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3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE
LA CONCETRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR
¿Qué son las enzimas?
• Son proteínas que catalizan reacciones bioquímicas que se llevan a cabo en la
célula (catalizadores biológicos).
• Tienen un sitio activo donde se encuentran los grupos químicos responsables de
la reacción.
• Son altamente específicas a la reacción que catalizan (catalizadores específicos),
que catalizan un solo tipo de reacción y casi siempre actúan sobre un solo
sustrato o un grupo reducido de ellos.
• Muchas de las enzimas necesitan de cofactores para realizar su función.
• Su función depende de la integridad de la proteína.
• Dependen en su mayoría de grupos metálicos unidos al grupo activo o como
cofactores.
• Los reactivos de las reacciones catalizadas por las enzimas se denominan
sustratos.
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima depende de
varios factores:
• Actividad enzimática
• La concentración del sustrato [S].
• Concentración de la enzima
• La temperatura.
• El pH del medio, afectando la conformación de la enzima.
• La presencia de inhibidores.
• Los Activadores
Regulación de la actividad enzimática
Modificaciones en la enzima
 Unión de ligandos (sustratos y no sustratos)
• Inhibidores
• Activadores
 Regulación covalente
• Fosforilación
• Proteólisis
 Isoenzimas
Cantidad de enzima
 Síntesis
• Expresión del gen
• Síntesis en el ribosoma
 Degradación
Regulación de la actividad enzimática por unión a ligandos que no son sustratos
 Inhibidor: Sustancia que puede impedir que la enzima desarrollo su
actividad catalítica. Puede disminuir la velocidad de la reacción.
 Activador: Sustancia que al unirse a la enzima puede activar el desarrollo
de la actividad catalítica y aumentar la velocidad de la reacción.
Ecuación de Michaelis - Menten
Parámetros enzimáticos
Vmax: Se alcanza cuando todos los sitios activos están ocupados por el sustrato
(100% de los sitios activos). Cuando toda la enzima esta como [ES].
KM: Concentración de sustrato a la que V0 es la ½ de Vmax (50% de los sitios
activos ocupados). Cuanto menor es la Km, mayor es la afinidad de la enzima por
el sustrato. Es constante en cada enzima. (Constate de Michaelis-Menten)
KCAT: Número de recambio. Número de moléculas de sustrato convertidos en
producto por unidad de enzima y unidad de tiempo en condiciones saturantes del
sustrato.
Constante de especificidad (Vmax/Km o Kcat/Km): Indica cual es el mejor sustrato
(aquel que tenga la mayor constante). Indica a eficiencia catalítica de la enzima.
Representa el paso de unión de la enzima y el sustrato (cualquier factor que
afecte esta afectando la constante de paso de unión).
La enzima más eficiente es
aquella que posee el mayor
valor de KCAT/Km (Constante
de especificidad).
Unidades de los parámetros enzimáticos
Transformación de la ecuación de Michaelis-Menten
 Lineal
1/v vs 1/[S] (Dobles recíprocos o Linewever-Burk)
 Sigmoidal
v vs log S (Semi-logarítmica)
Representación Linewever-Burk o Dobles recíprocos
Forma lineal de la ecuación de Michaelis – Menten.
Los valores de Vmax y Km
pueden calcularse gráficamente
si se representan 1/v frente a los
valores 1/[S].
Gráfica de representación de Eadie-Hofsteen
Ecuación de Eadie-Hofsteen
de la velocidad de la
reacción
La representación de Vo frente a Vo/[S] se conoce como la representación de Eadie-Hofsteen.
Donde:
Vo = representa la velocidad de la reacción
Km = constante de Michaelis- Menten
[S] = concentración de sustrato
Vmax = máxicmo de la velocidad de la reacción
• Se le asigna el mismo peso a todos lo puntos para cualquier rango de concentración del
sustrato, tiene menos margen de error.
• Las variables son dependientes de la velocidad de la reacción.
• Se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuación Lineweaver-Burk por Vmax.
Inhibición de la actividad enzimática
 Inhibidores presentes en la célula: regulación metabólica.
 Agentes tóxicos o drogas: acción tóxica.
 Agentes farmacológicos: acción terapéutica.
Tipos de inhibición:
 Irreversible
 Reversible
• Competitivo
• No competitivo
• Incompetitivo
Tipos de inhibidores Reversibles
Competitiva: El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con
la unión del sustrato.
Incompetitivo: El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato
interfiriendo con la formación de producto.
Mixto: El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo
enzima sustrato, interfiriendo la unión del sustrato y la formación
del producto.
No competitivo: Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une
con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato.
Inhibición competitiva
• El inhibidor competitivo se une a la enzima libre.
• Compite con el sustrato por el sitio de unión en la enzima.
(Se une al sitio
El inhibidor competitivo actúa reduciendo la concentración de enzim
disponible para la unión del sustrato.
catalítico).
• Analogía estructural con el sustrato.
• Aumenta la Km sin afectar Vmax.
• La unión se revierte con la adición de más sustrato.
• Reduce la concentración de enzima libre disponible.
Patrones de inhibición competitiva
Km es mayor, Vmax no cambia
Tomando los inversos tenemos:
La ecuación corresponde a una línea recta: Y = mX + b. En donde: Y = 1/v y X = 1/[S].
La pendiente m = KM/Vmax; y la intercepción en el eje Y, b = 1/Vmax.
Inhibicióncompetitiva
competitiva
Inhibición
Km es mayor
Ecuación de velocidad en
presencia de un inhibidor
competitivo.
Tipos de inhibidores Reversibles
Competitiva: El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con
la unión del sustrato.
Incompetitivo: El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato
interfiriendo con la formación de producto.
Mixto: El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo
enzima sustrato, interfiriendo la unión del sustrato y la formación
del producto.
No competitivo: Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une
con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato.
Inhibición incompetitiva
•
•
•
•
El inhibidor competitivo se une al complejo enzima-sustrato (ES) .
Interfiere con la formación de producto.
El inhibidor se une a un sitio diferente al sitio catalítico donde se une el sustrato.
incompetitivo produce una distorsión estructural del
Disminuye la Km y la Vmax, pero no altera el cocienteElsitioinhibidor
Km/Vmax
. enzima.
activo inactivando a la
Produce una distorción estructural del sitio activo,
inactivando la enzima.
Patrones de inhibición incompetitiva
Disminuye Km y Vmax
Inhibición
incompetitiva
Inhibición
incompetitiva
Disminuye Km y Vmax
Ecuación de velocidad en
presencia de un inhibidor
incompetitivo.
Tipos de inhibidores Reversibles
Competitiva: El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con
la unión del sustrato.
Incompetitivo: El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato
interfiriendo con la formación de producto.
Mixto: El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo
enzima sustrato, interfiriendo la unión del sustrato y la formación
del producto.
No competitivo: Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une
con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato.
Inhibición mixta
• El inhibidor mixto puede unirse a la enzima libre o al complejo ES.
• Interfiere en la unión del sustrato y la formación del producto.
• Aumenta la Km y disminuye la Vmax.
Patrones de inhibición no competitiva
Aumenta la Km y disminuye la Vmax.
Inhibición no competitiva
• Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual afinidad a la enzima
libre o al complejo ES.
• El inhibidor se une a un sitio diferente al sitio catalítico donde se une el sustrato.
• Disminuye la Vmax, pero Km no se altera.
Patrones de inhibición no competitiva
Disminuye Vmax, Km no se altera
Inhibición no-competitiva
Inhibición
no competitiva
Disminuye Vmax, Km no se altera
Ecuación de velocidad en
presencia de un inhibidor
no competitivo.
Patrones linearizados de las curvas con inhibidor y sin inhibidor para
identificar el tipo de inhibición
Práctica
 Determinar la cantidad de sustrato en la cual la enzima alcanza su
Vmax.
 Calcular los parámetros cinéticos de la reacción catalizada de la
enzima LDH utilizando diferentes gráficos de la ecuación
linearizada de Michaelis-Menten.
 Determinar el efecto de un inhibidor (Oxamato) en la actividad de
LDH.
 Analizar el efeto del inhibidor sobre los parámetros cinéticos.
Efecto de un inhibidor