Download PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO EN MICROBIOLOGÍA
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Raúl Gil Orts MIR 2 Análisis Clínicos INDICE INTRODUCCIÓN TINCIONES CULTIVOS TÉCNICAS DIRECTAS MÉTODOS MOLECULARES MALDI-TOF TÉCNICAS FUTURAS INTRODUCCIÓN -Procesos manuales -Pruebas que se realizan directamente en la muestra y permiten detectar la presencia de microorganismos o de fragmentos de los mismos en las muestras. - Técnicas aplicadas a procesos habituales que permiten acortar de manera significativa el tiempo necesario para facilitar el resultado - Especialmente útiles cuando el agente causal crece lentamente o no crece en los medios de cultivo. - Los resultados no se ven alterados por la administración previa de antimicrobianos. - Inconveniente: no ofrece información sobre la sensibilidad a los antimicrobianos TINCIÓN -Se realizan sobre la muestra obtenida y procesada adecuadamente - Morfología microscópica y características tintoriales Tinción Aplicación Resultados Comentarios Gram Diagnóstico presuntivo, sobre todo en neumonía y meningitis bacteriana Deteccíón de leucocitos, reconocimiento de la morfología de bacterias comunes Requiere experiencia; Puede diferenciar levaduras Azul de metileno Gránulos metacromáticos de corinebacterias Morfología general Corynebacterium y seleccionada diphteriae Wright-Giemsa LBA, preparaciones de Tzanck, muestras con fondo celular complejo Morfología general Permite visualizar de las estructuras bacterias, celulares levaduras, parásitos e inclusiones virales Tinción Tinción Aplicación Resultados Comentarios Ziehl-Neelsen Kinyoun Muestras (ESP, LBA, LCR, orina, etc) para identificar BAAR y diferenciar de actinomicetales BAAR muestran un color rojo granate, sobre fondo azul, permite detectar también parásitos como Cryptosporidium y Ciclospora Las micobacterias son bacilos rectos, cortos o largos y las nocardias son bacilos arboriformes y ramificados Microscopía de campo oscuro Examen directo de lesiones con sospecha de sífilis primaria Se ven espiroquetas móviles Requiere experiencia Tinta china Examen directo de la extensión de LCR, sangre y orina para Crytococcus Cryptococcus posee una cápsula de polisacáridos que aparece como un halo sobre un fondo oscuro Tinción inversa, la cápsula no se tiñe; requiere experiencia para diferenciar leucocitos de levaduras Tinción Tinción Aplicación Resultados comentarios KOH 10% Examen directo de las extensiones de piel, pelos y uñas para ver dermatofitos Visualiza elementos fúngicos Digiere las proteínas de las muestras y facilita la visualización Blanco Calcoflúor Examen LCR, LBA y otros líquidos corporales para detectar estructuras fúngicas y algunos quistes parasitarios Las levaduras y mohos muestran una fluorescencia blanquecina suave Tinción fluorescente que se fija a la pared celular de hongos y levaduras, pero no a bacterias o células inflamatorias. Requiere M. Fluoresc. Auraminarodamina Útil para la búsqueda de BAAR en una variedad de muestras clínicas. Extensiones concentradas de sedimentos de micobacterias Tinción preferida para BAAR, por su rendimiento en el cribado de gran número de muestras Requiere M. Fluoresc. TINCIÓN GRAM neumococo TINCIÓN GRAM LCR: Neisseria meningitidis Exudado uretral: Neisseria gonorrea TINCIÓN Blanco calcoflúor Candida albicans TINCIÓN Auramina Zhiel-Neelssen TINCIÓN Tinta China Cryptococcus neoformans CULTIVOS BACTERIANOS Nivel Hemocultivos - Forma tradicional - Incubación frascos hemocultivos. (8-24 horas) - Tinción de Gram y cultivo en medios sólidos + ATB (24-48h) - Técnica rápida - Procesar directamente la sangre del frasco hemocultivo Extraer 10 ml de sangre IDENTIFICACIÓN - 3-4h ANTIBIOGRAMA – 6-12h Centrifugar 1500 rpm 5 min SEDIMENTO - LIQUIDO ASCÍTICO, L. ARTICULAR, L. PLEURAL Centrifugar 3 ml sobrenadante Repartidos 2 tubos Eppendorf 13000 rpm 1 min TÉCNICAS DIRECTAS -Técnicas diagnósticas que se aplican directamente en una muestra patológica (orina, sangre, frotis nasofaríngeos, heces, LCR) - mínima manipulación - reducen el tiempo del proceso analítico -También denominadas “point-of -care test“ -Beneficio: -Permiten administrar el tratamiento adecuado en el menor tiempo mejor evolución enfermedad -técnicas : -Inmunocromatografía -Enzimoinmunoanálisis -Inmunofluoerescencia indirecta - PCR a tiempo real TÉCNICAS DIRECTAS Test/Microorganismo Muestra Técnica S E Antígeno neumococo Orina, LCR, LPL ICT 66-70 90-100 Antígeno legionella Orina ICT 76 99 Plasmodium Sangre ICT 87-100 52-100 S. pyogenes Frotis faríngeo EIA 53-99 62-100 Antígeno VRS Frotis nasofaríngeo ICT 59-97 75-100 Antígeno rotavirus Heces ICT 75-99 95 S. aureus (MRSA) S. agalactiae Enterovirus Frotis nasal Frotis vaginal LCR PCR t.r. 86-94 94-97 97 93-95 96-100 100 VIH Sangre ICT 99-100 99-100 TÉCNICAS DIRECTAS Microorganismo Muestra Técnica Haemophilus influenzae Muestra respiratoria Líquido pleural LA Virus gripe A y B Moco nasofaríngeo Exudados nasal y faríngeo IFI, ICT, EIA Metaneumovirus Moco nasofaríngeo IFI Virus parainfluenza 1, 2, 3 Moco nasofaríngeo IFI Adenovirus Moco nasofaríngeo Exudados nasal y faríngeo IFI, ICT TÉCNICAS DIRECTAS Antígeno neumococo Antígeno legionella Antígeno VRS Plasmodium TÉCNICAS DIRECTAS S. pyogenes Entamoeba hystolitica EIA Rotavirus Toxina C. difficile MÉTODOS MOLECULARES PNA-FISH - peptide nucleic acid fluorescent in-situ hybridization - Se emplean cebadores fluorescentes que hibridan con los pares de bases de nucleótidos contenidos en el ARN ribosomal de los microorganismos. - Útil para detectar bacteriemias por S. aureus, E. coli, Enterococcus spp, Ps. Aruginosa o fungemias por Candida spp. En aproximadamente 3 horas Métodos moleculares PNA-FISH Ps. aeruginosa S. aureus MÉTODOS MOLECULARES PCR en tiempo real - Modificación de PCR convencional - Mejora la rapidez en la detección - Mejora en Sensibilidad y Especificidad - Detecta a la vez que amplifica - Sistema cerrado: evita contaminaciones y pérdida de tiempo con el empleo de geles agarosa - Sensibilidad y especificidad igual o superior al 95% - Tiempo de ejecución 1.5 horas MÉTODOS MOLECULARES -PCR a tiempo real - Test comercializados: - Detección MRSA en frotis nasales - Detección Enterococcus spp. resistentes a glucopéptidos en frotis rectales - Clostridium difficile en heces - S. agalactiae en frotis vaginal y rectal en embarazadas - Enterovirus en LCR - Cuantificación de citomegalovius, VIH o hepatitis C MÉTODOS MOLECULARES PCR t.r. Detección: - S. aureus resistente a meticilina - Clostridium difficile - Enterovirus en LCR - S. agalactiae MALDI-TOF - Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight - Se describió hace 30 años -Se diseñó para analizar biomoléculas - uso reciente para la identificación de microorganismos -Técnica: - Se emplea un emisor de rayos láser que se aplica a una mezcla del microorganismo y una matriz que absorbe la mayoría de la energía emitida - las proteínas del microorganismo quedan ionizadas y son sometidas a una aceleración en un campo eléctrico - son separadas según masa y carga hasta que llegan a un detector - el perfil de proteínas generado se compara con una base de datos y en menos de 10 min. se dispone de la identificación MALDI-TOF Ventajas: - Rapidez - más barato que sistemas habituales - puede identificar la mayoría de microorganismos habituales Uso: -para identificar bacterias y levaduras a partir de colonias - puede utilizarse en frascos de hemocultivos positivos - puede detectar proteínas concretas - proteína fijadora de penicilina PBP2a identificando así staphylcoccus resistentes a oxacilina. Técnicas futuras Multiplex PCR tiempo real Técnica Septifast de Roche. Desarrollada para identificar a partir de sangre del paciente con sospecha de bacteriemia o candidemia hasta 25 microorganismos frecuentes. Aún no comercializado Secuencición del ADN: pirosecuenciación Método rápido que se fundamenta en la detección del pirofosfato liberado durante la síntesis de ADN Permite detectar el polimorfismo de un solo nucleótido se ha empleado: - genotipado de bacerias y virus - reconocer mutaciones de resistencia a antivíricos en VIH - caracterizar bacterias resistentes a antibióticos Técnicas futuras Sistema StaphPlex Diseñado para detectar y amplificar 18 genes de forma simultánea que permiten identificar : -a nivel de especie diferentes estafilococos - identificar resistencia a antibióticos más utilizados GRACIAS