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“Implementación de una técnica de bajo costo
para la detección de mutaciones en el gen BRCA1
relacionadas con el desarrollo del cáncer de
mamas”
Dr. Alejandro Amoroso
Facultad de Ciencia
Universidad San Sebastián
2016
Incidencia
• El cáncer de mamas afecta al 10% de las mujeres
• Entre el 5-10% son atribuibles a susceptibilidad genética
• Las mujeres con mutaciones deletéreas en BRCA1, tienen un riesgo a lo
largo de su vida de entre un 37 a un 85% de desarrollar cáncer,
convirtiendo a estas mutaciones en los predictores de cáncer de mama
más reconocidos.
BRCA1 es un gen complejo
BRCA1-BARD1 heterodimer
• Coordinates a diverse range of cellular pathways such as:
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•
•
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•
DNA damage repair
Ubiquitination and transcriptional regulation to maintain genomic stability
Regulates centrosomal microtubule nucleation
Required for normal cell cycle progression from G2 to mitosis
Required for appropriate cell cycle arrests after ionizing irradiation
Involved in transcriptional regulation of P21 in response to DNA damage
Required for FANCD2 targeting to sites of DNA damage
May function as a transcriptional regulator
Inhibits lipid synthesis
Contributes to homologous recombination repair (HRR)
Component of the BRCA1-RBBP8 complex which controls cell cycle G2/M
checkpoints on DNA damage
• Acts as a transcriptional activator
BRCA1 es un gen supresor de tumores
• Participa en reparación del DNA
• Regulación del ciclo celular
• Apoptosis
Es importante detectar mutaciones en BRCA1
• La bajas tasas de supervivencia al cáncer de mama observadas en los
países poco desarrollados pueden explicarse principalmente por la
falta de programas de detección precoz y de servicios adecuados de
diagnóstico y tratamiento.
El análisis genético permite mejorar la prevención y el diagnóstico precoz
• Se han reportado mutaciones dispersas a lo largo de todos los exones de BRCA1
• Los test genéticos requiere de un análisis que cubra la región codogénica
completa
• La técnica más utilizada es la secuenciación del DNA
Secuenciación de DNA
El análisis genético permite mejorar la prevención y el diagnóstico precoz
• Las técnicas de secuenciación del DNA consumen mucho tiempo y tienen altos
costos
• Creciente aumento en la demanda por estos exámenes
• Existen grandes diferencias en la frecuencia de las distintas mutaciones
dependientes de la etnia
• Necesidad de un test rápido, seguro, de bajo costo que considere los
componentes étnicos de las poblaciones analizadas
Propuesta
• Desarrollar un método de diagnóstico, utilizando una “nueva” técnica
de análisis molecular llamada HRM (High-Resolution Melting), basada
en el análisis de las curvas de desnaturación de DNA de amplicones
específicos, generados mediante qPCR (quantitative Polimerase Chain
Reaction) a partir de muestras de DNA genómico.
PCR
HRM (High-Resolution Melting)
Objetivo
“Desarrollar un protocolo para detectar mutaciones en el gen Brca1, relacionadas con un alto
riesgo de desarrollar cáncer de mama en la población chilena, utilizando la tecnología de bajo
costo HRM-qPCR”.
• Objetivos Específicos:
• Montar el ensayo de HRM-qPCR para la detección de mutaciones en el gen BRCA1, utilizando
muestras de DNA estándar.
• Determinar las mutaciones recurrentes en el gen Brca1 en la población chilena con cáncer de
mama hereditario, mediante HRM y secuenciación de DNA.
was first available and have assays for many cancer-related genes including TP53, CDKN2A,
PIK3CA, PIK3R1, FGFR2, NF2, KIT and RAS genes. Development of assays for new genes is
straightforward.
Montar el ensayo de HRM utilizando muestras de DNA estándar
Suitable samples for HRM mutation scanning include DNA extracted from blood, cell lines or
fresh/frozen tumours. DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tumours is generally
too badly damaged for large-scale projects, but we are developing a method to increase the data
quality to a level which will allow successful analysis of targeted regions and would welcome
suitable pilot scale projects.
Genotyping of short amplicons by HRM (saHRM) is also available. Currently, saHRM genotyping is
limited to SNPs which have previously failed TaqMan design.
a
b
Figure 1a: The four duplexes formed after PCR from a heterozygous sample: two fully matched
homoduplexes, one wild type and one mutant, and two mismatched heteroduplexes, formed from
the pairing of a mutant strand with a wild-type strand.
Figure 1b: Schematic melting curves from wild type, homozygous and heterozygous samples. The
homozygote curve has a different Tm to the wild-type curve, whereas the heterozygote curve has a
different shape to the wild type.
• Determinar las mutaciones recurrentes en el gen Brca1 en la
población chilena con cáncer de mama hereditario.
Test predictor de riesgo de cáncer de mama
• Método sensible
• Rápido
• Bajo costo
• Fácil implementación