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Universidad De
Guadalajara
Centro Universitario de la Costa
Biología molecular
•Hibridación: Sondas, southern y northern blot
•Clonación
Equipo 3
Chávez Mejía Felipe
Chávez Monteagudo Salvador Iván
Piñón Garfias Miguel Enrique
Ramírez de Santiago Andrés Isaías
Hibridación
• Formación de ácido
desoxirribonucleico de
doble hélice a partir de
dos hebras simples
complementarias.
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
Sondas
• Empleadas para buscar moléculas con
secuencias
de moléculas complementarias
Deben estar marcadas para poder localizarse y se aplica en
separada por electroforesis.
dentrounademezcla
compuestos
formados de ácidos
nucleicos.
ADN nuevo con un
precursor marcado
Agregar una señal nueva al
extremo de la molécula de
ADN completa
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
Se pueden detectar en luz UV siendo
35
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marcadas con S y P
Marcada
Señal
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
Las sondas son útiles para:
• Monitorear cantidad o tamaño de una
molécula específica de ADN o ARN en una
población de muchas.
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
Hibridación por transferencia
Southern
Todo a concentraciones de temperatura
y concentración salina similares a la de la
desnaturalización
• Permite identificar el tamaño de un fragmento
específico que contiene el gen buscado.
Se toma el ADN
seccionado y separado por
la electroforesis en gel
Se sumerge en solución
alcalina para
desnaturalizar los
fragmentos de ADN
bicatenario
Se transfieren a una
membrana + a la que
se adhieren
Biología molecular del gen. Watson,
Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial
Panamericana
Se incuba el ADN unido a la membrana con una
sonda de ADN que contiene una secuencia
complementaria del gen buscado
Hibridación por transferencia Northern
• Permite identificar una molécula de ARNm
específica en una población de ARN.
Implica transferir moléculas de ARNm separadas a una membrana con carga + y
exponerlas a una sonda de ADN radiactiva seleccionada.
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
CLONACIÓN
Proceso por el que se consiguen copias
idénticas de un organismo ya desarrollado, de
forma asexual.
derivado del griego κλων, que significa "retoño“.
www.unav.es/cryf/clonacion.htm
¿Dónde se utiliza?
• La clonación molecular se utiliza en una
amplia variedad de experimentos biológicos y
las aplicaciones prácticas que van desde la
toma de huellas dactilares a producción de
proteínas a gran escala.
Transfección y Selección
• Con el fin de amplificar cualquier secuencia en
un organismo vivo, la secuencia a clonar tiene
que estar vinculada a un origen de replicación;
que es una secuencia de ADN
• -Transfección: Se introduce la secuencia
formada dentro de células.
• -Selección: Finalmente se seleccionan las
células que han sido transfectadas con éxito
con el nuevo ADN.
Mejor clonado no
puede estar!!!!!!!
Clonación del ADN
Capacidad de construir moléculas de ADN
recombinantes y mantenerlas en las células.
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
Proceso típico de clonación de ADN
• Se emplea un vector que aporta información
necesaria para propagar el ADN clonado
hacia la célula y un inserto de ADN que se
introduce dentro del vector y presenta el
ADN mencionado.
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
Elemento clave para crear moléculas de
ADN recombinante
Uso de enzimas de restricción que
cortan el ADN en secuencias
específicas
Enzimas que unen entre sí los
fragmentos de ADN seccionados
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
• Mediante creación de moléculas de ADN
recombinantes que pueden propagarse a un
huésped se puede purificar un inserto
determinado de ADN y aislarlo del resto .
• Además amplificarlo para producir grandes
cantidades.
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En una genoteca un vector común transporta
muchos insertos alternativos.
Genoteca: grandes colecciones de este tipo de
moléculas híbridas
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Clonación de ADN en vectores
plásmidos
Una vez segmentado el ADN por una enzima de restricción
necesita insertarse en un vector para su propagación.
Esto significa que el fragmento de ADN debe insertarse
en una 2ª molécula de ADN (el vector) para replicarse
en el huésped.
Hospedador más usado es E. coli
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
Vectores de ADN típicos tienen 3
características:
1. Origen de replicación que permite replicarse en forma
independiente del cromosoma hospedador.
2. Algún marcador que permite identificar fácilmente
células que contienen el vector.
3. Sitios independientes para unión de una enzima de
restricción o varias. Insertando los fragmentos de ADN
en un punto específico dentro de un vector íntegro.
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Vectores más comunes
Moléculas de ADN circular pequeñas
denominadas plásmidos.
Presentes en muchas bacterias y eucariotes
unicelulares.
En muchos casos transportan genes que
codifican resistencia a antibióticos.
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Los plásmidos naturales tienen 2 de las
características deseables de los vectores.
• Pueden propagarse en forma independiente en el
hospedador.
• Son portadores de un tipo de marcador
seleccionable.
• Otro beneficio es que a veces hay muchos
plásmidos en la célula, por lo que aumenta la
cantidad de ADN que puede aislarse.
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
• Los plásmidos se simplificaron y modificaron para que
un vector plásmido típico tenga más de 20 sitios de
restricción.
• Esto permite que haya más variedad de enzimas de
restricción para cortar el ADN.
Virus bacterianos
(bacteriófagos) se
modificaron para usar
también como vectores de
clonación.
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La inserción de un fragmento de ADN en un vector es
un proceso simple.
• Un vector plasmídico tiene un sitio de
reconocimiento exclusivo para EcoRI, enzima
de restricción que dará al plásmido formación
lineal.
Como EcoRI produce extremos 5´
protruyentes complementarios entre sí,
los extremos adhesivos se aparean y
vuelven a formar un círculo con 2
muescas.
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• La enzima ADN ligasa y ATP sella las muescas para
volver a formar un círculo unido en forma covalente.
• Un segmento específico de DNA evaluado se escinde
con una enzima de restricción para producir posibles
insertos de ADN
Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana
• El vector de ADN cortado con la misma enzima se mezcla
con estos insertos y se utiliza ADN ligasa para unir los
extremos compatibles del ADN.
• Si la cantidad de insertos supera la de plásmidos de ADN,
la mayoría de los vectores volverá a sellarse con el inserto
de ADN incorporado en su interior.
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Vectores de expresión
• Algunos vectores además del aislamiento y
purificación del fragmento específico del ADN,
conducen a la expresión de genes dentro del
inserto.
• Estos plásmidos se llaman vectores de expresión y
tienen promotores de la transcripción justo al lado
del sitio de inserción.
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• Si la región codificadora del gen (sin su promotor)
está en el sitio de inserción en la orientación
apropiada, la célula hospedadora transcribirá el gen
insertado en un ARNm y lo traducirá.
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Uso de vectores de expresión:
• Para expresar genes heterólogos o mutantes con el
fin de determinar su función.
• Producen grandes cantidades de una proteína con
el propósito de purificarlas
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El vector de DNA puede introducirse en organismo
hospedadores por transformación
• La propagación del vector con su inserto de DNA
requiere a la molécula recombinante en una célula
huésped, por un método llamado transformación,
que es el proceso por el cual un organismo
hospedador pede adquirir DNA proveniente del
medio ambiente.
• Se considera que las células tratadas con calcio son
competentes para transformarse
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La clonación permite crear genotecas
compuestas por moléculas de DNA
1. La generación de un clon especifico es un proceso
trivial si el DNA donante original es simple o
pequeño.
2. La clonación puede llevarse a cabo solo mediante
la separación de los fragmentos de DNA después
de digerir las moléculas con enzimas de
restricción.
3. Separando los fragmentos de DNA pueden
purificarse e introducirlos en un vector.
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Este proceso es mas difícil si el DNA es mas
complejo (genoma humano)
• En la separación electroforética del DNA tratado
con una enzima de restricción se obtendrá gran
cantidad de fragmentos distribuidos alrededor de
los sitios de corte.
• Siendo mas difícil clonar todos los fragmentos y
luego separar los clones individuales.
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Genoteca
• Población de vectores idénticos que tienen
un inserto de DNA diferente en cada uno.
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Para construir una genoteca …
• Se digiere el DNA evaluado con una enzima de
restricción que permite el tamaño deseado del
inserto.
• Luego el DNA cortado se mezcla con el vector
apropiado que secciono la misma enzima de
restricción en presencia de ligasa.
Proporcionando una gran colección de vectores con
diferentes insertos de DNA
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• Uso de insertos de DNA de fuentes distintas
construyen deferentes clases de genotecas.
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Genotecas genómicas
• Genotecas mas simples creadas a partir del
DNA geonómico escindido con una enzima de
restricción.
• Útil cuando se produce DNA para determinar
la secuencia de un genoma.
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• Si el objetivo es clonar un fragmento de DNA
que codifica un gen en particular la genoteca
genómica no será eficiente cando haya poco
DNA no codificante
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Para aumentar secuencias codificantes se desarrolla una
genoteca de cDNA que se construye de la siguiente
manera:
En lugar de comenzar con DNA geonómico se usa ARNm
para convertirlo es secuencias de DNA por el
procedimiento de transcripción inversa y lo lleva a cabo
la transcriptasa inversa.
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• Cuando sobre las secuencias de ARNm actúa
la transcriptasa inversa se hacen copias de
DNA bicatenario llamadas cDNA luego se
unen al vector
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