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MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD EN INVESTIGACIÓN TRANSLACIONAL Virginia Hernández Gea Laboratori de Recerca Translacional d’Oncologia Hepàtica BCLC group. IDIBAPS. Hospital Clínic MODELOS ANIMALES Desarrollo de tratamiento de muchas enfermedades humanas • Desarrollo tratamientos (tratamiento de DM con insulina en perros) • Validación mecanismos de acción (tratamiento de asma con antiIL5 en roedores y primates ) • Estudios de seguridad /Eficacia (toxicidad de penicilina Ginea pigs) Avances en investigación del genoma y biología molecular ELEGIR EL MODELO ADECUADO No hay modelos disponibles para todas las enfermedades Determinadas condiciones etiología-especifica no son patogénicas en animales • Virus de la Hepatits C virus no afecta roedores La respuesta a un determinado agente inductor puede cambiar entre animales y humanos CARACTERÍSTICAS DEL MODELO ANIMAL IDEAL SIMILITUD CON LA ENFERMEDAD HUMANA • Patogénesis y fenotipo similar a la enfermedad en humanos • Reflejo de interacciones celulares y moleculares (microambiente) • Similares biomarcadores de enfermedad • Predicción fiable de toxicidad y respuesta a terapias aprobadas en humanos OTRAS CONSIDERACIONES • Reproducibilidad % animales que alcanzan el estadio de interés • Especificidad alteración deseada sin otras complicaciones • Coste directo e indirecto mantenimiento colonia • Seguridad riesgo para el personal • Tamaño volumen de sangre requerido, accesos vasculares, cantidad fármaco • Ética aceptabilidad del modelo • Viabilidad del modelo experiencia en el laboratorio, mano de obra DESARROLLO HEPÁTICO La formación del hígado empieza 60-72 horas post-fertilización El hígado esta completamente desarrollado a los 5 días El desarrollo hepático es independiente de la vasculogenesis Ventajas Camadas de gran número Creación de transgénicos es fácil, rápida y barata Manipulación genética unida a fluorescencia permite visualización en tiempo real de todo el proceso de desarrollo Chu & Sadler. Hepatology 2009 HEPATITIS AGUDA POR VHC No modelos en animales pequeños que reproduzca todo el ciclo infección La inoculación virus en roedores (incluso inmunodeprimidos) no produce infección detectable Chimpancé • Permite el estudio de todos los pasos del ciclo vital de la infección Replicación/Infección/Producción virus • Modelo immunocompetente Estudio de la respuesta inmune huésped (innata & adaptativa) • Permite analizar cambios precoces en la expresión génica Obtención muestras tras infección aguda • Probar de forma directa agentes antivirales • Único modelo para el estudio y desarrollo de vacunas • Limitaciones • Éticas • Escasa disponibilidad • Coste prohibitivo Bukh J. Gastroenteroogy 2012 USO DE RATONES VENTAJAS • Genética/bioquímica y fisiológicamente similares • Habilidad para manipular su genoma • Rápida reproducción • Mínima variabilidad biológica • Disponibilidad de histología postmortem USO DE RATONES VENTAJAS • Genética/bioquímica y fisiológicamente similares • Habilidad para manipular su genoma • Rápida reproducción LIMITACIONES • Diferencias propias de la especie • Diferente talla/ ciclo vital/morfología de los órganos • Actividad de la telomerasa • Mínima variabilidad biológica • Escaso desarrollo de metástasis o en localizaciones distintas • Disponibilidad de histología postmortem • Diferencias en vías de señalización y metabolismo • Distinto microambiente y sistema inmune COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS HIPERTENSIÓN PORTAL HEMORRAGIA POR HIPERTENSIÓN PORTAL Ligadura parcial de la Vena Porta Sección rama de la Vena Ileocólica • Fácil, reproducible y de bajo coste • Desarrollo de HTP muy rápido (máx 24h) • Una semana tras la LPVP , desarrollo completo del sme HTP (circulación híperdinámica, shunts porto-sistémicos) • Caracterizado en LPVP y BDL • La severidad de la hemorragia depende del grado de hipertensión portal y del tamaño de la rama seccionada • Buen modelo para testar drogas vasoactivas en condiciones hipovolémicas Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006 COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS / FIBROSIS ENCEFALOPATIA HEPÁTICA Shunt Portocava en ratas • • • • Bypass portosistémico sin fallo hepático Cambios comportamiento Reversible con tratamiento anti-EH Buen modelo para estudio EH y desarrollo de nuevos fármacos FIBROSIS POR ALCOHOL Modelo Lieber–DeCarli • Reproduce la mayoría de los rasgos patológicos de la enfermedad hepática por alcohol • Dieta semilíquida que aporta etanol como el 36% de las calorías totales • Ad libitum como única fuete de alimento y líquido • Fibrosis pericelular y perivenular progresiva • Aparición de cirrosis en 1/3 de los animales después de una exposición tras 1-3 años. Díaz-Gómez et al. Rev Esp Enferm Dig. 2011 FIBROSIS TETRACLORURO DE CARBONO • Necrosis centro-lobulillar aguda • Respuesta reparadora inmediata • Reclutamiento de células inflamatorias • Incremento de matriz extracelular • • • • Fibrosis significativa tras 2-4 semanas Cirrosis micronodular en 12 semanas Administración ip / inhalación DEN (Diethylnitrosamine) + CCl4 reproduce la secuencia daño hepático / fibrosis / transformación maligna TIOACETAMIDA (TAA) • Fibrosis periportal • Cirrosis macronodular en 12 semanas • Administration: i.p. / agua Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006 FIBROSIS LIGADURA COLÉDOCO • Cirrosis biliar primaria. • Especialmente apropiado en ratas (no tienen vesícula biliar) • Desarrollo de fibrosis-cirrosis biliar en 4-6 s • Proliferación colangiocitos y fibrosis portal • Demuestra la importancia a de los miofibroblastos periportales Arias M et al. BMC Gastroenterology 2003 INMUNOLOGICAMENTE MEDIADA Concanavalin A • Injección iv durante 20 semanas • Fibrosis centrilobular y perisinusoidal Schistosoma mansoni • Exposición percutanea produce granulomas y fibrosis periportal MANIPULACIÓN GENÉTICA Gen de interés Pérdida de función Knock-down RNAi Ganancia de función Knock-out Transgénico Control Espacial & Temporal? Control Espacial & Temporal? No Sí No Reversible? Conventional knockout Sí No Cambio esporádico? No Knock-out condicional Inducible system Sí Virus-mediated delivery Expresión Tejido específica? No Transgénico con promotor ubicuo Sí Transgenico con promotor Tejidoespecífico Knock-in Control Espacial & Temporal? Sí Sí • Condicional (Cre-Lox) • Inducible (Tet) No Knockin Convencional FIBROSIS RATONES KNOCK OUT ATP-binding cassette (ABC) B4 (ABCB4-/-) Defecto en el transporte de fosfolípidos desde los hepatocitos al luz canalicular Desarrollo espontáneo de fibrosis LIM homeobox gene (Lhx) 2 (LHX2-/-) Ratones deficientes en LHX2 desarrollan fibrosis hepática espontánea y progresiva durante el desarrollo embrionario (día 14) semanas del nacimiento El gen de interés se reemplaza (knock out) mediante selección antibiótica (Neomicina) Inyección embrión y Reproducción FIBROSIS COMBINACIONES Hepatotoxinas: CCl4/TAA con Modificación genética tejido específica (sistema Cre LoxP) La deleción del gen Atg7 específicamente en HSC aminora el desarrollo de fibrosis tras provocación daño hepático con hepatotoxinas. PROMOTOR LOX Atg7 LOX GFAP-cre GFAP PROMOTOR Atg7F/F CRE Deleción gen interés en celulas estrelladas Homocigotos Atg7flox/flox GFAP-Cre (Knockout Atg7 específicamente en células estrelladas) Hernandez-Gea et al. Gastroenterology 2012 FIBROSIS RATONES TRANSGÉNICOS Sobreexpresión de Tgf-β1 en hepatocitos (ALBUMIN-Promoter) Sobreexpresión de PDGF-C en hepatocitos Cambios morfológicos a las 2 semanas de edad con fibrosis prominente a las 6 semanas HCC entre 6 meses-1 año. Reproduce los pasos de desarrollo de HCC que ocurren en humanos (esteatosis, fibrosis, displasia, neoangiogenesis y malignización) Doyle A et al.Transgenic Res (2012) HEPATOCARCINOMA DOBLE TRANSGÉNICO Myc/TGFα TGFa bajo el promotor metalotionina. Myc bajo el promotor albúmina 20% de los ratones transgénicos para ambos genes desarrollan HCC a los 4 meses y el 100% a los 8-10 meses. Co-expresión de Myc y TGFa induce tumores con alto grado de inestabilidad genética, aneuplodia y alta proliferación similar a los HCC de mal pronóstico Factor VM et al. J Biol Chem 1998 Sobreexpressión hepática de linfotoxinas α y β Control LTαβ LTαβ Selectivamente en hepatocitos Hepatitis crónica a los 9 meses HCC a los 12 meses Johannes Haybaeck et al. Cell 2009 TRANSGÉNICOS CONSTITUTIONALES LIMITACIONES Letalidad embrionaria / infertilidad El gen alterado puede ser vital para el desarrollo normal Variabilidad en el patrón de expresión Poco control sobre el sitio de integración y el nº copias del DNA insertado Puede que la proteína truncada todavía retenga actividad biológica No mimetiza la secuencia de eventos presentes en la tumorogenesis espontánea Mutación esta presente en todas las células alteradas y desde el principio El transgen se integra en los dos alelos del genoma del animal Tanto las células tumorales como estromales expresan el transgen Disponibilidad limitada de promotores tejido-específico HEPATOCARCINOMA TRANSGÉNICOS INDUCIBLES Raton transgénico con delección del oncogen Myc específica en hígado e inducible Proteína tTA bajo el control del promotor LAP (Liver activator promotor) capaz de unirse en hígado a celulas que expresan secuencia específica TetO Myc bajo el control de protor TetO-CMV El tratamiento con Doxicilina en estos animales previene la expressión de Myc. Discontinuación de doxiclinia a las 3 semanas de edad activa la expressión de Myc (Tet-Off) y los ratones que expresan Myc desarrollan HCC a las 12 semanas Doxi LAP TetO TetR CMV LAP VP16 TetR VP16 No expresión Myc Expresión gen interés Shachaf CM et al. Nature 2004 INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN) Firma genética generada en hepatocitos primarios de ratón basada en la expresión temporal del gen TGFβ es capaz de identificar distintos subgrupos de HCC en humanos Coulouarn C et al. Hepatology 2008 INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN) En humanos los dos subgrupos generados presentan diferencias en supervivencia, origen de células tumorales (hepatoblastos vs hepatocitos), expresión c-Met/HGF, HBV status. Coulouarn C et al. Hepatology 2008 IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS ONCOGENES Análisis de expresión para comparar anomalías genómicas (amplicones) entre ratón y humano. Los eventos recurrentes sirven como filtro para identificar los genes candidatos. Una vez identificados se evalúa su funcionalidad en cuanto actividad tumoral o metastásica p53−/− con sobreexpresión de Myc (marcage GPP) Identificación de oncogenes cIAP1 y Yap Zender L et al. Cell. 2006 XENOGRAFTS Células tumorales en cultivo Inyección subcutánea de células Inyección de células tumorales humanas o fragmentos de tumor de forma subcutánea u ortotópica en ratones inmunodeficientes Crecimiento tumoral con el soporte del estroma y vasculatura murina Formación de nódulo tumoral en 2–6 semanas tras implantación Pilar principal de los estudios preclínicos para el desarrollo in vivo de nuevos medicamentos DESARROLLO NUEVOS TRATAMIENTOS Inyección ≈ 106 células en ratón inmunodeprimido Cultivo de células tumorales Tratamiento durante 2-6 semanas Tras inyectar células tumorales, los ratones se tratan con el compuesto de interés durante 2-6 semanas tiempo durante el cual se desarrolla el tumor. Es estudio es positivo si el compuesto de interés reduce le crecimiento tumoral Sharpless & DePinho. Nature Reviews Drug Discovery 2006 XENOGRAFTS VENTAJAS • Fácil uso y bajo coste • Células tumorales representativas de tumores reales (complejidad genética) • Evaluación del volumen tumoral y crecimiento tras tratamiento • Nuevas terapias: • diferentes dosis • esquemas de tratamiento en el mismo set de células • Gran ayuda para priorizar los compuestos que pasaran a Fase I DESVENTAJAS • Inmunosupresión huésped • • SCID mice (severe combined Immunodeficience) tienen defectos en los mecanismos de reparación del DNA Nude mice ( alteración timica ): fragilidad general que limita su tolerancia y resistencia a fármacos • No sirve para evaluar tratamientos inmunomoduladores • No recapitulan completamente la heterogeneidad intratumoral ni el microambiente • Eficacia quimioterapéutica es sensible pero poco específica • Hasta 89% de fármacos que superan los estudios preclínicos nunca llegan a ser aprobados QUIMERAS / TRASPLANTE HUMAN-IN-MOUSE Células cancerígenas humanas se implantan en un tejido adyacente normal Fácil/ Rápido/ Coste efectivo Valoración interacciones tumor-estroma (quimeras) Desarrollo y validación de nuevos fármacos Heyer J et al. Nature Reviews Cancer. 2010 MODELO ANIMAL IDEAL Biología Molecular Fisiopatología Screening Identificación Biomarcadores Histopatología Determinantes de progresión metastásica Estudios Imagen in vivo Análisis genoma Perfil molecular Desarrollo Fármacos Quimioresistencia GEMM Carcinogénesis Influencia factores ambientales CONCLUSIONES • El perfecto modelo animal todavía esta por generar • En cáncer, no existe el modelo que recapitule todos los estadios del desarrollo del tumor • Diferencias interespecies obligan a seguir utilizando material humano • Entender las ventajas y limitaciones de cada modelo es necesario para maximizar la rentabilidad de los modelos disponibles