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MICROSCOPIA

Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen
 Es la resolución y no el aumento la que dicta los límites que
pueden ser observados.
 Para el M óptico los límites de resolución están en 0.2um y
para el M electrónico los límites aumentan hasta 1000 veces
 La capacidad de aumento de un M compuesto se calcula
multiplicando el aumento del objetivo por la del ocular
 El poder de resolución está en función de la longitud de onda
de la luz y de la apertura numérica propiedad de la lente que
integra el objetivo
 La mayoría de los microscopios tienen oculares de 10 a 15X
y objetivos de 10 a 100X. Con los objetivos de 100X se usa el
aceite de inmersión.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
Entre los microscopios ópticos : campo claro, contraste de
fases, Normarski contraste de interferencia diferencial (DIC) ,
campos oscuro y fluorescencia
 Microscopía electrónica: de transmisión (TEM) y de barrido
(SEM)

MICROSCOPIO OPTICO DE CAMPO CLARO Y OSCURO
En
el M de campo claro la muestra
debe ser fina para que pueda ser
atravesada por la luz
 Se deben usar métodos de tinción
ya que el campo claro no produce
contraste
 En el M de campo oscuro la única
luz que entra en el objetivo es la
dispersada por la muestra
Los organismos se ven brillantes
sobre fondo oscuro y es útil para
estudiar la motilidad de los
organismos
El contraste de fases se basa en
que las células poseen diferentes
índices de refracción y producen un
desvío de los rayos de luz que da
lugar a una imagen oscura sobre
fondo brillante
 El contraste de interferencia
diferencial (DIC) o Normarski usa
dos rayos de luz polarizada y las
imágenes aparecen como si la
célula estuviera proyectando
sombras hacia un lado
 El M de fluorescencia se usa para
muestras capaces de emitir
fluorescencia emitiendo luz dentro
del espectro visible cuando es
expuesta a la luz UV

DIC
FLUORESCENCIA
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Células epiteliales triple
coloración: núcleo (azul),
microtúbulos (verdes),
actina (rojo)
200X
1000X
MICROSCOPIO ELECTRONICO
Para estructuras internas se usa el TEM
que usa electrones en vez de rayos de luz
en cortes ultrafinos para ver ácidos
nucleicos y proteínas
 Para mejorar el contraste se tratan con
acido ósmico, lantano, uranio o plomo
 Para estructuras externas se usa el SEM
cubriendo la muestra con una capa de oro.
 El haz de electrones del SEM barre la
superficie y los electrones desviados son
proyectados en una pantalla para producir
una imagen
 Se pueden obtener rangos de
amplificación de 15X a 100000X en la
superficie de los objetos

FLUOROCROMOS
DAPI
 Naranja de acridina
 Rojo Texas
 Ioduro de Propidio
 FITC
 Autofluorescencia
 Rodamina

¿Para qué el microscopio?
¿Resolución del ojo humano?
¿Resolución del ojo humano?
Aproximadamente 1/10 milímetros
¿Cuál es el tamaño de una
Escherichia Coli?
1x3 mm
1X3 µm
1x3 nm
¿Cuál es el tamaño de una
Escherichia Coli?
1x3 mm
1X3 µm
1x3 nm
¿y de una célula animal típica?
1 µm
10µm
100µm
¿y de una célula animal típica?
1 µm
10µm
100µm
Morfología microscópica de
microorganismos.
Existen tres formas básicas:

Esféricas (cocos)

Bastoncitos o cilíndricas (bacilos)

Helicoidales (espirilos)
La morfología bacteriana se
puede observar de dos maneras
En estado vivo.
Muertas y coloreadas
Técnicas de tinción:
Los colorantes se clasifican en:

Básicos o Catiónicos. (azul de metileno,
safranina, cristal violeta )

Ácidos o aniónicos. (eosina, fucsina
ácida y rojo congo)
Clasificación de las tinciones:
Negativas.

Tinta china, Nigrosina.
Positivas:
Simple (azul de metileno)
 Diferenciales (Tinción de Gram)
 Estructurales (capsulas, esporas ,flagelos)

Tinción de Gram
1884 Cristian Gram
Es una tinción diferencial
Diferencia Gram+ de Gram -.
PASOS DE UNA TINCIÓN
 Hacer el extendido y dejar secar
Fijar la muestra con metanol o calor
por flameado
Agregar cristal violeta y esperar 1 min,
todas las células se teñirán de color
azul púrpura
 Enjuagar con agua
 Agregar lugol (I2 / IK) y esperar entre
30 seg y 3 min
 Enjuagar con agua
 Agregar acetona/ alcohol y esperar
entre 15-20seg
 Enjuagar con agua
 Tinción de contraste con safranina o
fuscina básica , esperar 1-2 min

TINCIÓN DE GRAM
Tinción de Gram
Bacterias
Bacterias de
Clostridium
perfringens
(Gram positivas)
de
Escherichia coli
(Gram negativas)
Gram + / Gram -
Otras Tinciones:
Tinción de ácido-resistencia: Detecta
bacterias acido resistentes saprófitas
(Mycobacterium tuberculosis)
(fucsina fenicada)
Tinción de esporas/ Schaeffer y
Fulton: Bacillus y Clostridium (verde de
malaquita)