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Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)
Transformación Bacteriana
Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
pGLO™ & GFP
Dogma
Central de la
Biología
Molecular
ADN
ARN
Proteín
a
Característica
Conexiones
con el mundo
real
• GFP es un marcador visual
• Estudio de los procesos biológicos
(ejemplo: la síntesis de las proteínas)
• Localización y regulación de la expresión de un
gen
• Movimiento celular
• El destino celular durante el desarrollo
• Formación de los diferentes órganos
• Marcadores genéticos útiles para identificar
organismos transgénicos
Scientists use GFP as a Tracer
Proteínas Híbridas Fluorescentes
Procedimiento de
Transformación
Day 1
Day 2
Temas
Cubiertos
• Introducción
• Transformación de bacteria con el plásmido
de pGLO
• Inducción de la expresión de GFP con
arabinosa y la subsecuente purificación de
la proteína
Kit de
Transformación
de Bacteria
con plásmido
pGLO™
¿Qué es una
Transformación?
Alteracion de una
Bacteria como
resultado de la
incorporación de
ADN exógeno (que
viene de afuera de
la célula).
GFP
bacteria
Frecuentemente, el
ADN es circular y
llamado plásmido.
b-Lactamasa
plásmidos
Confiere
Resistencia
al
Antibiótico
Ampicilina.
¿Qué es un
plásmido?
Un pedazo circular
de ADN de doble
cadena, que se
replica
autónomamente.
Fue evolucionado
originalmente en
bacterias.
Puede expresar
resistencia a un
antibiótico o puede
ser modificado para
expresar una
proteína de interés.
Las diferentes caras
de un plásmido
Micrografía de transmisión de
electrones
Representación Grafica
Gel de agarosa
Plásmido
pGLO
• Beta-Lactamasa
Confiere resistencia al
antibiótico ampicilina.
• Proteína Verde
Fluorescente
(“Green Fluorescent
Protein, GFP”)
Aequorea victoria, gen
de medusa
• araC: Regulador
Regula la transcripción
de GFP
Transformación
con pGLO
Pared celular
GFP
Cromosoma
Bacteriano
(ADN)
Bacteria
Beta-Lactamasa
(resistencia a ampicilina)
Plásmidos de pGLO
ADN
Bacteriano
Célula de Bacteria
Plásmido de ADN
ADN Geonómico
Regulación de
Transcripción
• Operón de
lactosa
• Operón de
Arabinosa
• Plásmidos de
pGLO
Regulación de
Transcripción
Operón ara
Operón lac
LacI
Z
Y A
ara
C
Z
Y A
araC
Y A
B A D
ARN Polimerasa
ARN Polimerasa
Z
A D
Efector (Arabinosa)
Efector (Lactosa)
LacI
B
ara
C
B A D
Regulación de
la expresión
del gen
Operón GFP
Operón ara
ara
C
B
A D
araC
Efector (Arabinosa)
Efector (Arabinosa)
araC
B A D
araC
B A D
Gen de GFP
ARN Polimerasa
ARN Polimerasa
ara
C
Gen de GFP
ara
C
Gen de GFP
Métodos de
Transformación
• Electroporación
– Un choque eléctrico resulta en que
la célula sea permeable al plásmido
ADN
• Cloruro de Calcio y Choque Térmico
– Las células químicamente
competentes absorben el ADN
después del choque térmico
Proceso de
Transformacion
• Suspender las colonias en la Solución de
Transformación.
• Añadir el plásmido pGLO ADN.
• Incubar los tubos en hielo por 10 minutos.
• Choque térmico a 42°C por exactamente 50
segundos, y luego colocar en hielo por 2
minutos.
• Añadir el caldo nutriente LB e incubar a
temperatura ambiente.
• Esparcir 100 mL de la suspensión por la
superficie de las placas de agar.
¿Que es el
caldo
nutriente de
LB?
• Caldo Luria-Bertani (LB)
• Un medio que contiene los nutrientes para
el crecimiento bacteriano y la expresión de
los genes de interés.
– carbohidratos
– aminoácidos
– nucleótidos
– sales
– vitaminas
Medida de
Volumen en
los Goteros
Plásticas
Importancia de
cada paso de la
transformación
O
Ca++
O P O
O
CH2
1. La solución de
transformación
contiene CaCI2 .
La carga positiva
del los iones de
Ca2+ neutralizan
la carga negativa
de los fosfatos del
ADN.
Base
O
Azúcar
O
Ca++
O P O
Base
O
CH2
O
Azúcar
OH
Importancia de
cada paso de la
transformación
2. Incubación en hielo
-disminuye la
fluidez de la
membrana celular.
Pared Celular
GFP
3. Choque térmico
-incrementa la
permeabilidad de la
membrana celular.
4. La recuperación
con LB permite la
expresión de la
beta-lactamasa.
Beta-Lactamasa
(resistencia a
ampicilina)
¿Crecer?
¿Brillar?
Siga el protocolo
¿En qué placas crecerán
colonias?
¿Qué colonias brillarán?
¿Qué observó
en las placas
de agar?
Crecimiento
de colonias
que no brillan.
Crecimiento
de colonias
que sí brillan.
Ningún
Crecimiento
de Bacterias.
Crecimient
o en área
completa.