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Técnica de
Contraste de Fases
EUROMEX MICROSCOPEN SPAIN, S.L.
Ctra. Barcelona, 88B Entresuelo Local 9
08302 Mataró (Barcelona)
ESPAÑA
Un poco de Historia
En el año 1935, el físico holandés Fritz Zernike desarrolló el Microscopio
de Contraste de Fase, con lo cual se le otorgó el Premio Nobel de Física
en el año 1953.
Su contribución consistió al afirmar que la imagen vista bajo un microscopio
convencional, es formada por el objetivo del microscopio, y finalmente se
observa en el ocular. Si la muestra no absorbe la luz, no habrá
esencialmente contraste en la imagen visible (será toda blanca); por
ejemplo, la mayoría de las células vivas absorben poca luz (a excepción de
las células rojas de la sangre y los cloroplastos) y por lo tanto, son difíciles
de visualizar a través de un microscopio convencional.
Por otro lado, aunque las células absorben poca luz, tienen diversos
espesores y diversos índices de refracción en sus partes, lo que
conduce a las diferencias de fase de las ondas de luz que pasan a través
de ellas. La fase de un haz de luz es inobservable a la vista (apenas se ve
la intensidad, no la fase).
Zernike calculó la manera de hacer que las diferencias de fase se
observaran en la imagen como en la intensidad, logrando así,
visualizar detalles que no eran posibles apreciar en un microscopio
convencional. Este tipo de microscopios se utiliza habitualmente para
estudiar células vivas.
Bases del Contraste de Fases
El sistema óptico del microscopio de contraste de fases difiere del microscopio
ordinario (de luz) solamente en la adición de un diafragma anular colocado
debajo de la platina para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho y una
placa de difracción montada en el objetivo.
La fase relativa de luz desviada, saldra 1/4 de longitud de onda retrasado, si es
capturada y cambiada con la introducción de un material retrasador de fase, en
aquella parte de la placa de difracción que sea cubierta por cualquiera de los dos
rayos, aumentando aún más, otro 1/4 de longitud de onda y logrando retrasar en
rayo luminoso en total 1/2 longitud de onda, con lo que se logra que este rayo
quede totalmente fuera de fase con respecto a la luz no desviada.
Cuando la diferencia se presenta es por que los índices de refracción son
diferentes y el microscopio de contraste de fase transforma estas variaciones en
brillo o intensidad. Las estructuras celulares presentan muchas irregularidades y
son objetos ópticamente no homogéneos; así, la luz que "choca" con el objeto
se presenta desviada.
Esquema del Contraste de Fases
Componentes
Por encima de la muestra
Objetivos de fases
Por debajo de la muestra
CT - Ocular
Telescópico
de centrado
Torreta de fases
Lámina de fases
Tipos de Contraste de Fases
Alineación de un Anillo de Fase
El primer paso es colocar el ocular telescópico de centrado (CT) sustituyendo
uno de los oculares de observación del microscopio.
Luego colocaremos el objetivo de fase que queremos alinear y su fase
correspondiente en la torreta giratoria o en la corredera.
Enfocaremos la imagen de los dos anillos de fases mediante el sistema de enfoque
del ocular CT.
Si los anillos se ven como en la imagen A, mediante las herramientas de centrado
desplazaremos el anillo brillante hasta que quede concéntrico al anillo oscuro
(imágenes B y C)
A
B
C
Herramientas de centraje