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Efecto del Óxido Nítrico Ambiental sobre el
el Metabolismo Oxidativo en Sorgo
Susana Puntarulo
Fisicoquímica-PRALIB, Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad de Buenos Aires
Características fisicoquímicas del óxido nítrico
especie paramagnética, gaseosa, pequeña y neutra
NO: KK (sg2s)2(su2s)2(pu2p)4(sg2p)2(pg2p)1
• radical libre (e- desapareado)
• pequeño tamaño
• fácil difusión
• reactivo frente a otros radicales y frente
a metales de transición
Síntesis de óxido nítrico en plantas
NO3-
membrana plasmática
Ni-NOR
NO2-
PM-NR
L-arg
NO2
-
no
enzimática
NOS-like
NO
pared celular
citosol
NR
NO3-
NO2NOS-like
L-arg
NO2L-arg
CTE
mitocondria
L-arg
NOS-like
peroxisoma
NOS-like
cloroplasto
Síntesis de óxido nítrico en plantas
enzima nitrato reductasa (NR)
NO2Km=100 μM
Km=60 μM
NO3-
citosol
NR
constitutiva
NO
inducible
(luz, nitrato)
NAD(P)H+
NAD(P)H
enzimas con actividad de NO sintasas (NOS-like)
citosol
L-arginina + O2
NOS
NAD(P)H
L-citrulina + NO
NAD(P)H+
organelas
inhibición
(análogos L-arg)
Efectos del óxido nítrico en plantas
mecanismos de acción del NO
estímulo
ABA, auxinas,
CK, GA
[NO]
etileno
[GMPc]
GMPc-PK
[ADPRc]
MAPK
procesos
mitóticos
muerte
celular
inducción
de genes
[Ca2+]cit
procesos
regulados por Ca2+
fitocromos
procesos
mediados por luz
Efectos del óxido nítrico en plantas
asociados a
procesos fisiológicos
vinculados a
situaciones de estrés
•formación de raíces
•sequía
•activación del ciclo celular
•metales pesados
•cierre de estomas
•salinidad
•inducción de la germinación
•daño mecánico
•retardo de la senescencia
•radiación UV
•homeostasis del Fe
•infección por patógenos
Fuentes exógenas de NO
• NO atmosférico: NO+NO2+N2O (260 x109
kg/año)
• NO en suelos es un producto secundario de
procesos de nitrificación y denitrificación (20%
del contenido atmosférico)
Generación de NO dependiente de NO2- en cloroplastos
cloroplastos
cloroplastos desnaturalizados
cloroplastos + DCMU
estroma
tilacoides
3380 3400 3420 3440 3460 3480
Generación de NO
(nmol min-1 mg-1 prot)
Cloroplastos
Cloroplastos + calor
Cloroplastos + DCMU
Estroma
Tilacoides
3,2±0,2
nd
1,2±0,2*
nd
2,7±0,3
Generación de NO
(nmol min-1 mg-1 prot)
Gauss
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0
0,0
0
50
100 150
NO2- (μM)
200
Efectos del NO sobre lípidos y proteínas de cloroplastos
3,5
3,0
GSNO
GSNO
GSNO
GSNO
NO (μM)
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5 mM
0,25 mM
0,1 mM
0,05 mM
0,5
0,0
0
0
5
10 15 20 25 30
Tiempo (min)
oxidación de lípidos
Intensidad (UA calle-1)
110
100
*
90
80
70
0
60
0
0,10 0,25 0,50
GSNO (mM)
POBN-RL (nmol mg-1 prot)
oxidación de proteínas
0,6
0,4
*
*
0,2
0,0
0
0
0,05 0,10 0,25 0,50
GSNO (mM)
NO en cloroplastos de hojas de soja
•Los cloroplastos son capaces de sintetizar NO
empleando tanto NO2- como L-arginina.
•La suplementación de cloroplastos con NO produjo
una disminución del daño oxidativo a lípidos y
proteínas.
Jasid S, Simontacchi M, Bartoli CG, Puntarulo S (2006) Chloroplasts as a nitric oxide cellular
source. Effect of reactive nitrogen species on chloroplastic lipids and proteins. Plant Physiol
142: 1246-1255.
Germinación de semillas de sorgo
incubación a 26ºC
oscuridad
24
h
36
12
0h
48
h
Germinación (%) (●)
100
I
II
III
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
0
12
36
24
48
Tiempo de incubación (h)
PF (mg semilla-1) (○)
solución nutritiva
Sorghum bicolor
Oxidación de DCFH
(UA min-1 g-1 PF)
250
*
200
*
*
150
100
50
0
12
24
36
48
Tiempo de incubación (h)
POBN-RL (nmol g-1 PF)
Metabolismo oxidativo de embriones en desarrollo
2,5
*
2,0
1,5
1,0
*
0,5
0,0
0
12
24
36
48
Tiempo de incubación (h)
Defensas antioxidantes en embriones en desarrollo
Tiempo
AHTioles
α-TOH
γ-TOH
-1
-1
-1
(h)
(nmol g PF) (μmol g PF) (nmol g PF) (nmol g-1 PF)
24
36
48
147±14
103±16
95±10*
1,58±0,18
1,25±0,14
0,77±0,09*
3,33±0,13
2,46±0,67
2,74±0,33
10,0±0,3
3,4±1,2*
0,75±0,16*
Detección de NO en embriones en desarrollo
aN
espectro simulado
GSNO
embriones 24 h
embriones 48 h
3400
3450
Gauss
3500
10
*
8
*
6
4
2
0
0
12
24
36
48
Tiempo de incubación (h)
MGD2-Fe2+-NO (nmol g-1 PF)
MGD2-Fe2+-NO (nmol g-1 PF)
3350
15
*
12
*
9
*
6
3
0
0
4
12
NO3- (mM)
25
Generación de NO en embriones en desarrollo
10
NO2- y NADH
8
NO3- y NADH
6
4
preincubación NaN3
2
0
control
8 10
0
2
4
6
Tiempo de reacción (min)
actividad de NR
embriones 12-48 h
NO2- (nmol h-1 mg-1 prot)
Altura de la señal (103)
generación de NO dependiente de NO2-
0,6
*
0,5
*
0,4
*
0,3
*
0,2
0,1
0
0,0
0
12
24
36
48
Tiempo de incubación (h)
Generación de NO en embriones en desarrollo
15
12
L-arginina y NADH
9
preincubación L-NAME
6
3
0
control
8 10
0
2
4
6
Tiempo de reacción (min)
1,5
actividad de NOS-like
embriones 12-48 h
Formazan (nmol
h-1 mg-1 prot)
Altura de la señal (102)
generación de NO dependiente de L-arginina
*
1,2
*
0,9
0,6
*
*
0,3
*
0
0,0
0
12
24
36
48
Tiempo de incubación (h)
Efectos del NO en embriones de sorgo en desarrollo
incubación a 26ºC
24 h en oscuridad
Sorghum bicolor
SNP
dadores de NO
DETA NONOato
Efectos del NO sobre el crecimiento de los embriones
H2O
SNP 1 mM
SNPf 1 mM
DETA NONOato 1 mM
3350
3450
3400
Gauss
3500
MGD2-Fe2+-NO
(nmol g-1 PF)
H2O
SNP 0,01 mM
SNP 0,1 mM
SNP 1 mM
SNPf 1 mM
2,5±0,4
3,1±0,4
4,6±0,6*
6,0±0,8*
2,5±0,6
PF
(mg embrión-1)
6,8±0,6
8,4±0,8
10,0±0,5*
10,8±0,6*
6,6±0,3
PS
(mg embrión-1)
0,88±0,06
1,05±0,09
1,13±0,06*
1,23±0,07*
0,85±0,06
Efectos del NO sobre el metabolismo oxidativo
100
*
80
80,0
34,5
40
28,9
20
20,6
0
0,01 0,1
SNP (mM)
1
0,25
0,20
0,15
*
0,10
0,05
0
0,00
Oxidación de proteínas
49,1
60
0
POBN-RL (nmol mg-1 prot)
(kDa)
0
0,01 0,1
SNP (mM)
1
0
MPM
Conductancia relativa (%)
Oxidación de DCFH
(UA min-1 g-1 PF)
120
0,01 0,1
SNP (mM)
1
40
30
*
20
10
0
0
0,01 0,1
SNP (mM)
1
Detección de la deposición in situ de O2-
H2O
SNP 1 mM
SNP 0,1 mM
Formación de nitrotirosinas proteicas
(kDa)
150
Intensidad (UA calle-1)
80,0
49,1
34,5
28,9
20,6
MPM
0
0,01 0,1
SNP (mM)
1
*
130
*
110
90
70
0
50
0
0,01
0,1
SNP (mM)
1
Efectos del NO sobre el metabolismo del Fe
H2O
SNP 1 mM
SNPf 1 mM
DETA NONOato 1 mM
1200
1400
1600
Gauss
1800
H2O
SNP 0,01 mM
SNP 0,1 mM
SNP 1 mM
K4[Fe(CN)6] 1 mM
2000
Fe total
(μmol g-1 PF)
DF-Fe3+ citosol
(nmol mg-1 prot)
0,36±0,06
0,36±0,06
0,39±0,04
0,37±0,08
0,36±0,06
2,5±0,2
2,8±0,3
3,1±0,2
6,0±0,4*
3,1±0,4
Efectos del NO durante el desarrollo post-germinativo
de embriones de sorgo
•Los embriones de sorgo en desarrollo fueron capaces de
incorporar NO proveniente del medio de imbibición.
•El NO resultó beneficioso para el desarrollo de los embriones
previniendo la formación de especies oxidantes, y presentando
un papel protector frente al daño oxidativo a macromoléculas.
•La exposición de los embriones in vivo a NO parece presentar
una doble función: incrementar la disponibilidad de Fe sin
cambios en los niveles de Fe total, y prevenir su toxicidad,
probablemente por formación de complejos de Fe-NO.