de la reacción
PCR
el cebador no logra realizar la
hibridación de forma correcta,
sin productos de PCR; por
tanto, se produce la metilación
de CpG
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Especificidad del ensayo MSP de SOX17
ADN no metilado
ADN metilado
Tratamiento del
ADN genómico con
bisulfito
MSP con cebador metilado
específico y sonda
PCR específica de
metilación en
tiempo real
control 100%
metilado
50% metilado
1% metilado
0% metilado
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Resultados: graficas de las características
Reacción de
MSP en
tiempo real
para SOX17
con ADN
aislado de
fracciones de
CTC de:
a) donantes sanos
b) cáncer de mama operable
c) metástasis confirmada
MSP en
tiempo real
para SOX17
con ADN
aislado de
ADNcf de:
a) donantes sanos
b) cáncer de mama operable
c) metástasis confirmada
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RESULTADOS
Mapa de calor de la metilación del promotor SOX17 en muestras coincidentes:
Fracción de CTC y ADNcf de pacientes con: (a) cáncer de mama operable (n=55),
(b) metástasis confirmada (n=59)
En paralelo, la expresión del marcador epitelial CK-19 se muestra en la fracción de
CTC
Cáncer de mama temprano (n=55)
SOX17 de CTC
ADN de células libres
CK19
Metástasis confirmada (n=59)
SOX17 de CTC
ADN de células libres
CK19
SOX17 metilado
Muestras no metiladas
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Cáncer de mama
ADN de células libres
operable (N=55)
SOX17 metilado
SOX17 no metilado
Total
SOX17 metilado
11
8
19
SOX17 no metilado
8
28
36
Total
19
36
55
Fracción de CTC
Tabla 1.
Esquema de la
obtención de ADN
de células libres y
CTC.
Acuerdo 39 de 55 (70.9%), P*=0.008
Metástasis confirmada
ADN de células libres
(n=59)
SOX17 metilado
SOX17 no metilado
Total
SOX17 metilado
13
14
27
SOX17 no metilado
11
21
32
Total
24
35
59
Fracción CTC
Acuerdo 34
de 59
P*=0.283
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Pregunta
 ¿Por qué la metilación del promotor SOX17 en las
CTC y el ADNcf está altamente correlacionada en el
cáncer de mama primario en contraste con la
metástasis confirmada?
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Análisis
• La metilación del promotor SOX17 en las CTC y el ADNcf coincidente
muestra una alta correlación en el cáncer de mama temprano pero no
en la metástasis.
• Este hallazgo apunta hacia una conexión directa entre la presencia
de CTC y ADNcf en pacientes con cáncer de mama operable,
después de la remoción quirúrgica del tumor primario.
• En el grupo de pacientes con metástasis confirmada, no se observó
tal conexión, incluso cuando en varios casos hubo concordancia
entre la metilación de SOX17 en CTC y ADNcf.
• Esto podría deberse posiblemente al hecho de que en este caso la
metástasis ya estuviera presente y el ADNcf podría liberarse también
de células apoptóticas que se escapan del sitio metastásico.
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Conclusiones
• La metilación del promotor SOX17 en las CTC y ADNcf
coincidente está altamente correlacionada en el cáncer de
mama temprano pero no en la metástasis.
• Este hallazgo apunta hacia una conexión directa entre la
presencia de CTC y ADNcf en pacientes con cáncer de mama
operable, después de la remoción quirúrgica del tumor
primario.
• Dado que este estudio fue prospectivo, la importancia clínica
de este hallazgo se debe seguir evaluando hasta que se
conozcan los resultados clínicos de estos pacientes con
cáncer de mama temprano.
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